Способ оценки иммунорегуляторной активности лимфоцитов

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики растройств иммунорегуляторных процессов в иммунной системе по оценке иммунорегуляторной активности лимфоцитов. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа. Для этого исследуемые лимфоциты делят на две части, каждую из которых культивируют в течение 24 ч на полупроницаемых мембранах, одну - в присутствии конканавалина А, а другую - без него, после чего мембраны с лимфоцитами располагают друг над другом в среде с конканавалином А и культивируют 72 ч совместно, в условиях, исключающих возможность смешивания популяций, регистрируют пролиферативную активность лимфоцитов об обоих популяциях. Способ позволяет сократить время исследования и получить больше информации об иммунорегуляторной активности лимфоцитов, что повышает точность исследования.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sl)s G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР,",,- г.пп рpp()

" .УР" Цр;

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4289279/14 (22) 19.06.87 (46) 23.07,91. Бюл. ¹ 27 (71) 2-й Московский государственный медицинский институт им. Н.И.Пирогова (72) М.А,Стенина, А.Ю,Скрипник, А.А.Зернов, А.В.Бирюков и А.Н.Чередеев (53) 616.375(088.8) (56) Стенина М.А. и др. Бюллетень эксп. биол. и медицины. 1986, ¹ 8, с, 215-218. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ИММУНОРЕГУЛЯTGPHOA АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики расстройств иммунорегуляторных процессов в иммунной системе по оценке иммунорегуляторной активности лимфоцитов. Цель

Изобретение относится к медицине, точнее к клинической иммунологии, и может быть использовано для диагностики расстройств иммунорегуляторных процессов в иммунной системе.

Цель изобретения — повышение точности способа и его упрощение.

Способ осуществляется следующим образом.

При проведении экспериментов по оценке иммунорегуляторной активности берут три сосуда для культивирования со средой культивирования. В первый сосуд помещают две полупроницаемые мембраны

А1 и А2, на которые наносят по 0,5х10 исследуемых мононуклеарных клеток, а в среду культивирования добавляют конканавалин

А таким образом, что его концентрация составляет 5 мкг/мл. Во второй сосуд помеща. Ж 1665306 А1 изобретения — повышение точности и упрощение способа. Для этого исследуемые лимфоциты делят на две части, каждую из которых культивируют в течение 24 ч íà полупроницаемых мембранах, одну — в присутствии конканавалина А, а другую — без него, после чего мембраны с лимфоцитами располагают друг над другом в среде с конканавалином А и культивируют 72 ч совместно, в условиях, исключающих возможность смешивания популяций, регистрируют пролиферативную активность лимфоцитов в обоих популяциях. Способ позволяет сократить время исследования и получить больше информации об иммунорегуляторной активности лимфоцитов, что повышает точность исследования, ют такие же две полупроницаемые мембраны В1 и В2, на которые также наносят по

0,5х10 исследуемых клеток, но в среду культивирования конканавалин А не добавляют, В третий сосуд помещают полупроницаемые мембраны С1 и С2, на которые не наносят исследуемых клеток, а в среду культивирования не добавляют конканавалин А. Все три сосуда с мембранами инкубируют при 37 С 24 ч. За это время на мембранах А1 и А2 под влиянием конканавалина А происходит индукция иммунорегуляторных клеток.

На следующем этапе эксперимента для того, чтобы определить, как иммунорегуляторные клетки, индуцированные на мембранах А1 и А2, влияют на пролиферацию лимфоцитов на мембранах В1 и В2, и наоборот, совмещают мембраны А1 и В1 одну над

1665306 декс регуляции (ИР ) уровень пролиферации на мембране 82

;с 100 у ровень пропифервции на мембране 8>

ИР1— уровень пролиферации на мембране 82 у ровень пролиферации у уровень пролиферации

ИР2ИР на мембране А1 ) (на мембране Аг

100 уровень пролиферации на мембране Аг другой, разделенные тонким слоем среды культивирования, и стимулируют пролиферацию лимфоцитов на мембране 81 вторичным добавле нием конканавалина A.

Совмещение мембран Az и С1 и добавление конканавалина А в среду культивирования обеспечивает контроль пролиферации лимфоцитов на мембране А1 в отсутствие влияния лимфоцитов, растущих на мембране 81. Совмещение мембран 82 и С2 и добавление

; в среду конканавалина А обеспечивает кон троль пролиферации лимфоцитов на мемб ране 8> в отсутствие влияния со стороны лимфоцитов, растущих на мембране А>. Все

, три сосуда с совмещенными мембранами

, инкубируют при 37 С еще 72 ч, а затем на

, каждой мембране в отдельности определяют уровень пролиферации лимфоцитов ра, диоиммунологическим методом.

10 мл крови здорового донора, взятой в раствор с этилендиаминтетрауксусной кислотой (10 мл крови на 2 мл 2,77;-ного раствора) наслаивают на раствор фиколлаверографина, имеющего плотность 1,077.

