Способ иммунодиагностики инфекций

 

Изобретение относится к области медицины, преимущественно к иммунодиагностике инфекций. Цель-ранняя диагностика и повышение точности способа. Диагностическое исследование производят с начала заболевания, дополнительно определяют у больного титр антител к неспецифическому антигену и у здоровых лиц титр антител к специфическому и неспецифическому антигенам с последующим расчетом индекса специфического повышения титра антител по формуле Индекс=(Т<SB POS="POST">сп</SB>/Т<SB POS="POST">несп.</SB>)/(СредствоТ<SB POS="POST">сп</SB>/СредствоТ<SB POS="POST">несп.</SB>), где Т<SB POS="POST">сп</SB> - титр антител к специфическому антигену у больного

Т<SB POS="POST">несп</SB> - титр антител к неспецифическому антигену у больного

Средство Т<SB POS="POST">сп</SB> - средний титр антител к специфическому антигену у здоровых лиц

Средство Т<SB POS="POST">несп</SB> - средний титр антител к неспецифическому антигену у здоровых лиц. При значении индекса больше 4 диагностируют инфекцию.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН 1) 4 G 01 N 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

IlPH ГКНТ СССР (21) 3605070/28-14 (22) 14.06.83 (46) 07.07.89.Бюл. 1г 25 (7l) Пермский государственный медицинский институт (72) В.Н.Каплин, И.П.Корюкина, Г.И,Лузина, Л.В.Р1алгина, С.В,Дворянская и Д.10.Плаксин (53) 6!5.373 (088.8) (56) Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. — 1д.: 1982. (54) СПОСОБ И1МУНОДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИ.1 (57) Изобретение относится к области медицины, преимущественно к имму- . нодиагностике инфекций. Цель — ранняя диагностика и повышение точности способа. Диагностическое исследование производят с начала заболевания, дополнительно определяют у

Изобретение относится к медицине, преимущественно к области иммунодиагностики инспекций.

Цель изобретения — ранняя диагностика и повышение точности способа °

Способ выполняют следующим обраэом.

Предварительно подбирают в пару к специфическому диагностикуму диагностикум с неспецифическим ан. тигеном. Выбор неспецифического диагностикума осуществляют по следующим критериям. Он не должен давать перекрестных реакций со специфическим диагностикумом и при од„.SUÄÄ 149228() А1

2 больного титр антител к неспецифическому антигону и у здоровых лиц титры антител к специфическому и неспецифическому антигенам с последующим расчетом йндекса специфичес кого повышения титра антител по фор6

Тсуи /Т нгсп муле; Индекс = -- где., СрТ,JCpTttecn

Т вЂ” титр антител к специфическому, сп

6 антигену у больного; Т дарг„гц- титр антител к неспецифическому антигену у больного; Ср Т „ — средний титр антител к специфическому антигену у к здоровых лицу Cp т и еег уугм средний титр антител к неспецифическому антигену у здоровых лиц. При значении индекса больше 4 диагностируют инфекцию. новременном исследовании 10-12 здоровых людей или больных контрольной группы выявлять титры антител, корре- Ю лирующие с титрами антител к специ- QO фическому антигену с величиной С0 коэффициента корреляции выше 0,5. При воэможности выбора неспецифического диагностикума иэ ряда диагностикумов предпочтительнее такой, который в паре со специфическим диагностикумом выявляет титры антител с наибольшим ковффициентом корреляции и с соотношением их средних величин в группе, близким к 1:1.

