Способ диагностики обострения стрептококковой инфекции

 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике заболеваний, вызванных β-гемолитическим стрептококком группы А - ревматизма, тонзиллита, пиелонефрита и гломерулонефрита. Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа. Для этого из пальца пациента берут 0,25 - 0,30 мл крови и отделяют сыворотку. Готовят ее разведение в забуференном физиологическом растворе в соотношениях по объему 1 : 2, 1 : 4, 1 : 6, 1 : 8, 1 : 10, 1 : 12, 1 : 16, 1 : 20, 1 : 40, 1 :70 и добавляют по 0,1 мл полученных растворов в лунки иммунологического планшета, в которые предварительно внесено по 0,15 мл 0,75%-ного раствора визуализированного стрептолизина 0 в забуференном физиологическом растворе. Планшет слегка встряхивают, инкубируют 40 мин при 37°С, затем читают результаты реакции. Способ позволяет сократить время исследования до 1 - 2 ч, повысить точность способа за счет повышения чувствительности, исключить необходимость забора крови из вены больного.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)з G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕ0НЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (7 4

О

О (7с (21) 4361783/!4 (22) 17.11.87 (46) 15.08.91. Бюл. М 30 (71) Институт клинической и экспериментальной медицины СО АМН ССС (72) В.Р.Губайдулин, А.И.Аутеншлюс, Н.Л,Лукъянчикова и С,Г.Кожевникова (53) 616,07 (088.8) (56) Наставление по применению сухог препарата стрептолиэин О для определения антистрептолизина О в сыворотках боль;-ых.

Утверждено 19.09.73.. M3 СССР. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОБОСТРЕНИЯ

СТРЕПТОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике заболеваний, вызванных Р -гемолитическим стрептококком группы А — ревмагизма, тонзиллита, пиелонефрита и гломерулонефрита. Цель иэоИзобретение относится к области медицины и может найти применение в диагностике заболеваний, вызванных j3 -гемолитическим стрептококком группы А — ревматизма, тонэиллита, пиелонефрита и гломерулонефрита.

Цель изобретения — повышение точности и упрощение способа за счет использования стрептолизина О, иммобилизованного на окрашенном носителе.

Способ осуществляют следующим образом.

Из пальца пациента с помощью разового скарификатора берут 0,25 — 0,30 мл крови, которая затем выдерживается в термостате до полного свертывания, центрифугируют кровь в течение 15 мин при 1500 об/мин. Отсасывают надосадочную жидкость и готовят ее разведения в эабуференном физиологическом растворе в

5U 1670606 А1 бретения — повышение точности и ускорение способа, Для этого из пальца пациента берут 0,25 — 0,30 мл крови и отделяют сыворотку. Готовят ее разведение в эабуференном физиологическом растворе в соотношениях по объему 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1;10, 1:12, 1:16, 1:20, 1:40, 1:70 и добавляют по 0,1 мл полученных растворов в лунки иммунологического планшета. в которые предварительно внесено по 0,15 мл 0,75 ного раствора визуализированного стрептолизина О в забуференном физиологическом растворе. Планшет слегка встряхивают, инкубируют 40 мин при 37 С, затем читают результаты реакции. Способ позволяет сократить время исследования до 1 — 2 ч, повысить точность способа эа счет повышения чувствительности, исключить необходи,мость забора крови из вены больного. 1 табл. соотношениях по объему 1:2, 1:4, 1;6, 1;8, 1:10, 1;12, 1:16, 1:20, 1:40, 1:70. В каждую из

11 лунок планшета для иммунологических реакций вносят по 0,15 мл 0,757ь-ного раствора визуализированного стрептолиэина

О в забуференном физиологическом растворе. Затем в первую лунку вливают 0,1 мл забуференного физиологического раствора — эта лунка служит для контроля за возможной неспецифической агглютинацией (контрольная лунка). Во вторую лунку вносят 0,1 мл сыворотки пациента в разведении 1:2, в третью — 1:4, в четвертую — 1:6, в пятую — 1;8, в шестую — 1;10, в седьмую — 1:12, в восьмую — 1:16, в девятую — 1:20, в десятую — 1;40, в одиннадцатую 1:70. Эти лунки являются опытными, Планшет слегка встряхивают в течение 1 мин и помещают в термостат при

37 на 40 мин, затем вынимают и читают

1670606

3 результаты реакции. Агглютинация во второй лунке, куда была внесена сыворотка пациента в разведении 1:2, соответствует титру антистрептолизина О 1:2, агглютинация в третьей лунке титру 1:4 и т,д. При обследовании предлагаемым способом 30 чел. отработаны количественные критерии (в титрах и в единицах активности антистрептолизина О-АСЛО) отсутствия и наличия стрептококковой инфекции и степени активности процесса.

