Способ получения производного авермектина
Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. Штамм STREPTOMYCES AVERMITILIS NC1B 12121 культивируют в питательной среде в присутствии карбоновой кислоты R<SP POS="POST">2</SP>CO<SB POS="POST">2</SB>H или ее натриевой соли, или ее метилового эфира, где R<SP POS="POST">2</SP> - альфа-разветвленный C<SB POS="POST">3</SB>-C<SB POS="POST">8</SB>-алкил, при условии, что не изопропиловый или вторично-бутиловый, алкенил, алкинил, алкоксиалкил или алкилтиоалкиловая группа, или C<SB POS="POST">5</SB>-C<SB POS="POST">8</SB>-циклоалкилалкиловая группа, в которой алкиловая группа представляет альфа-разветвленную алкильную группу C<SB POS="POST">2</SB>-C<SB POS="POST">5</SB>, или C<SB POS="POST">3</SB>-C<SB POS="POST">8</SB>-циклоалкил, или циклоалкиниловая группа C<SB POS="POST">5</SB>-C<SB POS="POST">8</SB>, при этом любой из них может замещаться метиленом или одной или более алкиловой группой C<SB POS="POST">1</SB>-C<SB POS="POST">4</SB>, или галоатомами, или тиенилгруппа, в условиях аэрации и перемешивания. После ферментации выделяют целевой продукт, где R<SP POS="POST">1</SP>-OH и отсутствует двойная связь в положении 22-23, или есть двойная связь и отсутствует R<SP POS="POST">1</SP>, и при необходимости последнее соединение восстанавливают до получения целевого продукта, где R<SP POS="POST">1</SP>-H и отсутствует двойная связь, R<SP POS="POST">3</SP>-H или CH<SB POS="POST">3</SB>,R<SP POS="POST">4</SP>-4<SP POS="POST">1</SP> (альфа-Z-олеандрозил)-альфа-Z-олеандрозилоксигруппа. Полученные соединения обладают противопаразитарной активностью широкого спектра действия. 5 з.п.ф.
СОЮЗ СОВЕТС ИХ соцИАлистичесних
РЕСПУБЛИН
ГОСУДАРСТВЕН1"1ЫЙ НОМИТЕТ
r1O ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬГГИЯМ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I1 Г
1 но-бутиловый, алкеню, алкж.гл, алкоксиалккп ипи BJIKBJITHOBJIKH. группа, или С -С 8-виклоалкипалкило— вая группа в которой алкиповая группа представляет альфа-разветвленную алк - льную x pynny С -С >, или С. -С циклоалкил„.-пги циклоалкиниловая группа С -Св „при этом любой из них может замещатъся метиленом илн ор,..îé или более алкиловой группой С -С, или галоатомами, или тиенилгруппа, в условиях аэрации и перемешивапия.
После ферментаиии выделяют иелевой продукт, где Р1 — ОН и отсутствует двойная связь в положении 22-23, или есть двойная связь и отсутствует P-, и при необходимости послецнее соецинение восставнавливают до получения целевого продукта, где Р, — Н и отсутствует двойная связь, Р. 3 — Н или
СН, Р < — 4 -(альфа-2 -олеандрозил)альфа-2-олеандрозилоксигруппа. Полученные соединения облацают противопаразитарной активностью широкого спектра действия ° 5 з.п.ф.
Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности производству антибиотиков.
Для осуществления способа исполь- зуют штамм Streptomyces avermitilis
NC1В 12121, который характеризуется следующими свойствами.
Культурально-морфологические признаки.
Спиральные цепи спор на среде 1 SP4.
1 (21) 4027887/30-13 (22) 25,07.86 (31 ) 852 8999 i 8520069, ;862 0063;
:8610862 (32) 27. 07.85; 09. 08.85; 24.04. 86; . 02.05.86 (33) GB (46) 23. 04. 90. Бюл. К 15 (71) Пфайзер Корпорейшн (РА) (72) Стив Пол Гибсон, Келвин Скотт
Холдом, Александр Кроссан Гоуди и Джон Десмонд Бу Лок (СВ} (53) 615.779.93 (088.8), (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНОГО
АВЕР1П КТИНА .(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков.
