Способ количественного определения стероидных гормонов
Изобретение относится к биохимии и может найти применение в медицине, сельском хозяйстве, экспериментальной биологии. С целью повышения точности анализа исследуемый образец обрабатывают специфическим рецепторным белком (СРБ) к стероидным гормонам (СГ) в присутствии стероидных гормонов, меченых люминесцирующим веществом (СГЛ). Затем с помощью гидроксилапатита отделяют СГ и СГЛ, связавшиеся с СРБ. О количестве СГ в исследуемом образце судят по интенсивности люминесценции в фазе, содержащей СГ и СГЛ, связанные с СРБ. Для осуществления способа используют СРБ к СГ, выделенный из децидуальной ткани. 1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (191 (11) (51) 4 = Ot N 33/68
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А BTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ разом.
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4222602/28-14 (22) 06.04.87 (46) 30.06,89, Бюл, И - 24 (71) Институт биологической физики
АН СССР, 1-й Московский медицинский институт им. И,М.Сеченова (72) А.В.Мальцев, Г.Д.Миронова, В.Н,Усачев и Т.Н.Кулманов (53) 612.015(088.8) (56) Kletsky О.А., Nakamura А,М., Mishell D.R. The normal distribution of gonado-tropins and ovarian
stегоid values in the normal menstrual
cycle.Amer. J. 0bstet gynecol. 1975, ч.121, р.688-694. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕРОИДН11Х ГОРМОНОВ
Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения стероидных гормонов, и может найти применение в медицине, сельском хозяйстве и экспериментальной биологии.
Целью изобретения является повышение точности способа.
Поставленная цель достигается тем, что в качестве гормонсвязывающего вещества используют специфический рецепторный белок к стероидным гормонам, получаемый из децидуальной ткани, а для разделения связанных и несвязанных гормонов используют гидроксилапатит, Этот белок обеспечивает связывание гормона с высокой константой связыва-
2 (57) Изобретение относится к биохимии и может найти применение в медицине, сельском хозяйстве, экспериментальной биологии. С целью повьппения точности анализа исследуемый образец обрабатывают специфическим рецепторным белком (СРБ) к стероидным гормо-. нам (СГ) в присутствии стероидных гормонов, меченых люминесцирующим веществом (СГЛ). Затем с помощью гидроксилапатита отделяют СГ и СГЛ,связавшиеся с СРБ. О количестве СГ в исследуемом образце судят по интенсивности люминесценции в фазе, содержащей СГ и СГЛ, связанные с СРБ.
Для осуществления способа используют
СРБ к СГ, выделенный иэ децидуальной ткани. 1 табл. ния (константа диссоциации Кд
10 М), т.е. более специфическое связывание, чем связывание гормона с антителами (Кд = 10 М) этого гормона.
Способ осуществляют следующим обПример 1. Получение специфического рецепторного белка к прогестерону.
Специфический рецепторный белок к прогестерону получали из децидуальной ткани человека следующим образом.
К 1 r ткани, отмытой от крови о физраствором (при 4 С) и гомогениэированной в проточном гомогенизаторе
1490650
АПГ-1, добавляли 5 мл ледяного буфера рН 7,4, содержащего 1О мМ трис-НС1, 1,5 мМ ЭДТА и 0,027 азида Na. Полученную массу осаждали при 105000р в течение 1 ч, осадок отбрасывали и в дальнейшем использовали супернатант, содержащий 4,5 мг белка/мл.
Полученный супернатант обрабаты- 10 о вали в течение 1 ч при 0 С свежеприготовленным раствором трипсина (8 мг/мл 1 мМ НС1) из расчета 20 мкг трипсина на 1 мг белка и затем соевым ингибитором трипсина из расчета 15
2 мкг ингибитора на 1 мг трипсина (для прекращения гидролиза).
