Способ получения рестриктазы с @ i

 

Изобретение относится к биотехнологии, к способу получения фермента, специфически расщепляющего ДНК. Рестриктаза может быть использовано для исследования метилирования ДНК и в генетической инженерии. Целью изобретения является упрощение процесса очистки и повышение выхода целевого продукта. Культивирование продуцента CAULOBACTER FUSIFORMIS ВКПМ В-2705 (ВС-25) проводят на питательной среде, содержащей г/л: пептон 2,0

дрожжевой экстракт 1,0

MGSO<SB POS="POST">4</SB> <SP POS="POST">.</SP> 7H<SB POS="POST">2</SB>O 0,2 до оптической плотности OD<SB POS="POST">540</SB>, равной 1,9-2,1 о.е. Для выделения фермента клетки разрушают ультразвуком и очистку фермента из полученного бесклеточного экстракта проводят путем хроматографии на колонке фосфоцеллюлозы и системе колонок ДЭАЭ-сефацел-гепарин-сефароза с элюцией градиентом натрия хлористого 0,1-2 М при хроматографии на фосфоцеллюлозе и 0,3-1 М на гепарин-сефарозе, которая после введения образца отсоединяется от колонки ДЭАЭ-сефацел.

союз советсних

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (51)5 С 12 N 9/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

Н А ВТОРСКОМУ СИИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4358265/31-13 (22) 04.01.88 (46) 28.02.90. Бюл. N 8 (71) Институт ботаники АН ЛитССР (72) А.Ю. Лебенка (53) 663.18(088.8) (56) Lacks S.À., purification and

properties of the complementary endonucleasei Dpu I and Dpu II.Ih: Methods

in engymology (eds.Ь. Grosman К. Moldave) . N.Y., London, Toronto, Sydney, San Francisco, 1980, v. 65, part.. 1. р. 138-146.

Янулайтис А.А., Марцинкявичене J1,Þ., Пятрушите М.П., Специфическая эндонуклеаза из Caulobacter fusiformis, расщепляющая только метилированную

ДНК. ДАН СССР, 1982, т. 262, и 1, с. 241-244.

1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ

CfuI (57) Изобретение относится к биотехнологии, к способу получения фермента, Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам выаления высокоочищенных рестриктаз, которые находят широкое применение в экспериментах по изучению структуры и Функ.ции ДНК и в генетической инженерии.

Цель изобретения - упрощение процвсса очистки и повышение выхода целевого продукта .

Способ заключается в том, что для получения биомассы культивирование

Caulobac ter fus if ormis ВКПМ В-2705

2 специфически расщепляющего ДНК. Рестриктаза может быть использована для исследования метилирования ДНК и в генетической инженерии. Целью изобретения является упрощение процесса очистки и повышение выхода целевого продукта. Культивирование продуцента

Caulobacter fusiformis ВКПМ В-2705 (ВС-25) проводят на питательной среде содержащей, г/л: пептон 2,0; дрожжевой э кстра кт 1, 0; Mg SO+ 7Н 0 О, 2, до оптической плотности OD равной

1,9-2,1 о.е. Для выделейия фермента клетки разрушают ультразвуком и очистку фермента из полученного бесклеточного экстракта проводят путем хроматографии на колонке Фосфоцеллюлозы и системе колонок ДЭАЭ-сефацелгепарин-сефарозы с элюцией градиентом натрия хлористого 0,1-1 8 при хроматографии на Фосфоцеллюлозе и

0,3-1 М на гепарин-сефарозе, которая после введения образца отсоединяется от колонки ДЭАЭ-сефацел. (ВС-25) проводят на питательной среде, содержащей, г/л: пептон 2-2,2; дрожжевой экстракт 1-1,2; MgSO< -7Н О

0,2-0,22 (рН 6,8-7,0); очистку фермента проводят в 0.01 М калийфосфатном буфере, рН 7,4-7,5, содержащем 0,005 М

2-меркаптоэтанола, 0,001 М трилона В, на колонке фосфоцеллюлозы и системе Ф колонок ДЭАЭ-сефацел-гепарин-сефарозы с элюцией градиентом хлористого натрия 0,1-1,0 М при хроматографии на фосфоцеллюлозе и 0,3-1,0 М на гепаринсефарозе, кс;оая после введения об1546485 разца отсоединяется от колонки ДЗАЭсефацел.