Штамм Streptomyces avermitilis NCl В
12121 культивируют в питательной греде в присутствии карбоновой кислоты
R Отсутствие четкой пигментации субстрата мицелия на среде 1 SP.4. Отсутствие способного диффундировать пигмента на среде 2 SP 5. Образование меланина на SP 6: пелтон-дрожжи-железный агар. Биохимические свойства. Ферментивная активность . )560059 20 Восстановление нитрата Образование H Гидролиз гиппурата Продукты деградации: Гуанин Моч евина + Аллантоинн + Температура выращивания . 45 С Рост в присутствии: 7%-ного хлористого натрия + 0,1 %-ного фенола О, 0001%-ного теллурита калия + Рост на единичном источнике азота (0,1 мас./об,%)) L""Öèñòåèí + ? - Валин L BHHJIa JIaHHH L-Гистидин Ь-Гидрок сипролин Нитрат калия Рост на единичном источнике углерода (1 мас./об.%); 25 1 -Арабиноза + Сахароза + I D-Кс илоза + мезо-Инозит + Манн ит + Р-Фруктоза + Ь-Рамноз а + Раффиноза + D-Лактоэа + Салицин D-Мелибиоза + Ацетат натрия (О 1 мас./об.%) + Пропиннатнатрия (0,1 мас./об,%) Пируват натрия (0,1 мас,/об.%) + (ISP — среды согласно международному проекту по стрептомицину (ISP)). Пример 1, Получение 25-цнк- 45 лопентил-авермектин А2. Суспенэию культуры на скошенном arape S.avermitilis NC18 12121 инокулируют в 600 мл среды, содержащей лактозу (12,0 r), барду (8,0 r) и дрожжевой экстракт (3,0 г), в трехо литровой колбе, и инкубируют при 28 С в течение 3 дней. Этот инокулюм используют для инокулирования 16 л среды, содержащей растворимый крахмал (640 г), сульфат аммония (32 г), вто1 ричный кислый (bocrhax калия (16 r), хлористый натрий (16 г), сульфат маг- ния 7Н10 (16 г), карбонат кальция (32 .г), растворимый дрожжевой экстракт (6,4 г), сульфат железа (ТХ) х «7Н О (0,016 r), сульфат цинка 7 Н<О, (0,016 г) и хлорид марганца 4Н О (О, 01 6 г), в двадцатилитровом Ьерментере. @ерментируемую массу инкубируют при 28 С при перемешивании со скоростью. 250.об.мин и подают воздух со скоростью 15 л/мин. Натриевую соль циклопентакарбоновой кислоты (1,6 г) добавляют через 24 ч, и снова через 28 и 72 ч инкубирования, а ферментацию продолжают 120 ч. После этого времени мйцелий удаляют фильтрованием и- экстрагируют смесью ацетон:1н. соляная кислота (100:1, 3«7 л). Полученный экстракт концентрируют до приблизительно 2 л при пониженном давлении и экстрагируют метиленхлоридом (2«5 л) . Метиленхлоридный экстракт концентрируют досуха до получения неочищенного продукта в виде подвижного масла, кото рое ра ство ряют в диэ тило в ом эфире и вводят в колонку с силикагелем (1 кг) . Колонку элюируют диэтиловым эфиром, собирая фракции по 100 мл. Фракции 20-40 объединяют, и растворитель выпаривают, получая практически очищенный материал. Продукт растворяют в смеси метанола и воды (4:1) и хроматографируют íà 018 11icro-Bondapack колонке (50 мм 50 см) в высоко1 эффективном жидкостном хроматог рафе, используя тот же растворитель со скоростью потока 100 мл/мин. фракции 3550,. содержащие целевой продукт, объединяют и повторно хроматографируют на CIS Zorbax ODS колонке (21 мм « «15 см), элюируя смесью метанола и воды (4:1) со скоростью потока 9 мл/мин. Соответствующие фракции объединяют и растворитель выпаривают до получения соединения формул В (I ) ОН где R — ОН, двойной связи нет; à — 1 циклопентнл; R « — СН, R — 4- (яльфа5 15600 2-олеандросил) -альфа-Z-олеандросилокси1 в виде белого порошка с т .