Способ подготовки к исследованию инвазионного материала

 

Изобретение относится к биологии, касается медицины и ветеринарии, предназназеноЗ для установления антихолинэстерального механизма действия антигельминтиков и целенаправленного отбора средств, парализующих функ г ции нервно-мьппечного аппарата гелвминтов. Цель изобретения - упрощение и ускорение способа исследования за счет сокращения количества стадий. Для этого половозрелые гелвминты промьшают в теплом () физрастворе м фиксируют 24 ч в 10%-ном растворе формалина, приготовленном на физрастворе . После фиксации промывают в физ растворе с частой сменой его .(каждые 10 мин). Перед помещением в Ьикуба-- ционную среду фасциол споласкивают дистиллированной водой. Инкубацию проводят 24 ч при 18-22 0. Q « (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) y1) 4 G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР.

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3838965/28-14 (22) 08.01.85 (46) 15.07.88.Бюл. У 26 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт гельминтологии им.К.И.Скрябина (72) Г.К.Резник и Д.А;Пакятурене (53) 612.015 (088.8) (56) Gerebtzoff М,- Cholinesterases.

International series of monographs

on pure and applied biology, 1959, ч.3, р.9-25. (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ К ИССЛЕДОВАНИЮ ИНВАЗИОННОГО ИАТЕРИАЛА .(57) Изобретение относится к биологии, касается медицины и ветеринарии, пред.йазначено,1 для установления антихолинэстерального механизма действия антигельминтиков и целенаправленного отбора средств, парализующих функ ции нервно-мышечного аппарата гелвминтов. Цель изобретения - упрощение и ускорение способа исследования за счет сокращения количества стадий.

Для этого половозрелые гелвминты промывают в теплом (37 С) физрастворе о .и фиксируют 24 ч в 10Х-ном растворе формалина, приготовленном на физрастворе. После фиксации промывают в физ" растворе с частой сменой его .(каждые

10 мин) . Перед помещением в инкуба-ч"i ционную среду фасциол споласкивают дистиллированной водой. Инкубацию проводят 24 ч при 18-22 С.

1409927

Изобретение относится к биологии, в частности к медицине и ветеринарии, и может быть использовано для установления антихолинэстерального механизма действия антигельминтиков и целенаправленного отбора средств, парализующих функции нервно-мышечного аппарата гельминтов.

Цель изобретения — упрощение и ускорение способа исследования за счет сокращения количества стадий.

Способ осуществляют следующим образом.

Материалом для исследования слу". жат подвижные половозрелые гельминты, которых сразу же после извлечения.промывают в теплом (37 С) физрастворе, фиксируют в течение 24 ч в 10 -ном. растворе формалина, при- 20 готовленном на физрастворе, После фиксации промывают 6 ч в физрастворе с частой его сменой (каждые 10 мин)

Перед помещением в инкубационную среду фасциол споласкивают дистилли- 25 рованной водой.

Инкубационную среду готовят перед употреблением, используя заранее заготовленные навески, которые могут продолжительно храниться. На 1 половозрелый организм расходуют 1 порцию инкубационной среды, в которую его помещают целиком (беэ изготовления срезов) . Для получения 1 порции (5,45 мл) инкубационной среды с рН

5,6-5,8 сначала готовят 1,6 мл бу35 фера, растворяют заранее заготовленные навески (135 мг ацетата натрия в 1,5 мл дистиллированной воды) и добавляют 0,15 мл раствора уксусной кислоты, приготовленной тут же путем разведения 0,03 мл ледяной уксусной кислоты в 1 мл дистиллированной во- ды. Иэ остальных навесок ингредиентов среды также готовят растворы из

45 расчета на 1 мл дистиллированной воды: 20 мг ацетата меди, 19 мл гликокола, 7 мг ацетилтиохолина (АТХ).

Далее в стаканчик с 1,6 мл буфера добавляют О,1 мл раствора ацетата меди, 0,2 мл раствора гликокола, фильтрованный раствор субстрата и

2,5 мл дистиллированной воды. Для получения фильтрованного раствора субстрата к 1 мл pBcTBopBHHoro АТХ добавляют О, l 3 мл раствора ацетата меди и спустя 3 мин фильтруют его через смоченный водой фильтр. Инкубацию проводят

24 ч при комнатной температуре, Для оценки активности холинэстера-. зы в различных ткаиевых структурах необходима обработка фасциол IХ-ным раствором сульфида натрия, благодаря чему белого цвета осадки конечного продукта реакции — тиохолина меди - в местах нахождения холинэстеразы окрашиваются от светло-коричневого (слабая активность) до черного цвета (высокая активность).

