Способ определения степени патогенности штаммов вируса огуречной мозаики

 

Изобретение относится к вирусологии и фитопатологии и может быть использовано для определения степени патогенности штаммов или изолятов вируса огуречной мозаики (ВОМ) с последующим использованием сильнопатогенных штаммов ВОМ при оценке селекционного материала на устойчивость растений к вирусу и слабслатогенных при вакцинации растений для их защиты от поражения сильнопатогенными штаммами ВОМ. Целью изобретения является уменьшение времени определения степени патогенности и увеличение числа выделяемых из одного природного изолята штаммов ВОМ. Способ определения степени патогенности штаммов вируса огуречной мозаики заключается в следующем. Растения перца Capsicum Angulosum var Largo comurv N каталога ВИР-К-1630 в фазе 5-7 листьев инокулируют исследуемым изолятом или штаммом ВОМ, выращивают 6-12 дней при температуре 26-18°С до образования на листьях растений локальных повреждений (некрозов). Визуально определяют морфологию полученных некрозов К патогенным штаммам относят штаммы,.вызывающие некрозы размером до 1 см с черным центром, а к слабопатогенным - штаммы, вызывающие некрозы размером более 1,5 см в виде коричневого кольца со светлым хлоротичным центром. Применение способа позволяет сократить время определения вирулентности изолятов и увеличить число выделенных из одного изолята мононекрозных линий (штаммов) ВОМ 3 табл. сл с о сл 4D -fcb vj 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4645078/13 (22) 29.12.88 (46) 30.06.91. Бюл. N 24 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты растений (72) А.Е.Цыпленков и Е.Б.Бакельман (53) 632.937.16 (088.8) (56) Tien P., Chang Х.Н. Vaccination of pepper . with cucumber mosaic virus,attenuated with

satellite RNA. Procecodlngs of the 6th, international Congress of Virology. Sendai, 1984, р. 379.

Методы определения болезней и вредителей сельскохозяйственных растений, M., 1987, с. 41 — 42. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ

ПАТОГЕННОСТИ ШТАММОВ ВИРУСА ОГУРЕЧНОЙ МОЗАИКИ (57) Изобретение относится к вирусологии и фитопатологии и может быть использовано для определения степени патогенности штаммов или изолятов вируса огуречной мозаики (BOM) с последующим использованием сильнопатогенных штаммов BOM npu оценке селекционного материала на устойчивость растений к вирусу и слабопатогенИзобретение относится к вирусологии и фитопатологии и может быть использовано для определения степени патогенности штаммов или изолятов вируса огуречной мозаики (ВОМ) с последующим использованием сильнопатогенных штаммов BOM npu оценки селекционного материала на устойчивость растений к вирусу, а слабопатогенных — при вакцинации растений для их Ы„„1659478 А1 (st)s С 12 N 7/00, А 01 N 63/00 ных при вакцинации растений для их защиты от поражения сильнопатогенными штаммами BOM. Целью изобретения является уменьшение времени определения степени патогенности и увеличение числа выделяемых из одного природного изолята штаммов

BOM. Способ определения степени патогенности штаммов вируса огуречной мозаики заключается в следующем. Растения перца Capsicum Angulosum var Largo

comu N каталога ВИР-К-1630 в фазе 5-7 листьев инокулируют исследуемым изолятом или штаммом ВОМ, выращивают 6 — 12 дней при температуре 26 — 18 С до образования на листьях растений локальных повреждений (некроэов). Визуально определяют морфологию полученных некроэов. К патогенным штаммам относят штаммы,.вызывающие некрозы размером до 1 см с черным центром, а к слабопатогенным — штаммы, вызывающие некрозы размером более 1,5 см в виде коричневого кольца со светлым хлоротичным центром. Применение способа позволяет сократить время определения вирулентности иэолятов и увеличить число выделенных иэ одного изолята мононекроэных линий (штаммов) ВОМ, 3 табл. защиты от поражения сильнопатогенными штаммами ВОМ, Целью изобретения является уменьшение времени определения степени патогенности и увеличение числа выделяемых из одного природного изолята штаммов ВОМ.

Способ определения степени патогенности штаммов BOM заключается в следующем.

Растения перца Capsicum angulosum

var. Largo comun М каталога ВИР-К-1630 в фазе 5-7 листьев инфицируют исследуемым изолятом или штаммом ВОМ, выращивают

6-12 дней при 26-18 С до образования на листьях растений локальных повреждений (некрозов), Визуально определяют морфо логию полученных некрозов, К патогенным штаммам относят штаммы, вызывающие некроэы размером 1 см с черным центром, а к слабопатлгенным — штаммы, вызывающие некрозы размером более 1,5 см в виде коричневого кольца со светлым хлоротичным центром.