пл, 150,510 151 С. Строение продукта подтвержде но данным масс-спектрометрии и ЯМР 1 С, Масс-спектрометрия с бомбардиров15 кой быстрыми атомами проведена на масс-сцектрометре VG модель 7070Е с использованием матрицы образца триэтиленгликоля с твердым хлористым натрием, (N+Na) наблюдается при в1/е 939 (теоретически 939) . Масс-спект рометрий электронного удара проводят на масс-спектрометре VG Модель 7070F, Значение m/е для основных фрагментов следующие: 335, 317, 275, 251, 205, 25 181, 179, 145, 127, 113, l l l, 96 и 87. Данные ЯИР С получены на спект1Э рометре Брукер Модель М-250 для образца концентрации 20 мг/м в дейтерохлороформе. Химические сдвиги в м.д. по отношению к тетраметилсилану: 14ю! е 15вЗч 17э8t 18ъ5, 19191 20вЗь 24 6 25 9; 26 2; 293; 344 (2С), (2С) 78 в3; 79ь 5; 80ю 7 (2C); 81 ° 8 ° 94,9;98,7; 99,8; 117,7; 118,5; 119,8; 125, 0; 135,8; 136,3; 137,8; 160,1 173,8. Пример 2. Суспензию культуры на скошенном агаре S. avermitilis АТСС 31271 инокулируют в 50 мл среды, содержащей лактозу (1,0 г), барду (0,75 г) и дрожжевой экстракт 45 (0,25 г), в колбе объемом 350 мл и о инкубируют при 28 С в течение 3 дней. Этот ииокулюм (4 мл) используют пля инкубирования каждой из 50 колб, содержащих кукурузный крахмал (2,0 г), соевую муку (0,35 г) и дрожжевой экстракт (0,25 r), объемом 350 мл, котоо рые инкубируют при 28 С. Через 24 ч в каждую колбу добавляют натриевую соль циклопентакарбоновой кислоты (5 мг) и инкубирование продолжают в течение следующих 5 дней. После этого содержимое колб извлекают и мицелий выделяют центрибугированием. Полученный мицелий экстрагцру. т смесью ацетон: 1 н. соляна я к ислота (100:1), и ацетоновый экстракт концентрируют досуха. Экстракт анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и показывают, что он содержит продукт, идентичный продукту примера 1. П р и и е р 3. Получают инокулюм по примеру l и используют его для инокулирования 50 мл среды как в примере 1, заключенной в колбу емкостью 350 мл. После инкубнрования в течение 24 ч добавляют 2-амино-циклопентилуксусную кислоту (цнклопентилгsIHIIHH) (5 Mr) и ферментацию продолжают еще 5 дней. Полученный продукт вь|целяют, экстрагируя мицелий ацетоном и метиленхлоридом. Экстракт анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, данные которой указывают на то, что продукт содержит соединение, идентичное продукту примера 1. Пример 4. Воспроизводят условия приме ра 3, за исключением того, что в качестве субстрата используют циклопентилметанол с аналогичными результатами. Пример 5. Воспроизводят условия примера. 3, за исключением того, что в качестве субстрата используют сложный метиловый эфир циклопентакарбоновой кислоты с аналогичными результатами. Пример 6. Воспроизводят условия примера 3, за исключением того, что в качестве субстрата используют циклопентанкарбоновую кислоту, растворенную в метаноле, с аналогичными результатами, Пример 7 ° Poëó÷åíèå 25-(тиен-3-ил) -авермек тин. Суспензию культуры на скошенном агаре S,avermitilis NCIB 12121 инокулируют в 600 мл среды, содержащей лактозу (12,0 г), барду (8,0 r) и дрожжевой экстракт (3,0 r), в трехлитровой колбе и инкубируют при 28 С в течение 3 дней. Этот инокулюм используют для инокулировання 16 л среды, содержащей растворимый крахмал (640 r), сульфат аммония (32 r), вторичный кислый фосфат калия (16 г), натрийхлорид (1 б г), сульфат магния 7Н О (1б г), карбонат кальция (32 r), растворимый дрожжевой экстракт (6,4 г), сульфат железа (II) 7Е1 0 (0,016 г), 1560059 7 сульфат цинка 7Н О (0,016 r) и хлорид марганца 4Н О (0,016 r), находящейся в двадцатилитровом ферментере. Ферментируемую массу инкубируют при о 28 С при перемешивании со скоростью 250 об/мин и подают воздух со скоростью 15 л/мин. Спустя .24 ч добавляют натриевую соль тиофен-3-карбоновой: кислоты (1,6 r), такое добавление по- 10 вторяют через 48 и 72 ч, а ферментацню продолжают в течение 120 ч. Далее мииелий удаляют фильтрованием и экстрагируют.