Способ выявления микобактерий туберкулеза

 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии. Целью изобретения является повышение специфичности выявления микобактерий человеческого вида MICOBACTERIUM TUBERCULOSIS. Цель достигается тем, что бактериальные клетки инактивируют путем обработки в хлороформе в течение 4 ч, после чего фиксируют на твердофазном носителе и проводят с ними иммунологическую реакцию с помощью моноклональных антител, продуцируемых гибридным клеточным штаммом 62Д ВЦКК (П). Предложенный способ надежен, легко воспроизводим, безопасен, требует для своего осуществления 2 дня в отличие от традиционных методов идентификации микобактерий туберкулеза, продолжающихся 1-3 месяца.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ 1493953 А 1 (51)4 С 01 М 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

prif

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 не и ветеринарии. Целью изобретения является повьппение специфичности выявления микобактерий человеческого вида Nicobacterium tuberculo „Ц ль достигается тем, что бактериаль .:»ti клетки инактивируют путем обработки в хлороформе в течение 4 ч, после чего фиксируют на твердофазном носителе и проводят с ними иммунологическую реакцию с помощью моноклональных антител, продуцируемых гибридным клеточным штаммом С2Д ВСКК (П). Предложенный способ надежен, легко воспроизводим, безопасен, требует для своего осуществления, 2 дня, в отличие от традиционных методов идентификации микобактерий туберкулеза, продолжающихся 1-3 мес, (21) 4238083/28-14 (22) 28,04.87 (46) 15,07,89,Бюл, № 26 (71) Московский научно-исследовательский институт туберкулеза и Институт экспериментальной кардиологии Всесоюзного кардиологического научного центра АМН СССР (72) М.В.Андросова, М.А.Владимирский 1

И.Н.Трахт и В.М.Должанский (53) 6 15.373(088,8) (56) Никитин В.11. Справочник методов в иммунологии. Кишинев, 1982, с,272274, (54) СПОСОБ ВЬ1ЯВЛЕНИЛ МИКОБАКТЕРИЙ

ТУБЕРКУЛЕЗА (57) Изобретение относится к медиципользованием дорогостоящего оборудования, длительной процедурой обработки (гамма-облучение), необходимостью большого количества биомассы (ультразвуковая обработка с последующим центрифугированием), либо приводят к денатурации белковых антигенных детерминант (фиксирование над пламенем на стекле, обработка формалином).

Пример. 1 мг полувлажной бактериальной массы помещают в центр

AaphopoaoA ступки. Заливают 3 мл хлороформа и накрывают крышкой от чашки Петри. По истечении 4 ч хлороформ испаряется, бактериальную массу тщательно растирают пестиком и по каплям добавляют 0,02 М карбонатно-бикарбонатный буфер (рН 9,6) до разведения

0,5 мг/мл, Для идентификации испольИзобретение относится к медицине и ветеринарии, Для человека патогенными являются в основном микобактерии туберкулеза (МБТ) человеческого (51icobacterium

tuberculosis) и бычьего (М.bovis) видов.

Целью изобретения является повышение специфичности выявления.

Цель достигается применением моноклональных антител, продуцируемых гибридомным клеточным штаммом Г2Д

ВСКК (П), после инактивации микобактерий туберкулеза хлороформом в течение 4 ч, что позволяет сохранить структуру антигенных детерминант белков, присутствующих на поверхности микобактерий туберкулеза. Другие способы инактивации либо связаны с исОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1493953

S5

3 эуют 0,8 мл полученной взвеси, остальное количество замораживают. По

0,2 мл испытуемой микробной взвеси вносят в 4 лунки полистироловой плас5 тины, предварительно обработанной поли-L-лизином (по 0,05 мл 0,001Х-ного раствора поли-L-лизина в фосфатно-солевом буфере рН 7,4 заливают в лунки пластины, через 30 мин его соо бирают и хранят при -20 С для повторного многократного использования, оставшийся в лунках раствор поли-Ь-лизина стряхивают). Инкубация с антигеном продолжается в течение ночи при 37 С. Затем лунки тщательно промывают: трижды водопроводной водой, на 1 мин пластину заливают водопроводной водой с 0,05Х твина 20. Процедуру отмывки в такой последователь- 20 ности повторяют трижды. Для предупреждения неспецифического связывания в лунки вносят по 0,2 мл 10Х-ного раствора яичного белка в 0,02 М фосфатносолевом буфере рН 7,4. Через 1 ч 25 лунки трижды промывают водопроводной водой, после чего заливают по 0,2 мл

0,0057.-ного раствора моноклональных антител С2Д ВСКК (П) в 0,02 фосфатносолевом буфере с 10Х яичного белка и 30

0,05Х твина 20 (т.е. по 10 мкг моноклональных антител/0,2 мл).

Специфическое связывание антигена и моноклональных антител продолжается в течение 1 ч при комнатной температуре.

Далее лунки вновь тщательно промывают: трижды водопроводной водой и

1 мин водой с 0,057 твина 20 и так три раза. 40

Для детекции комплекса антигенантитело в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов мьппи, меченные пероксидазой. Рабочее разведение

1:1000 в 0,02 М фосфатно-солевом бу- 45 фере с 10Х яичного белка и 0,057. твина 20. Инкубация продолжается 1 ч при 37 С.

После описанной трехкратной промывки лунок реакция проявляется с помощью 0,05 М цитратного буфера, 20 мл которого содержат 4 мг ортофенилендиамина и 0,5 мл 0,5Х-ной н,01.

В качестве контроля при идентификации бактериальных культур используют музейные штаммы микобактерий туберкулеза человеческого (положительный контроль) и бычьего видов, а также атипичные микобактерии, получен- ные в 1"ИСК им, Л.А.Тарасевица (отрицательные контроли).

В лунках, содержащих микобактерии туберкулеза человеческого вида, цитратный буфер окрашивается в желтый цвет, а в других (отрицательный контроль) он остается бесцветным. Реакция останавливается 50Х-ной серной кислотой через 5-10 мин.

Предлагаемый способ иммунологической идентификации микобактерий туберкулеза человеческого вида является более специфичным по сравнению с прототипом, Достоверность ответа о видовой принадлежности возбудителя позволяет испольэовать этот метод для проведения своевременных противоэпидемических мероприятий в очагах туберкулезной инфекции, позволяет также прогнозировать течение заболевания.

Простота и скорость осуществлеНия иммунологического метода идентификации вида МБТ позволяет его использовать в практике фтизиатрии, а также в ветеринарии, где идентификация человеческого вида МБТ, полученных из тканей забитых животных, .снимает вопрос об их эпидемиологической опасности, поскольку человеческий вид

МБТ не является опасным для крупного рогатого скота. формула изобретения

Способ выявления микобактерий туберкулеза путем инактивации бактерий, их фиксации на твердой фазе, обработки специфическими антителами с последующей идентификацией иммунного комплекса меченной ферментом антиглобулиновой сывороткой, о т л Hч а ю шийся тем, что, с целью повьппения специфичности выявления

Nicobacterium tuberculosis,;ìèêîбактерии инактивируют хлороформом в течение 4 ч, а в качестве специфических антител используют моноклоиальные антитела, продуцируемые гибридомным клеточным штаммом С2Д ВСКК (П),