Способ культивирования вируса висна-мэди

 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к лабораторной диагностике вируса висна-мэди овец, и может быть использовано для первичного выделения, идентификации, титрования вируса висна-мэди, накопления антигена при получении диагностических препаратов, а также сохранения антигенных и иммуногенных свойств вируса. С целью повышения выхода вирусосодержащего материала, упрощения и удешевления способа вирус культивируют в культуре клеток тестикулятов ягнят 1-15-дневного возраста , с использованием питательных растворов - 0,5%-ного гидролизата лакто- .альбумина на растворе Хенкса и среды Игла в соотношении 1:1, а заражение культуры клеток вирусосодержащей суспензией осуществляют дважды с интервалом 24-48 ч. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 5/00, 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4495069/13 (22) 13.10.88 (46) 30.06,91. Бюл. М 24 (71) Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РСФСР (72) P.Ä. Поздеева, В.В. Сочнее, П.Н. Сисягин, Н.И. Молявкин и Н.И. Гладышева (53) 576.8.094.29(088.8) (56) 1. Weinchold Е,//Vlsna-Virus-ahnllche

Partikel in der Kultur чоп Plexus choriodens2е!1е и е!и е r Z i eg е m i t Ч!s n aSymptomen//zbl.Vet.Med., Bd. 21, s. 32.

Thormar Н.//An electron microscopic

study of tissue cultures infected w!th visnavirus//Virology. 1961. vol. 141. р.463. (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА ВИСНА-МЭДИ (57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к лабораИзобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к лабораторной диагностике висна-мэди овец, и может быть использовано для первичного выделения, идентификации, титрования вируса висна-мэди, накопления антигена при получении диагностических препаратов, а также сохранения антигенных и иммуногенных свойств вируса.

Целью изобретения является повышение выхода вируссодержащего материала, упрощение и удешевление способа.

Пример 1. Для получения культуры клеток используют клинически здоровых, хорошо развитых ягнят 1-15-дневного возраста. Баранчиков кастрируют в хозяйстве открытым способом по общепринятой мето„„Я „„1659475 А1 торной диагностике вируса висна-мэди овец, и может быть использовано для первичного выделения, идентификации, титрования вируса висна-мэди, накопления антигена при получении диагностических препаратов, а также сохранения антигенных и иммуногенных свойств вируса. С целью повышения выхода вирусосодержащего материала, упрощения и удешевления способа вирус культивируют в культуре клеток тестикулятов ягнят 1 — 15-дневного возраста, с использованием питательных растворов — 0,5 -ного гидролизата лакто.альбумина на растворе Хенкса и среды Игла в соотношении 1:1, а заражение культуры клеток вирусосодержащей суспензией осуществляют дважды с интервалом 24 — 48 ч. 2 табл.дике. Стерилизацию проводят в первой половине рабочего дня. Ягненка фиксируют спинкой вниз. Кожу мошонки дезинфицируют, стерильными ножницами вскрывают мошонку, захватив анатомическим пинцетом, подтягивают один из тестикулов, перевязывают стерильной шелковой нитью семенной канатик и отрезают его. Так же получают второй тестикул.

Извлеченные тестикулы помещают в стерильный флакон, содержащий 100 — 150 мл среды Хенкса с антибиотиками (пенициллин 500 ЕД/мл, стрептомицин 500 мкг/мл) и доставляют в лабораторию.

После доставки материала тестикулы тщательно (4-5 раэ) промывают раствором

Хенкса с антибиотиками, переносят в чашку

Петри, удаляют белочную оболочку и патологически измененные участки, разрезают тестикулы вдоль, вылущивают ткань и измельчают ее острыми ножницами до размеров частиц 1-3 мм, Измельченную ткань переносят в колбу для трипсинизации, промывают (4-6 раз) раствором Хенкса с анти. биотиками для удаления обрывков ткани и эритроцитов.