После центрифугирования при 400 G 45 мин собирают мононуклеарные клетки, сконцентрировавшиеся над слоем фиколла, трижды отмывают центрифугированием в фосфатном буфере (1500 об/мин 15 мин), ресуспендируют в среде 199, содержащей

Для характеристики степени регулиру, ющего влияния, оказываемого лимфоцитами, растущими на мембране 8>, на

Для данного донора величина ИР1 составила — 16, а L4Pz 24 .

Пример 1, Выделяли мононуклеарные клетки иэ крови больной системной красной волчанкой и разносили их на полупроницаемые мембраны. После кул ьтиви ров ан ия клеток, совмещения мембран, оценки пролиферации на каждой иэ них и вычисления индексов регуляции получили следующие результаты: уровень пролиферации на мембране А1 2500 имп/мин, Аг 500 имп/мин, 8>

1500 имп/мин, Bz 1570 имп/мин, ИР1 4,57ь, ИР2-400ф . Эти данные указывают на отсутствие выраженного супрессорного действия иммунорегуляторных клеток

20 инактивированной сыворотки человека, антибиотики, глютамин. Доводят концентрацию клеток до 10х10 в мл.

Нанесение мононуклеарных клеток на мембраны, культивирование и совмещение мембран осуществляли согласно методике, Уровень пролиферации составил: на мембране А1 1048 имп/мин, на мембране Az 839 имп/мин, на мембране 8> 537 имп/мин, на мембране 82 3820 имп/мин, на мембранах

Ci и Сг 60 имп/мин.

Таким образом, популяция иммунорегуляторных клеток, индуцированных на мембране А1, подавляла пролиферацию лимфоцитов на мембране В по сравнению с их пролиферацией в аналогичных условиях, но при отсутствии влияния со стороны иммунорегуляторных клеток (совмещение мембран 82 и C2}. Популяция лимфоцитов, пролиферирующих на мембране 81, стимулировала рост иммунорегуляторных клеток на мембране А1 по сравнению с их ростом в отсутствии влияния со стороны лимфоцитов мембраны А1 (совмещение мембран Аг и Сф

Для характеристики степени регулирующего влияния, оказываемого лимфоцитами мембраны А1 на пролиферацию лимфоцитов на мембране В;, вычисляли инпролиферацию иммунорегуляторны- клето» на мембране А>, вычисляли индекс регуляции (ИРг) мембраны А1 на пролиферацию:у:.; фоцитов мембраны Вг.

Пример 2. Выделяли мононуклеарные клетки из крови больного с вторичным иммунодефицитом, разносили на полупроницаемые мембраны. После культивирования клеток, совмещения мембран, оценки пролиферации на каждой иэ них и вычисления индексов регуляции получили следующие результаты: уровень пролиферации на мембране А 1400 имп/мин, Аг 700 импlмин, 81 100 имп/мин, 82 2100 имп/мин, NPi =

=91/, ИР2 = 1007. Таким образом, на пролиферирующих клетках мембраны 81 зарегистрировано гиперсупрессорное действие, оказываемое иммунорегуляторными клетСоставитель Г.Крюкова

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор И.Муска

Редактор В.Данко

Заказ 2389 Тираж 415 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ками. растущими на мембране А1 (ИР =- -91 %), а на иммунорегуляторных клетках мембраны А1 зарегистрировано хелперное (усиливающее) действие; сказы ваемое на них пролиферирующими клетками мембраны 81(ИРр = 100 ), Таким образом, предлагаемый способ в отличие от известного является более быстрым, экономичным, более оправданным с точки зрения врачебной этики, а также дающим больший объем научной информации о процессах взаимодействия популяции иммунокомпетентных клеток у человека, позволяющей повысить точность способа.

Нарушения таких взаимодействий приводят к возникновению различных иммунопатологических состояний. Положительный эффект изобретения заключается в разработке простого, пригодного для клиники способа, позволяющего регистрировать нарушения таких взаимодействий, контролировать эффективность иммунокоррегирующей терапии вторичных и первичных иммунодефицитов, в том числе и синдрома приобретенного иммунодефицита, проблемы диагностики и лечения которого привлекают в настоящее время внимание исследователей всего мира.

Формула изобретения

Способ оценки иммунорегуляторной активности лимфоцитов путем культивирования исследуемых лимфоцитов в присут10 ствии конканавалина А с последующим их взаимодействием с тест-системой лимфоцитов того же донора и оценкой пролиферативной активности тест-системы, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения

15 точности способа и его упрощения, культивирование исследуемых лимфоцитов и тестсистемы осуществляют одновременно на отдельных полупроницаемых мембранах в течение 24 ч, взаимодействие лимфоцитов

20 ведут путем расположения мембран друг над другом в среде, содержащей конканавалин А в течение 72 ч, и дополнительно оценивают пролиферативную активность исследуемых лимфоцитов.