В группе здоровых людей и контрольных больных общим числом не

1492280

15

35

45

50 менее 20-25 чел. устанавливают соотношение титров антител к специфическому и неспецифическому антигенам с применением тех эритроцитарных диагностикумов,которые предполагается пос тоянно использовать в последующих диагностических исследованиях. По результатам определения составляют стандарты соотношения титров антител к специфическому и неспецифическому антигенам. Для этого индивидуальные результаты определения титров антител группируют, объединяя в отдельные группы индивидуальные показатели с одинаковым значением титра антител к неспецифическому . антигену. Для каждой такой группы с одним значе»ием титра антител к неспецифическому антигену вычисляют среднее значение соответствующих индивидуальных титров антител к специфическому антигену. Эти стандарты постоянно используют в Последующих диагностических исследованиях. При проведении диагнос тического исследования у больного определяют натуральные титры антител к специфическому и неспецифическому антигенам и вычисляют индекс специфического повышения титра по соотношению титров антител у больного и в соответствующем стандарте из контрольной группы с такой же величиной титра антител к неспе»ифическому а»тигену. Поскольку при этом титры антител к »еспецифическому антигену одинаковы у больного и в соответс.твующем стандарте, индекс вычисляют путем простого деления титра специфических антител у бо ь»ого на средний титр антител к специфическому антш е»у г, соответствующем стандарте.

Нео зхопимо иметь достаточно большой набор стандартов соотношения титров антител, соответствующий вариациям индивидуальных з»аче»»й т»тров антител к неспецифическому антиге»у у диагностируемых больных. При отсутствии соответствующего стандарта расчет индекса можно производить »А стандарту титра антител к»еспс ш фическому антигену, смежному с ти гром этих антител у диагност»руемого бо.th— ного. При этом титры а»тизен к обоC им антигенам в стандарте увел»ч»»лют или уменьшают вдвое для приведеHHH в соответствие величин т»тро» антител к неспецифическому а ггп «ну в стандарте и у боль»ого. 11с»ользование стандартов соотношения титров антител позволяет получить диаг иост»чески значимый результат при величине индекса 4,0 или даже несколько ниже этой величины.

Возможно применение и упрощенного стандарта соотношения титров. Если в контрольной группе средние величины титров антител к специфическому и неспецифическому антигенам различа.ются не более чем в 4 раза, индекс специфического повыше»ия титра а»тител рассчитывают по формуле, но вводят в »ее величини соотношения титров в контрольной группе, округленные до целых величин. При этом в слу 1ае соотноше»ия величин среднегрупповых титров в контрольной группе 1:1 индекс вычисляют простым делением титра специфических антител у больного на- титр его антител к неспецифическему антигену.

Если при диагностическом исследова»ии используют нестандартные и нестабильные эритроцитарные диагностикумы, то одновременно с больным определяют титры антител к специфическом:г » неспецифическому антигенам у трех контрольных лиц, Рассчитывают с.ред»ие титры антител у контрольных лиц, и индекс вычисляют по формуле.

Пр» разнице средних титров антител у контрольных лиц более чем в

4 раза при расчете индекса у больного с предельно низким значе»ием титра антител к неспецифическому «нтигену можно получить завышенную величину. Поэтому в зоне край»е низких значений титров антител к неспецифическому антигену у диагностируемьгх боль»их найденную велич»»у »»декса следует уменьшить вдвое.

Способ можно применять также при исследовании парных" сывороток. Для этого в обеих сыворотках следует дополнительно определить титры антител к »еспецифическому антигену и в формулу расчета ввести соотношение титров антител к специфическому и неспецифическому антигенам в каждой сыворотке. Расчет индекса можно производить как по соотношению титров антител »о второй сыворотке к первой, так и в обратном порядке. При исследовании парных сывороток диагностически значимой считают величину индекса 4 и выше.

1492280

Пример 1. Применяют способ при диагностике дизентерии.

В контрольной группе из 12 взрос. лых здоровых людей и 16 больных де5 тей с воспалительными заболеваниями, не относяшимися к острым кишечным ин фекциям, получена сыворотка крови.

Каждая проба сыворотки раститрована в макроварианте РПГА с разведения от

1:2 до 1:512 в соответствии с "Наставлением по применению диагностикумов эритроцитарньж иэ шигелл Зонне, Флекснер.и Ньюкестл". Определены титры антител с диагностикумами из шигелл

Зонне и Флекснер. У здоровых людей средние титры антител к шигеллам Зонне 1:Sl (пределы колебаний от 1:16 до 1-256), к шигеллам Флекснера 1:81 (пределы колебаний от 1:8 до 1-256). 2р

У больных детей контрольной группы средний титр антител к шигеллам Воине 1:92 (пределы колебаний от 1. 4 до 1:256) и к шигеллам Флекснера

1: 71 (пределы колебаний от 1: 16 до 25

1:256). Коэффициент корреляции титpris антител к-шигеллам Зонне и Фвекснера 0,76.