смесью ацетон:lн. соляная кислота (1 00:1,Зх7 л). Полученный экстракт концентрируют до приблизительно 2 л при пониженном. давлении и экстрагируют метиленхлоридом (2 " 5 л) . Метиленхлоридный экстракт концентрируют досуха до получения неочи- 0 енного продукта в виде подвижного масла, которое растворяют в диэтиловом эфире и вводят в колонну с силиагелем (1 кг) . Эту колонну элюируют иэтиловым эфиром, собирая фракции 25 по 200 мл..Фракции 32-45 объединяют и растворитель выпаривают до получения частично очищенного материала. Полученный продукт растворяют в смеси метанола и воды (3:1) и хромато- 30 графируют на колонне С18 Micro Bondapack (50 мм 50 см) в высокоэффективном жидкостном хроматографе, используя тот же растворитель со скоростью потока 100 мл/мин, Фракции 27-36, со- 3 держащие целевой продукт, объединяют, и повторно хроматографируют Hà С18 Zorbax 0DS колонне (21 ммх25 см), элюируя смесью метанола и воды (3:1) со скоростью потока 9 мл/мин. Соот- 40 ветствующие фракции объединяют и растворитель выпаривают до получения соединения формулы (1), где R > — ОН, двойной связи нет,,Rg - тиенил-3-ил, R — СИ, à P. — 4 -(альфа-Е-олеанд- 45 щ К д ;I 3 3 росип) -альфа-К-олеондросилокси (2) в о виде белого порошка с т.пл. 167 С, Строение продукта подтверждено данными масс-спектрометрии следуюшим образом. Масс "спектрометрию с бомбардировкой быстрыми электронами проводят на масс-спектрометре VG модель 7070Р, используя матрицу образиа триэтиленгликоля с твердьм найтрийхлоридом. (М+Иа) наблюдается при ш/е-953 (теор. 953). Масс-спектрометрию электронного удара проводят на масс-спектрометре VG модель 7070F. Значение m/е для основных фрагментов следующие: 349, 331, 275, 265, 257, 247, 237, 219, 195,145, 127, 113, 95 и 87. Пример 8. Вегетативную клеточную суспензию. S.avermitilis NCIB 12121, хранившуюся при -60 С в 10Х объем/объем водном (2 мл) глицерине, инокулируют в 50 мл среды, содержащей лактозу (1,0 r), барду (0,75 r) и дрожжевой экстракт (О, 25 r) находящуюся в конической колбе объемом 300 мл, и инкубируют прн 28 С и течение 24 ч при встряхивании. Затем инокулюм добавляют к 600 мл указанной среды, содержащейся в трехлитровой колбе, и полученную смесь инкубируют при 28 С в течение 24 ч прн встряхио ванин. Полученный продукт используют для инокулирования 10 л указанной среды, находящейся в 16-литровом Аерментере, и инкубируют в течение 24 ч о при 28 С и скорости перемешивания 350 об/мин при аэрации со скоростью 1 0 л/мин, Эту ферментируемую массу (600 мл) используют для инокулировання 16 л среды, содержащей частично гидролизованный крахмал (640 г), сульфат аммония (32 r) вторичный кислый фосфат калия (16 г), натрийхлорид (16 r), сульфат магния 7Н<А (16 г), карбонат кальция (16 г), растворимый дрожжевой экстракт (6,4 r) сульфат железа (II) 7Н О (0,016 г), сульфат цинка 7Н О. (0,016. г) и хлорид марганца 4Н О (0,01 6 r), находящейся в 20литровом фермен терр. Ферментируемую массу инкубируют при 28 С при перемешивании со скоростью 350 об/мин и аэрируют со скоростью 15 л/мин, Через 24 ч добавляют натриевую соль циклобуъанкарбоновой кислоты (1,6 г) и