Используемый штамм Caulobacter fusiformis ВС-25 получен из музея куль5 тур Института биохимии и физиологии ! микроорганизмов АН СССР и хранится в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов ВНИИГенетика под коллекционным номером ВКПИ В-2705.10

Caulobacter fusiformis ВС-25 обладает морфологическими, культуральными и физиологическими признаками, харак- терными для всего рода Caulobacter: грамотрицательные, аэробы, низкомеэофильные хемогетеротрофы. В культуре Caulobacter fusiformis BC-25 присутствуют клетки трех морфологически различных типов: жгутиковые, стебельковые и предделящиеся. Продолжительность клеточного цикла не зависит от условий питания. Оптимальная температура роста 30 С. Культура хранится в. пробирках, содержащих 503 питательной среды, на которой проводилось культи- 25 вирование, и 503 глицерина при -20 С в течение 2 лет.

Отличительным признаком предлагаемого способа получения рестриктазы

CfuI является использование на первой 30 стадии очистки фосфоцеллюлозы с элюцией градиентом натрия хлористого

0,1-1,0 И, что обеспечивает отделение СКАХ от основной массы белков, нуклеиновых кислот, рестриктазы

CfuII, ДНК-метилтрансфераз.

Другим существенным признаком является использование для очистки рестриктазы системы колонок ДЭАЭ-сефа-4 цел-гепарин-сефарозы с нанесением образца при концентрации натрия хлористого 0,08-0,1 И, что обеспечивает сорбцию неспецифических ДНК-нуклеаз и фосфатазы на ДЭАЗ- сефа целе, à рест 45 риктаэы CfuI на гепарин-сефарозе, с которой фермент элюируется градиентом натрия хлористого 0,3-1,0 М.

Полученная рестриктаза CfuI характеризуется следующими свойствами.

Узнает и специфически расщепляет только метилированные последователь-. ности 5 Cm À4TC (место расщепления указано стрелкой).

Оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5-7,8.

Оптимальная концентрация NaC1

0-50 мм.

Для проявления активности рестриктазы требуется Ng оптимальная концентрация 10-15 мм.

Пример . Получение рестриктазы CfuI из Caulobacter fusiformis

ВС-25.

Последовательность операций.следующая.

Получение биомассы:- поддерживание продуцента; выращивание посевного материала; культивирование штамма .

Выделение и очистка рестриктазы: разрушение клеток; хроматография на фосфоцеллюлозе; хроматография на колонках ДЭАЗ-сефацел-гепарин-сефарозы.

Для культивирования штамма и получения биомассы Caulobac ter fus if ormis ВС-25 используют, следующую аппаратуру: качалку S-25 "New Brunswick", спектрофотометр СФ-26, бокс ламинарный, центрифугу "Beckman Т2-21".

Штамм Caulobacter fusiformis BC-25 поддерживают в пробирках на питательной среде, содержащей, г/л пептон

,0-2,2; дрожжевой экстракт 1,0-1.,2;

NgSOg 7Н О 0,2-0,22 и 504 глицерина при -20 С. Для оживления культуру пересевают в чашки Петри, содержащие среду следующего состава, г/л: пептон

2-2,2, дрожжевой экстракт 1,0-1,2, Ng SOg- 7Н 0 О, 2-0, 22; агар 15-20, рН

6,8-7,0, и инкубируют в течение 4 сут при 28-30 С. Культуру, Caulobacter Гаsi.formis BC-25 пересевают в колбы Зр-

) ленмейера с 200-250 мл питательной среды, содержащей, гlл: пептон 2,02,2; дрожжевой экстракт 1,0-1,2; MgSO

«7Н О 0,2-0,22 при рН 6,8-7,0. Клетки выращивают в термостатированной качалке при 250 об/мин, 28-30 С в течение 4 сут до оптической плотности

<се

ОТ! go, равной 1,9-2,1 опт. ед.

Затем клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием. о

Полученную биомассу хранят при -20 С.

Выход сырой биомассы составляет 1,72,2 г/л питательной среды.

Для выделения и очистки рестриктазы используют следующую аппаратуру: ультразвуковой деэинтегратор УЗДН-21, центрифугу "Вес1апап Х2-21", холодильный шкаф. "Mini Cold Lab", хроматографические колонки, термостат, аппарат для электрофореза, источник питания УИП-1, ультрафиолетовый осветитель.

ДНК pBR322 выделена по известной методике.