На основании исследований контрольной группы пара эритроцитарных диаг- ЗО ностикумов является вполне подходящей для проведения диагностического исследования при дизентерии. Учитывая равенство средних титров антител к обоим антигенам, расчет индекса можно производить простым делением титров антител к обоим антигенам. У контрольных лиц величина индекса не выходит за пределы 4,0.По результатам обследования контрольной группы диагностический титр составляет

l:512. Особенность применения этой нары диагностикумов состоит в том, что здесь заранее не определяется, какой из них считать неспецифическим. 4В

Установление принадлежности заболевания к одному из двух видов дизентерии производят по превышению величины титра антител к одному из видов шигелл более чем в 4 раза по отноше- яО нию к титру, определяемому к другому виду шигелл.

При дизентерии Зонне в первые 3 дня заболевания возможно не специфическое повышение, а специфическое угашение титра антител с падением титра антител к этому антигену до О.

В этом случае для уточнения вида дизентерии целесообразно провести с сывороткой крови больного дополнительное исследование титра антител с диагностикумов, заведомо гетерогенным по отношению к диагностикумам из шигелл Зонне и Флекснера.

У двух больных, поступивших на

1-й и 2-й день заболевания с подозрением на дизентерию, взята кровь, получена сыворотка и в ней определены титры антител с эритроцитарными диагностикумами иэ шигелл Зонне и

Флекснера. У одного больного титры составили соответственно О и 1:128 и у другого 1:2 и l 64. Расчет индексов указал на наличие дизентерии у обоих больных. У первого больного была предложена дизентерия Зонне, а у второго — дизентерия Флекснера, что полностью совпало с полученными позднее данными бактериологического исследования. Заключение о наличии о дизентерии Зонне было сделано на основании нулевого титра к этому антигену,что никогла не встречалось у больных заболеваниями недизентерийной этиологии. Дополнительное исследование у этого больного титра антител к риккетсиям Провачека подтвердило правильность такого заключения.

При обследовании предлагаемым способом 115 больных с бактериологически подтвержденной дизентерией Зонне и Флекснера на 1-4-й дни заболевания получено ЗОХ диагностически значимых результатов, а известным способом — О. В период с 5-ro no

10-й дни заболевания предлагаемым способом получено 93Х положительньж диагностических результатов, а при оценке по величине диагностичес- кого титра 1:512 — 40X. С ll-го по

23-й дни заболевания предлагаемым способом получено 100Х положитель- . ных результатов, а при оценке по диагностическому титру — 53Х.

При обследовании 15 больных со сроками от начала заболевания от двух двух дней до двух месяцев с диагнозом дизентерия Флекснера, поставленным на основании данных эпидисследования, но беэ бактериологического подтверждения, предлагаемый способ дал положительный диагностический результат у всех больных, а диагностический титр антител установлен лишь у двух больных.

1492280

Пример 2. Применение способа при диагностике менингококковой инфекции.

Для диагностического исследования использованы жидкие эритроцитарные

5 менингококковые диагностикумы типон

А.В и С.Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера и н качестве неспецифического сухой, антигенный эритроцитарный диагности; кум из шигелл Зонне Ленинградского

НИИ вакцин и сывороток, У 10 здоровьи людей-доноров получена сыворотка крови. Сыворотки раститрованы с I%-ной нормальной кроличьей сывороткой с разведением от

1:2 до 1-:256 с объемом ингредиентов по 0,025 мл. Из каждой сьгворотки при- 20 готовлено 4 ряда таких разведений, н лунки каждого ряда внесено по

0,025 мл 1%-ной взвеси каждого из испытываемых диагностикумов. В каждом планшете для титрования определен 25 титр антител только к одному антигену.