Для больных со стрептококковой инфекцией вне обострения характерны титры

1:2 — 1:4(65-125 ед. АСЛО), для больных с умеренной активностью процесса 1:6—

1:8(165-250 ед. АСЛО), а для больных со стрептококковой инфекцией с выраженной активностью от 1;8 и выше (250-625 ед. АСЛО), Визуалиэированный препарат получен следующим образом.

За основу для визуалиэированного препарата взяты гранулы синего декстрена. Навеску синего декстрана в количестве 300 мг растворяют в 10 мл 0,1 М калий фосфатного буфера рН 8,0, добавляют равный объем

40 -ного этанола в 0,1 M калий фосфатном буфере, рН 8,0, содержащего 50 мг бензохинона, инкубируют в течение 5 — 8 ч при комнатной температуре с перемешиванием. Берут аликвоты по 0,3 мл, центрифугируют их при 3000 об/мин в течение 15 с. При появлении осадка реакцию прекращают добавлением 3 мл 0,5 М натрий ацетатного буфера, рН 3,0. Гранулы осаждают 50 -ным этанолом, осадок промывают 507ь-ным этанолом и высушивают в термостате при 37 С.

Размер гранул не превышал 2 мкм, Гранулы декстрана растворяют в 0,1 М калий фосфатном буфере рН 8,0, содержащем стрептолизин О в концентрации 5 мг/мл (1 ч. стрептолизина О на 5 ч, гранул декстрана).

Смесь инкубируют 16 ч при комнатной температуре с перемешиванием, затем блокируют сводобные остатки бензохинона яичным альбумином в концентрации 5 мг/мл и глицином в концентрации 5 мгlмл.

Гранулы осаждают 507-ным этанолом и после промывки 50 -ным этанолом переводят в забуференный физиологический раствор. В растворе гранулы сохраняют стабильность в течение 3 - 4 недель при 4 С, При хранении к взвеси добавляют азид натрия.

Таким образом единожды приготовленный визуалиэированный стрептолизин О можно использовать в течение 1 мес.

Пример 1, Больная Т. (Э детская больница). Кровь на анализ по предлагаемому способу взята 25,09.87. Хронический тонзиллит, гноя нет, яркой картины активного процесса нет, однако иэ зева высеян стрептококк. Поэтому процесс расценивался как активный. Результат обследования по предлагаемому способу — титр 1:8.

Пример 2. Больная К. (3 детская больница). Кровь взята на анализ 23,09.87.

Хронический декомпенсированный тонэиллит, гной, температура субфибрильная. Активный процесс. Титр 1;20.

П р. и м е р 3. Больная С. (3 детская больница). Кровь взята на анализ по предлагаемому способу 08.09.87. Ревматизм И! ст. активности. Титр 1:10.

Пример 4, Больной Б. (Э детская больница). Кровь взята на анализ 29,09.87, Хронический тонэиллит, аденоиды. Выраженных проявлений активности нет. Больной лечился в течение 18 дней. Результат по предлагаемому способу — титр 1:8, Пример 5. Больной Б. (3 детская больница), Кровь взята на анализ 18,09.87.

Ревматизм О ст. (вне обострения), Титр 1:4.

Пример 6. Больная С., диагноз ревматизм !!! ст. активности, При использовании

0,75 визуализированного стрептолиэина

О агглютинация произошла в лунке с разведением сыворотки 1;10, при использовании визуализированного стрептолиэина О в концентрации 0,50 агглютинация произошла в лунке с разведением сыворотки 1:8, Таким образом, при использовании концентрации визуалиэированного стрептолизина О меньше

0,75ф, чувствительность способа падает.

При концентрации стрептолизина О,визуалиэированного с помощью декстрана—

1,00 („чувствительность способа диагностики не возрастает.

Пример 7. Больная С„ ревматизм И! ст., активности. При использовании виэуалиэированногострептолизина О в концентрации 1,00 агглютинация отмечена в лунке с разведением сыворотки 1:10, что отмечается и при использовании визуализированного стрептолизина О в концентрации 0,757.

При концентрации 1,50 (вдвое большей предлагаемой в способе) результаты агглютинации трудно учитывать из-за высокой концентрации визуализированного стрептолизина О.

Таким образом, оптимальной является концентрация визуализированного стрептолиэина 0 — 0,757,.

Пример 8. Больная С.,диагноз— ревматизм И! ст. активности, При инкубации в течение 35 — 40 мин агглютинация произошла в лунке с разведением сыворотки

1670606

1:10. При инкубации материала в течение 25 мин агглютинация не отмечается ни в одной из лунок.

При инкубации материала 1 — 2 ч агглютинация отмечена в лунке с разведением сыворотки 1;1О. При инкубации материала в течение 3 — 4 ч картина агглютинации также не меняется.