Визуальный просмотр некрозов на инокулированных листьях перца К-1630 позволяет судить о патогенности природного иэолята и его однородности в зависимости от частоты встречаемости однотипных некрозов, Для получения мононекрозных изолятов ВОМ и изучения их патогенных свойств некрозы с перца вырезают и заражают ими повторно перец, табак клейкий, табак обыкновенный (может быть использован другой системный хозяин вируса). Эффективность заражения системного хозяина при использовании единичных некрозов с перца 95;4.

Способы оценки патогенности природных изолятов ВОМ базируются в основном на ответной реакции определенного набора растений-индикаторов. Характер и степень проявления симптомов болезни (мозаика, деформация листьев, задержка роста) служат основным критерием для оценки патоген ности изолятов вируса. Однако природный иэолят нередко представляет собой популяцию штаммов, отличающихся по патогенности. Поэтому для диагностики природного изолята используют растения с локальной реакций на ВОМ, а именно бобы (Vicla та Ьае), ви гну (Vigna s inensl s) и

Chenopodium gulnoa. При заражении укаэанных видов растений на инокулированных листьях развиваются через 6-12 дней локальные повреждения — некрозы, которые в дальнейшем используют для заражения хозяина с системной реакцией. Обычно для характеристики изолята и.оценки патогенности выбирают различные виды табака, на которых через 12-16 дней после заражения некрозами регистрируют симптоматику болезни. В дальнейшем для отбора штаммов с определенными характеристиками проводят повторные пассажи через хозяев с местной и системной реакцией, что занимает довольно продолжительный период времени и во многих случаях не дает положительных результатов в получении слабых штаммов BOM.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1, В лабораторных условиях изучали реакцию различных сортов перца из коллекции ВИР (N К-1515, 1615, 1630, 2033, 2407, 2453, 2454, 5605) на заражение различными природными изолятами ВОМ, Для этого рассаду перца в фазе 3-5 листьев пикируют в вазоны и выращивают в теплице при 20 — 25 С, освещенности 18 ч в сутки, В фазе 5 — 7 листьев растения инокулируют инфекционным началом изолятов вируса.

Инокулюм готовят из листьев предварительного зараженных системных хозяев вируса ВОМ, выращенных в тех же условиях, Для приготовления инокулюма листья

N.glutinosa или табака с верхних ярусов и с четкими симптомами мозаики через 14 — 16 дней после заражения мацерируют в 0,1 ном растворе гипосульфита натрия в соотношении 1:10 соответственно. Каждым изолятом заражают 5 — 6 растений перца каждого сорта.

Для заражения используют изоляты; В—

А,  — Л,  — С,  — 3, В— - 4,  — l1, характеристика которых представлена в табл,1.

Через 12 дней на инокулированных листьях перца К-1630 появляются некрозы, которые отличаются по размеру и типу проявления (черные пятна, хлоротичные пятна, концентрические кольца со светлым центром и т.д.). Эти некрозы вырезают бритвой и мацерируют на предметном стекле в капле 0,1 4-ного раствора гипосульфита натрия, гомогенат используют для заражения системного хозяина (N.glutlnosa, табак) и через 2 недели наблюдают проявление симптомов, При направленном отборе для получения стабильных по патогенности штаммов В0М проводят 4 — 8 пассажей через местного и системного хозяина, так как географические изоляты представлены популяциями штаммов.

Другие сорта перца (К-1515, 2033, 2407, 2453, 2454, 5605) и зараженные растения системных хозяев BOM (табак) при заражении изолятами ВОМ на инокулированных листьях развивают либо диффузную мозаику, либо хлоротичную пятнистость, за которыми следует системная мозаика и деформация листьев. На сорте К-1615 наблюдали четкие локальные некрозы, но на сорте перца К-1630 гамма симптомов была выражена гораздо шире. чем на сорте К1615. Таким образом сорт перца К-1630 дает на все испытанные изоляты ВОМ локальную реакцию на листьях с наиболее разнообразными симптомами, Пример 2. По аналогичной методике изучали морфологические отличия географических изолятов BOM: В-13, В-25, В-26, В-21, Т-1, Т-З, Т-4, Т-5, характеристика кото- 5 рых представлена в табл.2.

Еольшинство иэолятов на инокулированных листьях перца К-1630 вызывают локальные повреждения в виде некрозов, указанных в примере 1 и табл.3. Проводят 10 повторное заражение перца К-1630 иэолятами В-Л, В-С, T-1, Т-3. Они вызывают в основном некрозы размером до 1 см с черным некротическим центром. Используя такие некроэы для заражения системного 15 хозяина (N.glutinosa), в 85 — 90 случаев пол- учают патогенные штаммы ВОМ.

