Штамм бактерий еsснеriснiа coli-продуцент рестриктазы @ со130 1

 

Изобретение относится к биотехнологии , к выявлению микроорганизма, способного продуцировать сайт-специфическую эндонуклеазу-рестриктазу. Рестриктаза может быть использована для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии. Культивирование продуцента Kscherichia coli ВКПМ R-4498 (UFL 130 проводят в условиях аэрации при 37°С на питательной среде, содержащей, г/л: пептон 1; дрожжевой экстракт 5; NaCl 10, рН 7,0-7,2 до достижения оптической плотности суспензии клеток 3,0-3,7 о. е. Очистку фермента проводят хромлтографическим путем. Выход фермента составляет 40000 ед. на 1 г биомассы. 1 табл. Р

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (У1)5 Г 12 N 9/14, 1/20 б г, бс"

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ б

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО .ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4636322/13 (22) 1? .01.89 (46) 07.01.91. Бюл. N 1 (71) Н;.учно — производственное обьедиHeние +epMeHT (72) С.А.Науряцкене, Д.П.Вайткявичюс.

Р.И.Кундротене, A.М.Падягимене, R.R.Róòêóñ, "..-Л,!1.Кюдулене и Э.-А.А.Янулайтис (53) 577.15(088.8) (56) %.ве К., Nakajima К., Purification of à new restrichion endonuc—

lease, Sty Т, from Escherichia cali

carrying the hsd miniplasmid, Сепе, 1985, 33, 357-361.

Изобретение относится к биотехно— логии, в частности к выявлению микроорганизма, способного продуцировать рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов

СС (А/Т) (А/Т) СС и разванную, согласно общепринятой номенклатуре, Fco130

Т,которая используется для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии.

Целью изобретения является выявление штамма-продуцента Escherichia со1i ВКПМ В-4498 (RFL-130) рекстриктазы, узнающей и расщеппяющей последовательность нуклеотидов 5... С Г

А/Т А/Т СГ...3.

„„SU„„161 60 А 1

2 (54) Г1ТАММ БАКТЕРИЙ ESCEIERICHIA СО!Л—

ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ Есо 130 (57) Изобретение относится к биотехнологии, к выявлению микроорганизма, способного продуцировать сайт-специфическую э ндо нуклеа зу-рестр икта з у.

Рестриктаза можег быть использована для исследования первичной структуры

ДНК и в генной инженерии. Культивирование продуцента Escherichia col i

RIGIM В-4498 (бц Х. 130) проводят v yc-о ловиях аэрации при 37 С па питатель— ной среде, содержащей, г/л: пептon

1; дрожжевой экстракт 5; NaC 1 10, рН 7,0 — 7,2 до достижения оптической плотности суспензии клеток 3,0-3,7 о. е. Очистку фермента проводят хроматографическим путем. Выход фермента составляет 40000 ед . на 1 r биомассы, 1 табл.

Итамм Еscherichia со11 130, продуцирует рестриктазу Есо130 T (изошизомер рекстриктазы Sty 1) с высокой продуктивностью, что способствует повышению выхода целевого фермента в 20 раз по сравнению с известным штаммом †продуцент.

Итамм Escherichia со11 RFL 130 получен из Республиканской санитарноэпидемиологической станции Литовской ССР.

Используемый штамм Escherichia co-, li RFL 130 обладает следующими характеристиками.

Морфолого-культуральные признаки.

Клетки палочковидные. В стандартных

1618760 жидких средах встречаются по одиноч— ке, в парах или коротких цепочках.

Подвижны.

На мясопептонном агаре после 24 ч инкубации в термостате при 37 С обрао зует круглые C ровными краями, гладкие, блес тящие колонии, величиной

2,0-2,5 мм в диаметре. Колоний с агаром не срастаются, беловатого цвета.

В мясопептонном бульоне образуют мутность.

Физиологические признаки. Оптимальная температура роста 37 С. Грамо отрицательные, каталазоположительные, 15 оксидазоотрицательные. Факультативный анаэроб.

Лактозу, сахарозу, глюкозу окисляет. На среде Симонса не растет. При росте Н Я не выделяет. 20

Не усваивает мочевину. Усваивает индол.

Клетки подвижные. Культура хранится в пробирках на среде МПА под слоем стерильного вазелиновога масла при 25 температуре +4 С и в лиофилизировано ном виде.

Полученная рекстриктаза Fco130 I характеризуется следующими свойствами: узнает и расщепляет последователь-30 ность нуклеотидов 5 ...С С(A/Т) (А/Т)

GG...3 в молекуле ДНК; оптимальное ! значение рН для действия рестриктазы 8,3-8, 7; для проявления активности рестриктазы требуется МН, опти2+ мальная концентрация 8 — 12 мМ.