Планшеты выдержаны н термостате 2 ч.

Титр антител к шигеллам Зонне определен по системе четырех крестов, титр противоменингококконьх анти- 30 тел — по последнему раэведению с реакцией не ниже чем на 2 креста.

Средние титры антител состанили к менингококкам типа Аl:3,0 (пределы колебаний от 1:2 до I:8),ê менииго— коккам типа В 1:2,5 (пределы колебаний от 0 до 1:4), к менингококкам типа С 1:1,6 (пределы колебаний от 0 до I:4),ê шигеллам Зонне 1:24 (пределы колебаний от 1:4 до I:64). Титры противоменингококконых антител всех типов коррелируют с титрами антител к и.игеллам Воине с величиной коэ<фициента корреляции в преде— лах 0,8-0,9. Набор диагностикумов 45 подходит для диагностического исследования. Учитывая большую разнипу в величине средних титров противоменингококконых и противодиэентерийных антител, целесообразно проводить oïределение индекса по дифференцированным стандартам соотношения титров <штител у контрольньгх лиц. С этой целью дополнительно проведено определение титрон антител у IР здоровых детей и 11 больньгх детей из контрольНоА группы. По результатам исследования составлены стандарты соотно«<ени« титров антител.

Показано, что предельная величина индекса в контрольной группе составляет 3,6, поэтому бесспорное диагностическое значение имеет даже величина индекса 4,0. По результатам исследования контрольной группы принят за диагностический титр протиноменингококконых антител I:32.

У больного,. поступившего н инфекционную больницу с подозрением на менингококконую инфекцию, и день поступления произведено определение титров антител.

Исследование,показало, что у больного диагностически значима вели ина индекса специфического поньш|ения титра к менингококкам типа В.Величина индекса н 4 раза превосходит предельную контрольную величину индекса в стандарте с титром антител к шигеллам

Воине 1:4. В то же время неличина титра к этому антигену в 4 раза ниже диагностического титра.

Воэможность применения способа при исследовании "парных" сывороток поясняет следующий пример.

Больной К., 7 мес, поступил н больницу с подозрением на менингококковую инфекцию. В день поступления н больницу у него была взята сыворотка крови и заморожена н холодильнике. Вто— рая порция сыворотки была получена через 2 недели. В обеих сыворотках одновременно определены титры антител.

Расчет индекса ясно показывает, что в первой сыворотке относительно второй специфически повышен титр антител к менингококкам типа А. Возрастание в 4 раза титров антител к менингококкам В и С в динамике эаб<— левания носит неспецифический характер, поскольку точно так же изь<гняется в динамике титр антител к шигеллам Зонне.

При однократном обследовании при:<лагаемым способом 135 детей с генерализованными и локализованными формами менингококковой инфекций со сроками заболевания от I до 5 дней положительный диагностический результат получен н 86,2%, а при оценке и< диагностическому титру — в 25% исследований.

При исследовании "парньх".сынор<— ток предлагаемый способ дал положительный диагностический Результат у

77,8% больных, а при оценке извести« <

1492280

1О способом по критерию 4- кратного прироста титра результаты исследования были отрицательными.

Л р е р Э. Применение способа при диагностике герпетической ин5 фекции.

Для проведения диагностического исследования изготовлен самодельный жидкий эритроцитарный диагностикум

l0 с использованием формалиниэированных и обработанных танином эритроцитов барана. Наличие у препарата специфической активности было подтверждено исследованием с противо- 15 герпетической референс-сывороткой.