Таким образом время инкубации35-40 мин является оптимальным.

Положительный эффект от использования предлагаемого способа состоит в следующем.

Повышается доступность способа для клиник (а не только для единичных диагностических центров) в связи с исключением использования взвеси эритроцитов человека или кролика, приготовляемой в день постановки реакции.

Для определения стрептококковой инфекции по прототипу требуется не менее 0,5 мл крови пациента. Ее забираю из вены или пальца пациента, причем на практике обычно из вены, Забор крови из венц при отсутствии одноразовой иглы мож . создать угрозу инфицирования пациента, В предлагаемом способе кровь забирают только иэ пальца пациента разовым скарификатором, поэтому предлагаемый способ более безопасен..

Предлагаемый способ является менее времяемким по сравнению с прототипом.

На операции, общие для обоих способов, в прототипе требуется 4 — 28 ч, а в предлагаемом способе 1 ч 10 мин, а с учетом пассивных затрат времени на инкубацию растворов при приготовлении визуализированного стрептолизина О менее 2 ч.

Повышение точности способа подтверждается следующими примерами.

Больной А., 12 лет, 3 ДКБ, г. Новосибирск. Хронический декомпенсированный тонзиллит, обострение. Анализ от 15.05,87.

АСЛΠ— 165 ед. Предлагаемый способ — 1:8 (250 ед.).

Анализ по и рототипу (1 65 ед. АСЛО) соответствует состоянию "вне обострения" или

"умеренная активность процесса", Анализ по предлагаемому способу показал более высо20

45 кое содержание антистрептолиэина 0 (250 ед. АСЛО), что соответствует состоянию между умеренным и активным процессом.

У ребенка хронический декомпенсированный тонзиллит в стадии обострения. Предлагаемый способ диагностики точнее отразил реальное состояние больного.

Больной 3„11 лет. 3 ДКБ, г. Новосибирск. Ревматизм I ст., активная фаза, миокардит активность I — I I ст.Анализ от 24. 04.

87. АСЛО-250 ед.Предлагаемый способ 00 (313 ед.). Анализ от 24.04,87. АСЛΠ— 250 ед.

Предлагаемый способ 1:10 (313 ед.).

Анализ по прототипу дает представление об активности процесса, но в анализе по предлагаемому способу цифры выше.

Больной 3., 14 лет. 3 ДКБ. г, Новосибирск. Полиартрит вирусной этиологии, ОРЗ. Анализ от 15,05,87, АСЛΠ— 250 ед.

Предлагаемый способ — 1:2 (65 ед.).

У больного 3, нет стрептококковой инфекции (у,него полиартрит вирусной этиологии), что и отражает анализ по предлагаемому способу. Анализ по прототипу ошибочно показывает наличие стептококковой инфекции, Больной 3Ä 11 лет. 3 ДКБ. r, Новосибирск, Хронический тонэиллит после лечения, вне обострения. Анализ от 20.05.87. АСЛΠ— 65 ед. Предлагаемый способ — 1:2 (65 ед,). Анализы по обоим способам совпадают и верно отражают состояние больного, Показатели диагностики стрептококковой инфекции при использовании прототипа и предложеного способа представлены в таблице.

Формула изобретения

Способ диагностики обострения стрептококковой инфекции путем выявления антител к стрептолизину О в реакции агглютинации, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа, к сыворотке больного добавляют

0,75 стрептолиэинО, иммобилизованный на окрашенном носителе, затем термостатируют в течение 35 — 40 мин, учитывают результаты реакции и при значении титра антител 1:8 — 1:20, диагностируют обострение стрептококковой инфекции.

1670606

Группы о бследованных

Прототип АС10 (Ntm

Титр антител по предлагаемому способу М t m мин-макс мин-макс

225,0-89,0 (165-625) нет достоверности

1:12,0 -1,2 (1: 8-1: 20)

P с 0,001

1:6,4 < 0,4 (1: 6-1; 8)

P с 0,001

219,5 53,6 (65-250) нет достоверности

Больные со стрептококковой инфекцией, в процессе лечения22 чел

188,6-51,7 (65-250) Больные стрептококковой инфекцией вйе обострения — 22 чел, Нет достоверных различий между группами 1-2;

2-3, 1-3

Составитель К.Артюшинв

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор О.Кравцова

Редактор О.Спесивых

Заказ 2748 Тираж 390 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раущская наб., 4/5

Производственно-издательский комОинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина, 101

Больные со стрептококко- вой инфекцией, актйвный процесс (ревматизм I активная фаза, активность

III ст., обострение хр. тонзиллита) — 22 чел, до лечения

1:3,3 0,4 (1: 2-1: 4)

Р с 0,001

Имеют место достоверные различия мелщу

rpуппами 1-2, 2-3, 1-3.