такое добавление повторяют через 48 и 72 ч инкубирования, и ферментацию продолжают в течение.120 ч. После этого промежутка времени мицелий удаляют фильтрованием и экстрагируют ацетоном (3 7 л) . Этот. экстракт концентрируют до приблизительно 2 л при пониженном давлении и экстрагируют метиленхло ридом (2 5 л) . Метиленхлорид конденсируют досуха до получения неочищенного продукта в виде подвижного масла, его помещают в изооктан (150 мл), и раствор экстрагируют смесью метанола (95 мл) и воды (5 мл) . После выпаривания метанольного экстракта получают частично очищенный ма1560059 териал, который разделяют на индивидуальные компоненты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии следующим образом. Полученный остаток растворяют в небольшом количестве метанола и хроматографируют на колонке С)8 11, а фракции 20-35 объединяют и используют в примере 2, Пример 9. Получение 25-пиклобутил-авермектин В2 (R1= ОН, РЗ=Н) . 0 Объединенные фракции 1-4 из примера 8 выпаривают досуха и остаток повторно хроматографируют на колонке С)8 Zorbax ÎDS (21 мма25 см), элюируя смесью метанола и воды (3 ) со 25 скоростью потока 9 мл/мин. Соответствующие фракции объединяют, растворитель выпаривают и полученный продукт подвергают окончательной очистке на колонке (10,5 мл 25 см), элюируя сме- 30 сью метиленхлорида и метанола (98:2) со скоростью потока 4 мл/мин. Соответствующие фракции объединяют и растворитель выпаривают до получения соединения формулы (I) где R< — ОН, 35 двойной связи нет, R. < — циклобутил, К. — H, а R — 4 -(альфа-Z-олеандро> сйл) -альфа-Z -олеандросилокси (2) в виде белого порошка с т.пл, ))0-112 С. СтРоение полученного продукта под-40 тверждено масс-спектрометрически следующыч образом. Масс "спектрометрию с бомбардировкой быстрыми электронами проводят..на масс-спектрометре ЧС модель 7070Е, 45 используя матрипу образца триэтиленгликоля с твердьм натрийхлоридом (!+ +Ба)+ наблюдают при m/е 91-1 (теоретически 9) l ) . Масс-спектрометрию с электронным ударом осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070F. Значения;в/е для основных фрагментов. 321, 303, 261 р 257 s237p 219s 19) р 1.79, 167,145, 127, ).13 1.).1, 95 и 87. П р и и е р 10 . Иолучение 25-цик55 лобутип-авермектин А2 (R ÎÍ, R =СН ) . Объединенные фракции 5-9 из примера 8 выпаривают досуха, а остаток хроматографируют дважды на к;.;л:-пк» С) 8 Zorbax 0DS .,21 ммх25 см), эгп<1ируя смесью метанола и воды (77; r. );-.o скоростью потока 9 мл/ мин . Сс OTB pтс твующие Фракции объединяю г и k-. нарицают до получения соединения формулы (1), где R - ОН,двойной связи нет, R;— циклобутип, k(3 — (- tf3 а М+ — 4 -(.аль- фа-Z-олеандросил) -альс>з-Z- олеандро илокси (2) в виде белого порошка с т,пл. 135-140 С, Ст рое н ие п родук та подтве рждено масс-спектрометрически следующим образом . Масс-спектрометрию с. бомбардиров— кой быстрыми электронами осуществляют на масс-cnexтрометре VG модо.гь 707ОЕ, используя матрипу образпа триэтиленгликоля с твердым натрийхлоридом (.)+ +Na) наблюдают пр™ m/е 925 (те;ретически 925). Масс-спектрометрию электронного удара осуществляют на ь.асс- пектрометре VG модель 7070F, Значения m/e для основных фрагментов следующзе". 596у 454, 321 ь 303 s 275 237 з 2! 