У 14 здоровых людей доноров получена сыворотка крови. Из каждой пробы сыворотки сделано 2 ряда разведений в планшетах для микропроб с ис20 пользованием в качестве разводящей жидкости 1Х-ной нормальной кроличьей сыворотки с объемом ингредиентов по 0,025 мл. В лунки одного ряда добавлено по 0,025 мл IX-ной взвеси зритроцитарного диагностикума из вируса герпеса, в лунки другого — такой же объем 17.-ной взвеси диагностикума из шигелл Зонне. Планшеты помещены в термастат на 2 ч. Титры анти30 тел к вирусу герпеса оценены по последнему разведению сыворотки с реакцией не ниже чем на 3 креста, титры антител к шигеллам Зонне — по известной системе. Средние титры антител к вирусу герпеса 1:3,8 (пределы ко35 лебаний от 0 до I:8), к шигеллам

Зонне — 1:10,7 (пределы колебаний от

1:2 до l:32). Величина коэффициента корреляции 0,56.Индивидуальные вариации индекса соотношения титров

40 антител в исследованной группе были в пределах 0,7-2 8. Пара диагностикумов годится дляпроведенил диагностического исследования, однако, учитывая не45 стандартность диагностикума из вируса ! герпеса, для диагностического исследования следует применить вариант с одновременным исследованием титров антител у больного и трех доноров.

Применение способа при диагности ке герпетической инфекции поясняет следующий пример.

Больной К. Поступил в клинику глазных болезней с диагнозом кератит

55 предположительно герпетической природы. В тот же день было проведе но исследование титро «нтител у больного и трех здоровых людей-доноров.

Данные исследования указывают на высокий уровень специфической реакции к вирусу простого герпеса и беэусловно свидетельств ют о наличии герпетической инфекции. Правильность такого заключения подтверждена обнаружением методом флуоресцирующих антител антигена вируса простого герпеса

B соскобе из конъюнктивы.

При обследовании предлагаемым способом 20 больных с различными формами герпетического кератита одно" кратное исследование титров антител при поступлении дало положительный диагностический результат у всех об-. следбванных. Аптиген вируса простого герпеса в соскобе иэ конъюнктивы об" наружен у половины больных. При исследовании парных" сывороток, полу» ченных при поступлении и через 2 недели, предлагаемый способ дал положительный результат у всех больных, а по известному способу с учетом критерия 4-кратного прироста титра антител к вирусу герпеса во второй сыворотке — только у 25Х больных.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет диагностировать инфекцию с первого дня заболевания, а по известному способу диагностическое исследование начинают не ранее 5-6-го дня заболевания. Особенно существен" ный выигрьпп во времени получается при диагностике вирусных инфекций, при которых достоверный результат получается только при исследовании "пар-!! ных сывороток, полученных с разницей во времени в 2-3 недели. Предлагаемый способ дает возможность получения достоверного диагностического результата при исследовании однократно полученной сыворотки, что соответственно сокращает сроки диагностики на

2-3 недели.

Следующее преимущество предлагаемого способа заключается в повьппении точности диагностики. Это доказывается сравнительными данными об уровне титра антител, при котором можно диагностировать инфекцию предлагаемым и известным способами. При дизентерии достоверное значение имеет титр антител 1:512, по предлагаемому способу можно обнаружить достоверное изменение специфических антител с титра 1:16, а в случае специфичес

1492280

35 кого угашения титра антител даже лри нулевом его значении. При менингококковой инфекции предлагаемый способ позволяет получить диагностический результат при титре антител

5 в 4-8 раэ ниже диагностического титра. Благодаря этому предлагаемый способ позволяет получить достоверных диагностических результатов в 310

3,5 раза больше, чем исследование известным способом с определением диагностического титра.

Благодаря повышению точносТи предлагаемый способ позволяет исключить как ложноположительные р езультаты исследования в тех случаях, когда повышение титра антител до диагностического уровня имеет неспецифический харЛктер. В частности, согласно

"Наставлению по применению диагностикумов зритроцитарных из шигелл диагностическим считается титр антител

1:200. Антитела в таком титре обнаруживаются у 147 обследованных из о контрольной группы здоровых и больных людей. Применение предлагаемого способа позволяет определить неспеци%ический характер такого повышенного титра антител и квалифицировать результаты исследования как ложнодиагностические.