Данные по изучению патогенности изолятов BOM íà Nlcotlana glutinosa в зависимости от локальной реакции на перце 20

К-1630 приведены в табл.3.

Иэоляты В-Л и Т-1 входят сразу в 2 группы, так как являются географическими иэолятами и представляют собой популяции штаммов, отличающихся по патогенности. 25

Таким образом, используя перец К-1630 для определения вирулентности изолятов

ВОМ, возможно определить по морфологии локального некроза степень патогенности изучаемого изолята, исключая заражение 30 растения с системной реакцией, необходимое в ранее применяемых способах. Встре.чаемость слабопатогенных. штаммов значительно реже.

Пример 3. В лабораторных условиях 35 изучают эффективность выделения мононекрозных линий в зависимости от растения-хозяина с местной реакцией, С этой целью используют перец К-1630, бобы (Vlcia

fabae) и Ch.guinoa. 40

Системным хозяином вируса служат во всех случаях растения Nicotiana glutinosa.

Вырезают по 100 некрозов с каждого вида растений. При мацерации некрозов используют 0,1 -ный гипосульфит натрия. Для 45 инокуляции используют изоляты В-С и В-3.

Некрозы на хозяине с местной реакцией вырезают через 6-8 дней после инокуляции вирусом. Эффективность заражения табака клейкого с перца составляет для изолята

В-С 90-95%, для изолята В-3 95-90 ; с бобов — 60 — 65 положительных заражений, с

Ch.guinoa -15 — 20, т,е. использование перца К-1630 позволяет выделить мононекрознук) линию в 85 — 95 случаев из 100.

Пример 4. Заражение перца К-1630 проводят, когда среднесуточная температура воздуха в теплице составляет 18-20 С, При одновременном заражении перца изолятами В-А, В-Л, В-С, В-З, В-4, В-11, В-13, В-26, В-27, Т-1 локальные симптомы (некрозы) наблюдаются через 8-10 дней для иэолятов В-Л, В-С, В-11, В-13, Т-1 через 10 — 12 дней для изолятов В-А, В-3, В-4, В-26, В-27, При среднесуточной температуре воздуха

24-26 С. Для получения местной реакции на перце К-1630 для изолятов В-С, В-Л, В11, В-13, Т-1, Т-3 достаточно 6 дней, для изолятов В-А. Т-5, Т-4 8 дней. для изолятов

В-З, В-4, В-25, В-26 10-12 дней, Следовательно, минимальный период получения некрозов 6 дней, а максимальный — 12.

Таким образом, применение способа позволяет сократить время определения вирулентности изолятов и увеличить число выделяемых из одного иэолята мононекрозных линий штаммов BOM.

Формула изобретения

Способ определения степени патогенности штаммов вируса огуречной мозаики, включающий заражение растений-индикаторов природными изолятами вируса, инкубацию зараженных растений и оценку результатов по наличию некрозов на листьях растений, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью уменьшения времени определения степени патогенности и увеличении числа выделяемых из одного природного изолята штаммов ВОМ, в качестве растения-индикатора используют перец Capsicum

angulosum var Largo comun (N. каталога ВИРа К-1630), к сильнопатогенным штаммам относят штаммы, вызывающие некрозы размером до 1 см с черным центром, к слабопатогенным — штаммы, вызывающие некрозы размером более 1,5 см в виде коричневого кольца со светлым хлоротичным центром.

Таблица 1

Таблица 2

Симптоматика

Кль а

Изолят

В-13

В-25

В-26

В-27

Т-1

Т-3

Т-4

Т-5

Нитевидность листьев

Зеленая мозаика, деформация листьев

Желтая мозаика, деформация листьев

Желтая кольцевая мозаика, деформация листьев

Скручивание листьев, карликовость

Нитевидность листьев, сильная карликовость

Стрик листьев

Зеленая мозаика, де о ма ия листьев

Томат

Люцерна

Томат

Дурман

Томат

Баклажан

Таблица 3

Характер некрозов, Количест- Пато- Средне- Слабоизолят во некро- ген- пато- патозов ные генные генные

Некрозы с чернью центром до 1 см в диаметре

В-Л 30

В-С 30

Т-1 20

Т-3 20

Некрозы со светлым центром до 1 см в диаметре

В-Л 20

7-1 20

В-11 20

В-13 24

Некрозы в виде некротического коричневого кольца со светлым центром более 1,5 см в диаметре

В-3 40

В-4 20

В-25 4

Составитель Ю.Рогачев

Редактор Л.Веселовская Техред M.Mîðãëíòýë

28 2

2g

18 1

17 2

5 14

8 12

4 12

8 11

2.

3

16

Корректор М.Кучерявая

Заказ 1820 Тираж 370 Подписное

ВНЙИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101