Измельченную и промытую ткань заливают диспергирующей жидкостью (смесь

0,25 -ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора версена в соотношение 9:1), подогретой до 37 С, после чего в колбу опускают стерильный магнит и ставят ее на магнитную мешалку, Дезагрегацию ткани проводят дробно с интервалом 7 — 10 мин до полного истощения ткани при комнатной температуре. Для инактивации трипсина в полученную суспензию добавляют 5% сыворотки крови беэ консерванта. После каждого слива флакон с суспензией клеток помещают в холодильник. Взвесь клеток центрифугируют в течение 10 мин в рефрижераторной центрифуге при 800 — 1000 об/мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в небольшом (30 — 50 мл) объеме подогретой до 37 С питательной среды, содержащей 0,5%-ный гидрализат лактоальбумина на растворе Хенкса и среду

Игла в соотношении 1;1 с добавлением 15—

20% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков.

Полученную концентрированную клеточную суспенэию тщательно перемешивают и отбирают 0,2 мл для подсчета числа клеток s камере Горяева. Окрашивают

0,5%-ным водным раствором трипанового синего, выдерживают 5 мин и заряжают камеру Горяева.

Полученную при дезагрегации ткани концентрированную суспензию клеток разводят ростовой средой до 250 — 300 тыс. клеток в 1 мл. При трипсинизации одной пары тестикул ягнят 1-15-дневного возраста получают 110-140 млн живых клеток, Посевы культур клеток проводят в пробирки и матрасы, делают отметку верхней поверхности засеянных сосудов с указанием наименования ткани и даты посева, помещают в термастат при 37 С в горизонтальном положении. Через 18-24 ч инкубирования образуются островки клеток различной величины, Через 24-48 ч для поддержаня роста клеток проводят смену ростовой среды. Ростовую культуру помещают в термостат при 37 С. Сплошной монослой .клеток тестикулов ягнят 1 — 15-дневного возраста образуется на 3-5 сут. Жизнеспособность клеток 90-95%.

Ft

Пересев клеток осуществляют после образования сплошного монослоя. Для этого иэ матраса с выросшим монослоем клеток удаляют питательную среду, монослой промывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиками (пенициллин 100 Ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл) для освобождения от сыворотки, после чего вносят подогретую до 37 С смесь растворов версена

0,02% с трипсином 0,25 в соотношении

9:1, После смачивания монослоя половину жидкости сливают, матрасы помещают в термостат на 5 — 10 мин при 37 С. После отделения клеток от стекла во флаконы вносят питательную среду с добавлением 10-15 сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков, Сыворотку предварительно инактивируют при 56 С в течение 30 мин, Полученную суспензию клеток пересевают бесцентрифужным способом с коэффициентом пересева 1:1,5 — 1:2.

При субкультивироBàíèè используют концентрацию клеток 200 — 250 тыс,/мл. Монослой формируется через 3 — 5 сут.

Первично трипсинизированные клетки тестикулов ягнят не обнаруживают резких различий по структу;.эе монослоя и представлень. клетками зпителио- и фибробластоподобнэго типа, На окрашенных препаратах эпителиоподобные клетки имеют полигональную форму, границы клеток плотно примыкают друг к другу. Ядро клеток крупное. округлой формы с ядрышками. Количество ядрышек от 3 до 5, реже больше.Хроматин ядра имеет крупносетчатую структуру, цитоплазма — с мелкой вакуолизацией. Фибробластоподобные клетки имеют форму веретена или вытянутой пирамиды, удлиненное ядро и многочисленные ядрышки.

Митомический индекс в культурах подсчитывают по общепринятой методике, Величина митотического индекса в культуре клеток тестикулов ягнят 1 — 15-дневного возраста изменяется о 12,4 в первые дни культивирования до 25,5 на 3 — 4 сут роста, Средний митотический индекс составляет

2225%

Пример 2. Перед заражением монослойные культуры клеток просматривают макро- и микроскопически. Макроскопически среда в культуральных сосудах должна быть прозрачной, иногда с легкой опалесценцией, красновато-розового цвета; микроскопически культура должна покрывать культуральную поверхность стекла сплошным пластом с преобладанием эпителиоподобных клеенок.

Заражение культур клеток проводят следующим образом.