Предлагаемый способ повышает точность исследования парных сывороток в связи с возможностью контроля специфичности динамики титра антител. По суммарным результатам всех исследований "парных" сывороток лри инфекциях предлагаемый способ позволяет установить неслецифический характер 4-кратного повышения титра ангитеп у 2/3 больных. У них выявлено аналог.очное и большее повышение титра а;.T тел к неспецифическому антигену. Вмс.сте с тем учет динамики титров 45 одновременно к специфическому и неспецифическому антигенам и вычисле— ние индекса увеличивает число диагностических результатов при исследовании парных" сывороток в среднем в.

4 раза в сравнении с их оценкой по критерию 4-кратного прироста титра антител к специфическому антигену.

Повышение точности способа выражается также в возможности одинаково

55 эффективного использования диагностикумов с разным уровнем их специфической активности. В частности, лри сравнении эритроцитарных диагностикумов из шигелл Зонне и Флекснера жидких МНИИЭМ им.Габричевского и сухих

ЛНИИЭМ им.Пастера установлено, что титры выявляемых ими антител в одних пробах сыворотки отличаются в среднем в 2 раза. Соответственно этому, при обследовании группы больных дизентерией с оценкой по единому официальному для обоих препаратов диагностическому титру антител 1:200 получена разница в числе диагностических результатов в 2 раза. При исследовачии предлагаемым способом получены абсолютно одинаковые диагностические результаты . При сравнении эритроцитарных менингококкових диагностикумов

МНИИЭМ им. Габрического и ЛНИИЭМ им.Пастера в параллельных пробах с одними сыворотками крови установлено, что первый препарат выявляет титры антител в среднем в 15 раз выше по величине,чем второй. Если лри исследовании обоими препаратами пользоваться единым диагностическим титром (I:40) (1:80), то у больных менингококковой инфекцией получаются кардинально различные результаты. Исследование по предлагаемому способу дает совпадение диагностических результатов у 90Х обследованных.

Предлагаемый способ дает возможность введения нового критерия оценки специфической активности эритроцитарных антигенных диагностикумов не по величине титра антител, а по диапазону градаций выявляемых ими титров независимр от их абсолютной величины. Критерием достаточной специфической активности препарата является определение у здоровых людей и больных специфической инфекцией титров антител в диапазоне, содержащем не менее 7 последовательных градаций титров антител, чтобы обеспечить достаточный цифровой набор значений диагностического критерия в форме индекса специфического повышения титра антител. Большему числу градаций выявляемых титров антител соответствует более высокая чувствительность препарата. Такой подход дает основание, для упрощения технологии коммерческого производства эритроцитарных антигенных диагностикумов для

РИГА.

Существенное улучшение диагностики инфекций обеспечивается применением существующих диагностических

1492280

14

Индекс к Ic

Ср. Теп /Ср. Т „е„

Составитель П. Бонарцев

Корректор В.Гирняк редактор И.Горная Техред Л.Олийнык

Заказ 3871/47 Тираж 789 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35,. Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101 препаратов без изменения техники их применения. Это дает воэможность не-. медленного применения изобретения в здравоохранении без дополнительных

5 средств и затрат на его реализацию.

Единственное усовершенствование, которое целесообразно ввести, это выпуск диагностического набора препарата со специфическим антигеном в соче- 10 танин с заранее отобранным диагностикумом с неспецифическим антигеном, что вполне возможно на основании использования существующих коммерческих диагностикумов. 15

Формула изобретения

Способ иммунодиагностики инфекций путем определения титра специфических антител в сыворотке крови пациента в реакции пассивной гемагглютинации, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и ранней диагностики,в начале заболевания дополнительно определяют титр антител к неспецифическому антигену и титры антител к специфическому и неспецифическому антигенам у здоровых лиц с последующим вычислением индекса по формуле

b еп / яее

6 где Те„- титр антител к специфическому антигену у пациента;

T„eel титр антител к неспецифическому антигену у пациента; к

Ср. Т „- средний титр антител к специфическому антигену у здоровых лиц; к

Ср.Тяеся- средний титр антител к неспецифическому антигену у здоровых лиц, и при значении индекса больше 4 диагностируют наличие инфекции.