Пример, Получение биомассы

Escherichia cnli RFI, 130.

Для получения биомассы Escherichia со1 RFI. 130 используют лабораторный 40 ферментер "Биолафит" (Франция), рНметр, термостат, круговые качалки, спектр офотометр СФ-26, лабораторную центрифугу типа ЦГИА (ФРГ), бокс ламинарный, автоклав, дистиллятор. 45

Для поддержания и культивирования штамма используют две среды. Среда для поддержания штамма 1 представляет, собой мясопептонный бульон с добавлением до 21 агара. Среда для культивирования штамма 2 содержит, г/л: пептон 1; дрожжевой экстракт 5; NaC1

1; рН 7,0 — 7,2.

Агаризованную среду 1 разливают в пробирки по 5 мп и стерилизуют при

0,8 атм в течение 40 мин„ Компоненты жидкой питательной среды 2 стерилизуют при 1,0 атм в течение ?О мин. йтамм Escherichia со1i RYI, 130 поддерживают в пробирках на спеле 1 под слоем вазелинового масла при +4 С и в лиофилизированном виде. Для ожив— ления культуру Fscherichia coli RFL

130 пересевают на чашку Петри с агаризованной питательной средой 1 и инкубируют при 37 С 18 ч. Оживленную культуру еще раз пересевают на наклонный агар со средой 1 и инкубируют при 37 С 18 ч. Эатем культуру бактериологической петлей переносят в пробирку с 5 мл стерильного мясопептонного бульона и йнкубируют в о течение 3 ч при 37 С на качалках, делающих 220-?50 o6/ìèí. По 0,1 мл полученной суспензии клеток вносят в две колбы с 0,75 л среды 2 в каждой.

Инокулят выращивают на термостати— рованных круговых качалках при 180

200 об/мин, 37 С, в течение 18 ч.

Оптическая плотность суспензии инокулята на СЭФ-26 при длине волны 540 нм составляет 6,0 о.е. Полученный инокулят засевают в лабораторный ферментер Биолафит", содержащий 10 л среды N- 2.

Культуру Escherichia col i RFI. 130 выращивают при 37 С, рН 7,0, со ско- ростью перемешивания в первый час культивирования 200 об/мин и далее до 400 об/мин, а также подачей стериального воздуха 4 л/мин в первый час .роста с постепенным увеличением до 7 л/мин на третьем часу роста .

Заданный рН во время ферментации поддерживают добавлением в среду 1 M ортофосфорной кислоты. Во.время культивирования периодически отбирают пробы и измеряют оптическую плотность суспензии клеток. Культивирование штамма проводят до поздней логарифмической фазы роста — оптическая плотность суспензии клеток составляет

3,7 о.е. (длина волны 540 нм, толщина кювет 0 5 см).

Культуральную жидкость охлаждают до 4 4оС и центрифугируют на проточной центрифуге типа ЦЕНА при 23

25,10 об/мин. Полученную биомассу хранят при -20 С. Лыход сырой биомас.сы 3,80 г/л культуральной жидкости, Рестриктазу Fco130 I выделяют из биомассы клеток E.coli КР1, 130 путем разрушения, удаления обломков клеток центрифугированием с дальнейшей хроматографической очисткой полученного бесклеточного экстракта.

16 18260

Активность рестриктазы тестируют и методом гидролиза ДНК Аага ляибда с з последующим разделением полученных е фрагментов электроАорезом в агароз— н

5 ном геле. Реакционная смесь для гидр ролиза содержит 0,01 M трис — НС1, рП

8,5, 0,01 M M8Clg, 0,1 И NaC1;0,007 М у дитиотрейтол; 100 мкг/мл альбумина; р

2 мкг ДНК в 40 мкл смеси и 1-5 мкл ферментного препарата. Реакцию прово- С дят при 37 <", 1 ч. Электрофорез проо. и водят в О,1 И натрийборатном буфере, рН 8,2, 0,002 ЭДТА в течение i npu JE напряжении 100 H. Окрашенные этидий — 5 р бромидом (1 мкг/ил) гели просматрива — т ют В y(E(свете.