91 191,179, 167, )45, 127, 1)3, 111, 95 и 87, Пример 11 Получение 25-пьклобутил-авермектин В! (имеется 22,23 двойная связь, R3 = Н) . Объединенные фракции 10-19 из nри-. мера 8 выпаривают досуха, а сстаток растворяют в метаноле и хроматографируют на колонке С18 Zorbax ODS, элюируя смесью метанола и воды (4:!) со скоростью потока 9 мл/мин. Соответству;.1щие фракции объединяют, а растворитель выпаривают до получения продукта, который повторно хроматографируют на колонке Sil ica Zorbax S òZ (2! мм "25 см), элюируя смесью дихлорметана и метанола (98,5:1,5) со скоростью потока 9 мл/мин. Coo TD "тствующие фракции объединяют и растворитель выпаривают до получения соединения формулы (1), где R отсутствуе-, двойная связь гмеется, Š— циклобутип, R — Н à R — 4 -(альоша-Z-олеандро/ 3 Ф сип) -альфа-олеандросилакси, в ниле белого порош<а с т.пл. 135-138 С. Строение полученного продукта подтверждено масс-спектрометрнчески следующим образом. Масс-спектрометрию с бомбардиров-кой быстрыми электронами осуществляют на масс-спектрометре 7С модель 7070Е, используя матри образца три1560059 5 10 этиленгликбля и твердым натрийхлоридом (К+Ба) наблюдается при m/å 898 (теоретически 893), Касс-спектрометрию электронного удара осуществляют. на масс-спектрометре VG модель 7070Е. Значения тв/е для основных. фрагментов следующие. 303, 261 в 257 ю 2191 1 91 э 167, -127, 113, 11 I, 95 и 87. Пример 12. Получение 25-циклобутил-авермектин А1 (имеется двой ная связь 22,23:R = СН.З). Объединенные фракпии 20-35 из при мера 8 выпаривают досуха и остаток хроматографируют на колонке С18 ZorЪах ОЭБ (21 мм 25 см) со скоростью потока 9 мл/мин. Соответствующие фракции объединяют, растворитель выпаривают и полученный продукт повторно хроматографируют на колонке Silica Sperisorb 5 мкм (10,5 ММ 25 см), элюируя смесью дихлорметана и метанола (98,5:1,5) со скоростью потока 4 мл/мин. В результате объединения соответствующих фракций с последующим выпариванием получают соединение формулы (1), где R < отсутствует, двойная связь имеется, R < — пиклобутил, R3— СН» à R 4 — (альфа-Z-.oëåàíäðoñéë)альфа-Z — олеандросилокси, в виде белого порошка с т.пл. 120-124 С, Строение полученного продукта подтверждено масс-спектрометрически следующим образом. Масс-спектрометрио с бомбардировкой быстрыми электронами осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070Е, используя матрицу образца триэтиленгликоля с твердым натрийхлоридом. (К+На)+ наблюдают при m/e 907 (теоретически 907) . Масс-спектрсметрию электронного удара осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070F. Значение т/е для основных фрагментов. 578, 303, 275, 257, 219, 191, 167, 145, 127, 113,111, 95 и 87. Пример 13.,Получение 25(циклогекс-3-енил) авермектин А2. Воспроизводят. среду и условия примера 1 за исключением того, что в качестве субстрата используют натоиевуют соль 3-циклогексановой кислоты. до получения соединения формулы (1), где R < — ОН, двойной связи нет, R <— циклогекс-3-енип, Р > — СН э, а R q— 4 — (альфа-Z-олеандросил) -альфа-Z-олеандросилокси, в виде белого порошка с т.пл. 131-5 С. Строение полученного продукта подтверждено масс-спектрометрически следующим образом. Иасс-спектрометрию с бомбардиров- кой быстрыми электронами осуществляют на масс-спектрометре ЧС модель 7070Е, используя, матрицу образца триэтиленгликоля с твердым найтрихлоридом (И+На)+ наблюдают при m/е 951 (теоретически 951) . . Масс-спектрометрию электронного удара осуществляют, используя массспектрометр VG модель 7070F Значения . щ/е для основных фрагментов . 