Формула и зобретения

Спссоб получения рестриктазы CfUI предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма„Саы1оbacter fusiformis ВКПИ В-2705 на питательной среде, содержащей пептон, дрожжевой экстракт, воду и сульфат магния, с последующим разрушением клеток ультразвуком и очисткой Фермента путем хроматографии, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса очистки и повышения выхода целевого продукта, хроматографию ведут на колонке фосфоцеллюлозы с элюцией градиентом хлористого натрия от 0,1 до 1,0 М и затем на системе колонок ДЭАЭ-сефацел-гепарин-сефарозы с нанесением образца при концентрации

5 !5464

При разрушении клеток и хроматографии используют буферный раствор

А: 0,01 М калий-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,005 М 2-меркаптоэтанола, 0,001 M трилона B.

Активность рестриктазы тестируют методом гидролиза ДНК рВК322 с последующим разделением полученных фрагментов эле.ктрофорезом агарозным гелем: 0 реакционная смесь для гидролиза содержит 0,01 M трис-НСI буфер, рН 7,5; содержащих 0,01 M MgClg, 0,001 М дитиотрейтола, 2 мкг pBR322 и 1-5 мкл фермента в 40 мкл смеси. Реакцию про- 15 водят при 37 С в течение 1 ч.

Электрофорез проводят в 0,1 М натрий-боратном буфере, рН 8,2, 0,002 м

ЭДТА в течение 1 ч при напряжении

100 В. Окрашенные этидий бромидом 20 (1 мкг/мл) гели просматривают в Уфсвете.

За условную единицу активности принимается то количество фермента, которое при 37 С в течение.1 ч дает 25 специфическое фрагментирование субстрата, не изменяющееся при добавлении больших количеств рестриктазы.

Все операции по выделению и очисто ке фермента проводят при 4 С.

Разрушение клеток. 30 г биомассы, полученной при культивировании Caulobacter fusiformis ВС-25, суспендируют в 60 мл буфера А, содержащего 0,1 М

NaC1 обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе мощностью 300 Вт в течение 10 мин и центрифугируют при

20000 об/мин на центрифуге БекманЖ-21, ротор ЖА"20.

Хроматография на Фосфоцеллюлозе. 40

Полученный бесклеточный экстракт со скоростью 30 мл/ч наносят на колонку (2,5х15 см) с фосфоцеллюлозой, уравновешенной буфером А, содержащим

0,1 М ИаС1. Колонку промывают 60 мл 45 этого же буфера и Фермент элюируют градиентом NaCI от О,! до 1 M. Фракции, содержащие рестриктазную активность, элюируемые при 0,54-0,56 М

КаС1, объединяют. 50

Хроматография на ДЭАЭ-сефацелгепарин-свфарозе. Ферментный препарат, полученный на предыдущей стадии, разводят буфером А до концентрации

NaC1 0,1 M и со скоростью 70 мл/ч наносят на систему колонок, состоящую из колонки ДЭАЗ-сефацел (1,5х х8 см), соединенной последовательно с колонкой гепарин-сефарозы (1,5х

6 х8 см) . После нанесения образца колонки промывают 50 мл буфера А. Колонку с ДЭАЭ-сефацелем отсоединяют.

Через колонку гепарин-сефарозы пропускают 20 мл буфера А, содержащего

0,3 M NaCI, и фермент элюируют градиентом 0,3-1 М фракции, содержащие рестриктазвую активность, элюируемые при 0,53-0,55 M NaCI, объединяют и концентрируют против 0,01 М калийфосфатного буфера, рН 7,4, 0,1 М NaCI, О, 001 M дитиотрейтол, 0,001 М ЭДТА, 50, глицерина (по объему) и хранят при -20 С-. Из 1 г биомассы получают

1000 единиц рестриктазы.

Предлагаемый способ обеспечивает получение высокоочищенного фермента,,соответствующего требованиям, предъявляемым к коммерческим препаратам рес" три кта з.

Преимуществом изобретения чо сравнению с известным является его. быстро- та и .высокий выход фермента. Это достигается исключением всех стадий диализа и осаждения белка сульфатом аммония, а также использованием системы колонок ДЭАЭ-сефацел-гепаринсефароза, которая позволяет получить очистку фермента на обоих сорбентах в одной стадии с максимальной скоростью и осуществить очистку рестриктазы CfuI за два дня . Продолжительность очистки фермента по известному способу составляет не менее 6 дней. Сокращение до минимума числа операций и продолжительности выделения фермента позволяет повысить выход фермента от

50-60 до !000 ед/г биомассы Caulobacter fusif ormis ВС-25.

1546485 в хлористого натрия от 0,08 до 0,1 М енте хлористого натрия от 0,3 до . и элвции с гепарин-сефарозы в гради- 1,0 И.

Составитель И. Привалова

Корректор О. Ципле

Редактор H. Киштулинец Техред А.Кравчук

Подписное

Тираж 477

Заказ 56

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35,, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,101