За условную единицу активности при — э нимается то количество фермента, ко — Д торое в оптимальных услови» за 1 ч р полностью расщепляет 1 мкг ДНК Аага

Ц лямбда. М

Из 1 г биомассы получают 40000 единиц p(= ñòðèêòàç(I Гсо130 ф

Качество препарата рестриктазы 25 э

Есо130 Т определяют методом "рестрик- л ция — лигирование — рестрикция . То, ч"о фрагменты ДНК, полученные при обработке ДНК Аага лямбда 10-кратным л избытком рестриктазы Гсо130 I в тече— ние 16 ч,полностью ДНК-лигазой Т4, а в лигаты полностью расщепляк(тсл этой к же рестриктазой, указывает на отсутч ствие неспециАических нуклеаз и Аосфотаз в препарате рестриктазы

Fco 130 Т. 35

Опр ед ел ение последов атель ности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой

Ecn130 I и места ее расщепления.

При визуальном сравнении электроАо-. ретических картин распределения ре—

40 стриктов, полученных в результате действия исследуемого Аермента Fco130 I на ДНК Аага ляибда с рестриктоэлектрофореграммой рестриктазы Sty 1, представленной в каталоге AHpMû Био-Лабс, 45 в было обнаружено большое их сходство.

В связи с недоступностью известного препарата проверку идентичности субстратной специфичности Fcof30 I u Sty

1 проводят методом картирования. С использованием известных рестриктаз установлено, что единственная точка расщепления Есо130 I на ДНК pHR 322 находится в интервале 1360 †13 п.н. по часовой стрелке от Fco R. сайта, что хорошо согласовывается сместопо- ложением точки Sty 1 на этой ДНК (1369 п.н.). Также определяют величиы ре< триктов ЛНК Аага л»мбда," обраопавшихс» под (зоздей(ствием исследумого Аериепта, и проводят картироваие точек расщепления па этом субстате.

Таким образом, экспериментально стаповленные величины Арагментов хоо((о сов((адают с расстоянием между оследопатепьпостяин 5 ...СС(А/Т>(А/Т)

С, а также между ниии и сайтами исoJIE>soâàííbê в о((((тах реcòðèêòàç (си. аблицу). Попуче(п(ые;;анпые подтверж— ают предположение о том, что рест— икт;(эа Есо130 I узнает последова— ель»ость 5 ...СС(А/Т)(A/T)GC:.

Для определения места расщепления той последовательности используют

НК ппазииды pHR 32?. Ее расщепляют

/ естриктазой Гсо130 Т, метили 5 — кон— и с помощью Т4-палннуклеотидкина эы. еченую ДПK дополнительно обрабатыват рестриктазой СГТ 13 1 и нужный субрагмент (103 п.н) выделяют после лектроАореза в полиакриламидном reе. Для определения места расщепления роводят частичный гидролиз выделеного субАрагиента. Двухмерное раздеение получе(. ного гидролизата на ацеилцеллюлозе и гомохроматографией тонком слое ДЭЛА-целлючозы приводит

Аингерпринту, из которого выявлено, то гомологичной последовательностью участке расщепления является пента— уклеотид 5 ...СА/ТА/ТСГ. Следователь( о, рестриктаза Гсо 130 I расщепляет знаваемый участок между первым и торым основанием, образуя Арагменты

5 выступающими липкими концами ...С С А/Т А/Т ГС...3

Результаты исследований даны в аблице.

Предлагаемый штамм позволяет полуить высокоочищенный препарат рестриказы Есо130 I и значительно повысить

ыход целевого ферл(ента — в 20 раз о сравнению с известным (40000 ед/г сырой биомассы рестриктазы Fco130 I по сравнению с 2000 ед/г рестриктазы

Sty 1) . Полученный при использовании штамма Fscherichi cali RFL 730 Аерментный препарат отличается высоким качеством и успе(чно используется в работах по генной инженерии.

Формула изобретения

Нтамм бактерий Fscherichia coli

BKI В-4498 — продуцент рестриктазы

ЕС0130

1618760

30 1 + Воо81 1 Воо!30 + Sea 1 о78

P . Э

P Э

П р н н е ч а н н е. P - расчетные аелнчнны Фрагментos, Э - энслернменталыю рстанолленеюе велнчнаы фрагнентоа, (-) — фрагменты s геле отортстютвт.

Составитель И.Привалова

Редактор Н.Гунько Техред N.Äèäûê Корректор М.немчик

Заказ 23 Тираж )/ Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35., Рауаская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101! 19329

2 7743

3 6223

4, 4254

5 3472

6 2690

7 1882

8 1489

9 925

10 421

1t 74 !

73

420

19329

7743

4254

2ÇRt

1882

1489

115!

698

421

74!

420

19329

4254

3472

3399

3383

2824

18 14

1489

421

74

-1 9500

4ЯО

28 20

18 20

420

12188

7743

714!

6223

3472

34 72

1882

1489

421

74.

: 1200

420

19329

7743

6223.

3472

2823

1882

1489

1431

421

2В20.

930