После многократной промыйки в дистиллированной воде (в течение 20 мин) фасциол, обработанный IХ-ным раствором сульфида натрия (или необработанный им) фиксируют 18 ч в 20 -ном растворе формалина, снова. промывают

20 мин в воде и помещают для просветления и хранения в 75 -ный водный раствор глицерина, который легко or"" мывается водой, не влияя отрицательно на последующий этап обработки сульфидом натрия в случае хранения

"не проявленных" (не обработанных им ранее) фасциол.

Пример 1 . Материалом для ис" следования служат подвижные половозрелые печеночные сосальщики Dicrocoelium lanceatum, которых сразу же после извлечения из печени промывают в теплом (37 С) физрастворе, фик" сируют в течение 24 ч в 1 О -ном растворе. формалина, приготовленном на физрастворе. После фиксации дикроцелиев промывают 3 ч в физрастворе с частой его сменой (каждые 20 мин).

Перед помещением в инкубационную среду дикроцелиев споласкивают дистиллированной водой.

Инкубационную среду готовят такде как в примере 1. На 10 половозрелых дикроцелиев расходуют I порцию инкубационной среды, в которую их помещают целиком (без изготовления срезов) . Инкубацию проводят 24 ч при комнатной температуре.

Для оценки активности холинэстеразы в различных тканевых структурах необходима обработка дикроцелиев

I -ным раствором сульфида натрия, благодаря чему белого цвета осадки тиохолина меди в местах нахождения холинэстеразы окрашиваются от светло-коричневого (слабая активность) до черного цвета (высокая активность):

После иногократной. промывки в дистиллированной воде (B течение 20 мин) дикроцелиев, обработанных IХ-ным раствором сульфида натрия (или необ1409927

Формула изобретения

Способ подготовки к исследованию инвазионного материала путем взятия биообъекта, фиксации, промывки, приготовления серийных срезов, окрашивания с применением сернистого натрия, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа

sa счет сокращения количества стадий, промывку ведут 3-6 ч,,а окрашивание проводят при комнатной температуре в цельном биообъекте.

Составитель Е.Колмакова

Редактор И.Касарда Техред М.Дидык Корректор М.Шароши, Заказ 3474/40 Тираж 847 Подписное

ВНИИЛИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 работанных им), фиксируют 6 ч в 20Хном растворе формалина, снова промыI вают 20 мин в воде, и помещают для просветления и хранения в 75Х-ный

5 водный раствор глицерина, который легко отмывается водой, не влияя отрицательно на последующий этап обработки сульфидом натрия в случае хранения не обработанных им ранее 1р

"непроявленных" дикроцелиев.

Пример 2. Материалом для исследования служат половозрелые фасциолы, извлеченные из печени двух экспериментально зараженных овец ли- 15 товской черноголовой породы, одной из которых через рот был введен однократно ацемидофен в дозе 150 мг/кг, а другая служила нелеченным котролем.

Обе овцы были убиты спустя 28 ч пос- 20 ле дегельминтизации первой из них.

Фасциол, извлеченный из печени, промывают в теплом (37 С) физрастворе и фиксируют 24 ч в 10Х-ном растворе формалина на физрастворе, затем про- 25 мывают их в физрастворе в течение 6 ч, сменяя его каждые 10 мин. Перед йомещением в инкубационную среду фасциол ополаскивают дистиллированной водой. Приготовление З0 инкубационной среды, а также процесс проведения гистохимической реакции такие же, как в примере 1.

Об антихолинэстеразном действии ацемидофена на нервно-мышечный аппарат фасциол судят по разнице в интенсивности окраски ферментосодержащих структур у интактных и подвергшихся действию ацемидофена трематод.. Устанавливают, что ацемидофен избирательно действует на ротовой аппарат . фасциол, угнетая холинэстеразу в тканях ротовой присоски и полностью ингибируя ее в тканях глотки. В связи с этим не только нарушаются пищеварительная и эвакуаторная функции, но фасциолы утрачивают способность прикрепляться к тканям хозяина и вымываются из печени током жел-. чи еще живыми, но парализованными.