624,480, 347, 329, 375, 263, 245, 235, 21 7, 205 193, 179, 145, 127, 113, 111, 95 и 87. Пример 14. Получение 25-цик— логексил авермектин А2. Воспроизводят среду и условия примера l за исключением того, что в качестве субстрата используют натоиевую соль циклогексанкарбоновой кислоты до получения соединения формулы (1), где К1 — OH, Рe — цжлогексил, Вэ — Снз, а R — 4" -(альфа-олеандроксил) -альЬа4 Z-олеандросилокси, в виде белого порошка с т.пл. 112-117 С. Строение полученного продукта подтверждено масс-спектрометрически следующим образом, Масс-спектрометрию с бомбардировкой быстрыми электронами осуществляют на.масс-спектрометре VG модель 7070Е, используя матрицу образца триэтиленгликоля с твердым натрийхлоридом. (К-Na) . наблюдают при m/е 953 (теоретически 953) . Масс-спектрометрию электронного удара осуществляют на масс-спектрометре UG модель 7070F. Значения m/е для основных фрагментов: 624,482, 349, 331, 275, 265, 247, 237, 219, 207,195, 179, 145, 127, 113, 111, 96 и 87. Пример 15. Получение 25-(1метилтиоэтил) авермектин А2. Воспроизводят среду и условия примера 1 за исключением того, что в ка- честве субстрата используют натриевую соль 2-метилтиопропионовой кислоты до получения соединения формулы (1),где R„ - ОН, R < --1 -метиптиоэтилом, К СН, à R — 4 -(альфа-Z-олеандроксил). альфа-Z-олеандроксилокси в виде белого поропжа с т.,пл. 134-138 С. 13 14 1560059 Строение полученного продукта подтверждено масс-спектр метрически следующим образом. (Масс-спектрометрию с бомбардиров-. КоН быстрыми электронами осуществляют на масс-спектрометре (G модель 7070Е используя матрицу образца триэтиленгликоля с твердым натрийхлоридом. (H+Na)+ наблюдают . при m/е 945 (теоретически 945) . Уасс-слектрометрию электронного удара осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070F. Значение m/е для основных фрагментов . 341 323, 275, 257, 239 211, 179 187, 1 45, 127,1l3, ill, 95 и 87. Пример 16. Получение 26-(2метилциклопропил) авермектин А2. Воспроизводят с реду и vc JIOBHs пр™- 20 мера 1 за .исключением того, что в качестве субстрата использ ют натриевую соль 2-метилииклопропанкарбоновой кислоты до.получения соединения формулы (1), где R „- ОН, R — 2-метил- 25 циклоп ропил, R — СН, Р— 4 -(альфа-2-олеандросил) -альфа-2-олеандроксилокси, в виде белого порошка с т,пл. 147-150 С. Строение полученного продукта под- 3р т ерждено масс-спектрометрически следующим образом. 11асс-спектрометрию с бомбардировкой быстрыми электронами осуществляют на масс-спектрометре VG модель 707ОЕ, используя матрицу образца три- 35 этиленгликоля с твердым натрийхлоридом, (M+Na) наблюдают при m/е 925 (теоретически 925) . Масс-спектрометрию электронного 40 удара осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7070F. Значение m/е для основных фрагментов: 596, 454, 303, 275, 237, 21 9, 209, 1 91, 179, 167,145, 127, 113, l l l 96 и 87. Пример 17. Воспроизводят способ по примеру l за исключением того, что в качестве субстрата вместе циклопентакарбоновой кислоты используют натриевые соли следующих карбоновых кислот, до получения соответствующих 25-замешенных авермектинов формулы (1), где Е, — ОН, двойной связи нет, или где имеется двойная связь, а R, отсутствует, R > — Н или ОН, à R 4 — 4 -(альфа-Z-олеандросип) -, (3 55 альфа-Z-олеандросилокси: 2-метилва- ле рианов ая, 2, 3-диме тилмасляная, 2метилгексановая, 2-метилпент-4-ено вая, 2-метилпентановая, 2-цикл про-. пилпропионовая, пислогектапкарб ч свая, 4, 4-дифторциклог":: к санкарбонов ая „ 4-мет илен цикло ге к сан ка рбонов а я „3-мат(-лцнклсгексанкарбоновая, циклогентен-l --карбоновая, l-циклогексепкарбоновая, тетрагидропиран-4-карбоновая тиофен-2-карбоновая, 3-Ферилуксусная и 2-хлор-тиофен-ч-карбоновая. Пример 18. Получение 25-цик= лобутил-22,23-дигидроавермектин Вl . Продукт примера 11 в бензоле гидрируют в присутствии трис(три(1 енилфосфин) рсдий хлорида по способу EPAA-0001689 до получения соответствующего соединен2 .