В полученный гидролизат добавляли меркаптоэтанол до концентрации
1 мМ и затем при 0 С насыщенный 20 раствор сульфата аммония (в 1 мМ ЭДТА и 1 мМ меркаптоэтанола) до 207 по объему. Эту смесь в течение 40 мин размешивали на магнитной мешалке для формирования белкового осадка, и центрифугировали 15 мин при 1000g.
Осадок отбрасывали, а к супернатанту добавляли насыщенный раствор сульфата аммония в ЭДТА и меркаптоэтаноле до 40Х концентрации по объему. З0
Белковый осадок из этой смеси формировали на магнитной мешалке и осаждали центрифугированием. Надосадочную жидкость отбрасывали.
Полученный осадок растворяли в буфере, содержащем 10 мМ трис-НС1 (рН 7,4), 1,5 мМ ЭДТАи 1 мМ меркаптоэтанола (ТЭМ). Специфический рецепторный белок к прогестерону выделяли из этого раствора путем гель-фильтра- 40 ции на колонке (1100 х 20 мм с охлаждением) с сефадексом Г-150. Фракции, содержащие специфический рецепторный белок к прогестерону (присутствие этого белка определяли с помо- 45 щью способа рецепторно-люминесцентного анализа) собирали, концентрировали через мембранный фильтр "Амикон" и дальнейшую очистку проводили методом изотахофореза в колонке 200х х 20 мм с охлаждением в полиакриламидном геле (Т=5,2Х, С=Э ), содержащем 8М мочевину, 60 мкл амфолинов (pH 6-8) на 1 мг белка. Ведущим буфером был трис-фосфатный (рн 6,6), замыкающим электролитом — трис-E. ——
-аминокапроновый (pH 8,9), элюционным буфером — ведущий буфер, содержащий 1 мМ меркаптоэтанола. На колонку наносили около 80 мг белка сила то1 ка составляла 5 мА/см геля, скорость элюции 15 мл/ч. Время разделения (вьжод фракции с необходимым рецепторным белком) не превышало 22 ч.
После изотахофореза препараты, содержащие специфический рецепторный белок к прогестерону, концентрировали через мембранный фильтр "Амикон" и наносили на колонку (16x31 мм с охлаждением) с ДЕАЕ целлюлозой (ДЕ-52
Whattnan), уравновешивали ТЭМ буфе- . ром. Ионно-обменную хроматографию проводили ступенчатой элюцией ТЭМ буфером и ТЭМ буфером, содержащим
0,15 М КС1. В белковый раствор, элюированный в присутствии КС1 при
0 С добавляли нейтральный формалин до концентрации 0,57 и через 45 мин выделенный белок концентрировали на мембранном фильтре "Амикон" (для удаления триса и НС1) и лиофилизировали. Лиофилиэированные препараты белков-рецепторов к прогестерону хранили в холодильнике и использовали для определения прогестерона в биологических жидкостях и тканях.
Кажду партию лиофилизированного препарата специфического рецепторного белка к прогестерону (СРБ) проверяли на титр связывания прогестероном, меченым люминолом (ПЛ). Для этого навеску сухого СРБ растворяли в
0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 7,5, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,17 аэида натрия (НЭА буфер), и титровали со
100 мкл ПЛ. Концентрацию СРБ, связывающую 507 гормона в пробе с 500 пг
ПЛ, испольэовали в дальнейших анализах как рабочую концентрацию.
Пример 2. Определение содержания прогестерона в сыворотке крови.
Для исследования брали образцы сыворотки крови трех женщин (16 недель беременности) объемом по 0,5 мл, коо торые охлаждали до 4 С, и из каждого образца отбирали по 100 мкл в инкубационные пробирки для последующего анализа.
Для построения калибровочной кривой готовили контрольные образцы, содержащие 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 и 10000 пг (пикограмм/мл) прогестерона, по 100 мкл которых также отбирали в инкубационные пробирки.
В отобранные исследуемые и контрольные пробы добавляли по 100 мкл раствора прогестерона, меченого люми .