1859475

Таблица 1

Чувствительность культуры клеток тестикулов ягнят в зависимости от возраста

П ер вич на я культура клеток тестикулов ягнят

16-45-дневного возраста

Показатель

Первичная культур клеток тестикулов ягнят 1 — 15-дневно го возраста

70-100 ° 10

50-60

110-140 ° 10

90-95

22-25

12-13

3-5

Смешанного типа с преобладанием эпителиоподобных

10 L »<

6-7

Смешанного типа с преобладанием эпит ел оро о б ных

Титр вируса, ТЦД

Ростовую среду из сосудов сливают, монослой клеток отмывают от сыворотки, ополаскивая его трижды раствором Хенкса с антибиотиками, вносят 10 -ную суспензию вирусосодержащего материала в объеме

200 > от количества питательной среды, оставляют на 2 — 3 ч для контакта при 37 С.

После этого матрас освобождают от внесенной суспензии и заливают в него поддерживающую среду. Инкубируют в течение 24-48 ч при 37 C.

Для ускорения проявления цитопатического действия вируса, повышения титра

его накопления проводят повторное внесение в сосуд с культурой клеток вирусного материала. Для этого культуру клеток тестикулов ягненка освобождают от питательной среды, вносят 10 g,-ную суспензию вирусосодержащего материала, оставляют на 2 — 3 ч при 37 С. После этого удаляют суспензию из матрасов и вносят поддерживающую среду, Инкубируют при 37 С.

Вирус висны-мэди репродуцируется с проявлением цитопатического действия, началом которого в семенной клеточной . культуре считают образование округлых и веретенообразных одноядерных клеток, за, тем многоядерных симпластов, которые на неокрашенных препаратах выглядят как звездчатые гигантские клетки с большим количеством отростков. Характерной чертой поликариоцитов в инфицированной культуре клеток является концентрирование ядер в розетки. Наиболее характерные признаки

Выход клеток

Жизнеспособность, Е

Средний митотический индекс, Ж

Время формирования монослоя, сут.

Структура монослоя цитопатического действия при выделении вируса висны-мзди из патологического материала от больных овец (кусочки легких, 5 мозга, региональные лимфатические узлы, кровь) отмечают на 4 — 6 пассажах. При заражении вирусом висны-мэди клеточной культуры тестикулятов ягнят 1-15-дневного возраста вновь синтезированный вирус об10 наруживают на 42 ч после инокуляции. Титр вируса возрастает к 60 часу и достигает максимального значения на 120 ч после инокуляции. Титр вируса висны-мзди составляет

10 6 ТЦД О(мл.

15 Пример 3, Данные, касающиеся чувствительности культур клеток тестикулов ягнят в зависимости от возраста, приводятся в табл. 1.

Пример 4. Сравнительные данные

20 средних величин основных показателей эффективности данного и известных способов культивирования вируса висны-мэди приводятся в табл. 2.

25 Формула изобретения

Способ культивирования вируса виснамэди, включающий внесение вирусного материала в культуру клеток, выращиваемую на питательной среде, отличающийся

30 тем, что, с целью повышения выхода вирусосодержащего материала, упрощения и удешевления способа, в качестве культуры клеток используют тестикулы ягнят 1-15дневного возраста, а внесение вируса осу35 ществляют двукратно с интервалом 24-48 ч.

1659475

Таблица 2

Сравнительная эффективность предлагаемого и известных способов культивирования вируса висны-мэди

Предлагаемый способ

11оказатель

Известный способ хороидное оп-. первичная культура летение голов- клеток тестикулов ного мозга эмбриона овцы первичная культура клеток тестикулов ягнят 1-15-дневного возраста

1 10-140 10 б

70-75 10

80-87

90-95

30-50

22-25

6-8

3-5

Смешанного типа с преобладанием эпителиоподобных

4-5

Смешанного типа с преобладанием фибробластоподобных

10<

7-10

Фибробластоподобного типа

Титр вируса, ТП за f д

Характеристика цитопатического действия

Составитель И.Тареева

Редактор Л.Герасимова Техред M.Moðråíòàë Корректор M.Êó÷åðÿâàÿ

Заказ 1820 Тираж 381 Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". r. Ужгород, ул, Гагарина, 101

Выход клеток

Жизнеспособность, Средний митотический ин декс, 7

Время формирования монослоя, сут

Структура монослоя

Образование округлых и веретенообразных одноядерных клеток, а также многоядерных симпластов, которые на неокрашенных препаратах выглядят как звездчатые гигантские клетки с большим количеством отростков.

Ядра поликарциоцитов концентрируются в розетки