я формулы {) ), где является Н, а двойной связи нет, Пример 20. )жидкая композиция, Продукт, полученный по способу любого из предшествующих примеров, ра-. створяют в полиэтиленгликоле (средний молекулярный вес 300) до получения раствора, содержащего 400 мкг/мл, для пр2(менения в качестве жидкой компоэнции. П р н м е р 21. Противогельминтчую активность оценивают против CaenorЬаЬ ditis elegans, используя in vitro тест скринирования. Продук". ы прпмеров 1, 7, 9-16 убивают 100Х чер-вей в концентрации О,l мгкл/мл, Пример 22. Инсе.:.тицидная актив нос ть . Активность против взрослой домашней мухи Musca domestica демонстрируют, используя стандартную тестовую методику, в которой мух анестезируют двуокисью углерода и 0,1 мкл аца-она, содержащего тестовое соединение, помещают на торакс самок мух. Продук— ты примеров 1,7 и 9-16 все убивают lOOX обработанных мух в дозах 0,01 мкг на муху. Использование способа позволяет по учать препараты, обладающие противопаразитичесхим действием. широкого. спектра. Формула изобретения Способ получения пронзводногп авермектина общей формулы I R, сн .,1,с н R 2 25 0 Я2 СК 1560059 R CO Н, СН СН Н0 Составитель Г. Смирнова Редактор С, Патрушева Техред М. Ходанич Корректор Н. Король Подписное Тираж 475 Заказ 844 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", r.yæãîðîä, ул. агарина, 101 где пунктирная линия в положении 2223 представляет возможную двойную связь; Р - Н или ОН и отсутствует двойная связь в положении 22-23 или двойная связь присутствует и отсутствует Й19 R — альфа разветвленный С -С— Е э 8 алкил при условии, что не изопропиловый или вторичнобутиловый, алкенил, алкинил, алкоксиалкил, ил.и алкилтиоалкиловая группа, ийи С -С пиклоалкилалкиловая группа, в которой алкиловая группа. представляет альфа разветвленную С -С алкиловую груп ипи С > -С >-циклоалкип 9 и С.к-с е-ц лоа ки овая 20 группа, пп и этом любой иэ них может эамещаться метиленом или одной или более С„-С -алкиловьми группами, или галоатомами, или тиенил- 25 г руппа, R — Н или СН R„- 4 -(d-Z-олеандрозил) -оИ олеандрозилокси группой формулы 30 заключающийся в- том; что штамм Streptomyces avermj.ti1is NCIB 12121 культивируют в питательной среде в присут ств ии к арб онов ой кисло ты общей формулы или.ее натриевой соли, или ее метилового эфира, и выделяют целевой продукт общей формулы I, где R 1 — OH u отсутствует двойная связь в положении 22-23 или есть двойная связь и отсут ствует Р,9 и при необходимости последнее соединение восстанавливают до получения целевого продукта, где R — Н и отсутствует двойная связь. 2, Способ по п.1, о т л и ч а ющ. и- и с я тем, что Rg означает С 9 или С -циклоалкил- или циклоалкенилгруппу, которая при необходимости может быть замещена одной и более С„-С+-алкильными группами. 3, Способ по п,2, о т л и ч а ю— шийся тем, что R — циклопентил или циклогек сил. 4. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что R < - циклобутил. 5, Способ по п.1, .о т л и ч а юшийся тем, что R< " 3-тиенил. 6. Способ по п.l о т л и ч а ю шийся тем, что Rg — 1-метилтиоэтил. Приоритет по пунк там: 27.07.85 — по пп. 2 и 3, 02.05.86 — по п.4; Q9.08.85 — по п.5; 24,04.86 - по п.б.