5 14906 иолом (IUI) содержащего 500 пг/мл
ПЛ, и по 100 мкг раствора, содержащего специфический рецепторный белок к прогестерону (выделенный из дециду
5 альной ткани, как описано н примере 1) в количестве 1, 1 мг/мл, обеспечивающем связывание 507. ПЛ в пробе, содержащей 500 пг ПЛ (см.пример 1).
Полученные смеси инкубировали при 4 С и встряхивании в течение
60 мин (во время инкубации происходит образование комплекса прогестеронрецепторный белок).
Для отделения прогестерон-рецептоного комплекса от свободного прогестерона и остальных компонентов сыворотки крови в каждую проинкубированную пробу добавляли гидроксилапатит в количестве 30 мкг и выдержио вали при 4 С в течение 10 мин. Проинкубированные пробы — гидроксилапатит с прогестерон-рецепторным комп- 25 лексом — наносили на фильтры (каждую на 1 фильтр) и промывали холодным НЭА буфером (0,1 М натрий-фосфатный буфер рН 7,5, содержащий 1 мМ
ЭДТА и 0,1Х азида натрия). Затем
30 каждую пробу переносили (вместе с
Сравнительная характеристика специфичности и чувствительности способов РИА и РЛА при определении прогестерона
Количество измерений
Исследуемая среда
Количество прогестерона, мг/мл
Стандарт минимальное
О, 16т0,01
О, 16 -0, 008 количество
Беременность:
9 недель
16 недель
24, 114.1, 93
40,86+3,61
23,47 0,96
39,62+1,79
I исследуемую пробу по 100 мкл 10 М пероксидазы хрена и 10 Г1 Н О и сра-3 эу же измеряли в люминометре интенсивность люминесценции каждой иэ проб эа период 20 с.
Из таблицы видно, что при количе55 ственном определении прогестерона в стандартных растворах точность, а следовательно, и специфичность РЛА и РИА почти одинаковы, Однако, при определении гормона в сыворотке кроI
Содержание прогестерона в сыворотке крови определяли методами РИА и
РЛА у 8 женщин, имеющих 9 недель беременности, и у 8 женщин, имеющих ,16 недель беременности.
В каждый флакон добавляли по
10 мкл 5 N NaOH и инкубировали при
60 С 60 мин. Пробы охлаждали до комнатной температуры, отбирали иэ них для дальнейшего исследования по
300 мкл жидкости, добавляли в каждую
50 е фильтром) в отдельный флакон и заливали НЭА буфером (по 200; кл в каждую пробу).
Для отделения изолюминола от прогестерон-репептарного комплекса к пробам добавляли по 100 мкл 5 М о
Na0H и инкубировали при 60 С
60 мин, Пробы охлаждали до комнатной температуры, отбирали по 300 мкл (пилеткой с фильтром) и помещали их в кюветы люминометра.
Затем в пробы добавляли до 100 мкл
10 М раствора пероксидаэы хрена и
5 не позже чем через 30 с вносили по
100 мкл 10 М Н О, Интенсивность хемолюминесценции измеряли в люминометре в течение
20 с и полученные значения испольэовали для построения калибровочной кривой (зависимость интенсивности люминесценции от концентрации прогестерона в контрольных пробах) и определения количества прогестерона в пробах сыворотки крови обследуемых женщин.
Минимальное количество прогесте— рона, определяемое в стандартных пробах различными способами, представлено в таблице, 1490650 ви беременных женщин (различных сроков беременности) специфичность РЛА более, чем в 2 раза выше специфичСоставивитель M.Ïóñòûííèêîâ
Редактор А.Лежнина Техред Л.Олийнык Корректор М.Максимишинец
Заказ 3751/54 Тираж 789 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101 ности РИА.
Формула изобретения
Способ количественного определения стероидных гормонов путем обработки сыворотки крови гормонсвязывающим веществом в присутствии меченых стероидных гормонов, удаление свободных гормонов с последующим определением количества метки во фракции связанных с антителами гормонов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве гормонсвяэывающего вещества используют рецепторный белок иэ децидуальной ткани, а для удаления свободных гормонов используют гидроксилапатит.
