Штамм бактерий aerococcus viridans для получения клонов с оксидазной и редуктазной активностью

 

Изобретение относится к м йкро .биологии и касается получения KvjTbTyp с повьшенной способностью к jn популяции и повышенной биологической активностью. Цель изобретения - получение штамма бактерий для получения клонов с повышенной способностью роста популяции и повышенной оксидазной и редуктазной активностью. В качестве культуры для селекции клонов с повышенной биологической активностью используется штамм Aerococcus (Мусосос- CUS hyperoxydans) ВНИИА - 1730 (Коллекция микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков), который дает клоны с повышенной оксидазной и редуктазной активностью. 5 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51)4 С 12 N 1 20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ / ":К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21). 4094491/28-13 (22) 16. 07. 86 (46) 30.06.88. Бюл. Ф 24 (71) Днепропетровский медицинский институт (72) Г.Н.Кременчуцкий (53) 557.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 1137763, кл. С 12 P 1/04, 1984. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ AегоCOCCUS VIRIDANS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КЛОНОВ С ОКСИДАЗНОЙ И РЕДУКТАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Изобретение относится к микро" биологии и касается получения культур с повышенной способностью к р

„„SU„„1406156 А 1 популяции и повышенной биологической активностью. Цель изобретения — полу" чение штамма бактерий для получения клонов с повышенной способностью роста популяции и повышенной оксидазной и редуктазной активностью. В качестве культуры для селекции клонов с ловышенной биологической активностью используется штамм Aегоcoccus (Mycococcus hypегоxydans) ВНИИА — 1730 (Коллекция микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков), который . дает клоны с повышенной оксидазной и редуктаэной активностью. 5 табл.

1406156

Изобретение относится к микробиологии и касается получения штамма, который может быть использован для селекции клонов с повышенной оксидаз5 ной и редуктазной активностью.

Целью изобретения является получение штамма бактерий для получения клонов с повышенной способностью роста популяции и повышенной оксидаэной и редуктазной активностью.

Штамм Aегоcoccus viridans (Mycococcus hypегоxydans) ВНИИА У 1730 (GK 308) получен в результате отбора негемолитической колонии на 37-ном 15 кровяном мясо-пептонном агаре среди колоний естественного рассева Mycococcus hypегоxydans 167ЧК. Из отобранной негемолитической колонии получена чистая культура при ее пересеве 20 на мясо-пептонный агар, содержащий

107 лошадиной сыворотки.

Штамм Aегоcoccus viridans (Mycococcus hypегоxydans) GK308 депонирован в коллекции микроорганизмов ВНИИ 25 антибиотиков под номером 1730. Штамм имеет характерные свойства.

Морфологические признаки. Полиморфен, Основные структуры — кокки удлиненной овоидной формы, грамположи- 30 тельные, неподвижные, При электронномикроскопичеcKом исследовании видны нежные капсулы и внутри клеток крупные включения неправильной формы.

При выращивании на средах, обогащенных лошадиной сывороткой, клетки однородно вытянуты и не отличаются полиморфностью. При выращивании штамма на мясо-пептонном агаре и средах, обедненных белком, клетки отличаются 40 значительной полиморфностью: изменяется форма клеток, их расположение.

Клетки приобретают неправильную кокковидную форму, овоидную, гантелевидную, булавовидную, зернистую фор- 45 му. Клетки могут располагаться беспорядочно, скоплениями, в виде "частокола, розеток", могут располагаться по кольцу.

Размножение: поперечное деление, дробление.

Культуральные свойства. Скудно растет на мясо-пептонном агаре в виде мелких (0,5 — 1,0 мм в диаметре) плос— ких бесцветных колоний круглой формы, плотной консистенции, Поверхность тусклая, сухая, края рсвные сглажен. ные к поверхности среды. Структура гомогенная или зернистая. Наблюдается врастание в среду.

Хорошо растет на мясо-пептонном агаре с добавлением 10/ лошадиной сыворотки с формированием изолированных или сливающихся колоний размером 23 мм в диаметре, круглой формы, слизистой консистенции, блестящие.

Хорошо растет на мясо-пептонном агаре с добавлением 0,27. лизоцима.

Характеристика роста такая же, как на мясо-пептонном агаре с добавлением лошадиной сыворотки.

На 3/-ном кровяном мясо-пептонном агаре рост скудный без проявления гемолиза и изменения цвета окружающей среды.

Теллуристый калий, добавленный в мясо-пептонный агар в концентрациях

0,01-0,05/, не угнетает рост штамма.

Селенисто-кислый натрий, добавленный в среду в концентрации 0,057, подавляет рост штамма.

При росте в мясо-пептонном бульоне с добавлением 107 лошадиной сыворотки штамм формирует придонный и пристеночный осадок с одновременным гомогенным помутнением среды.

Штамм хорошо сохраняется на твердых питательных средах: мясо-пептонном агаре, мясо-пептонном агаре с

10/ лошадиной сыворотки и соответствующих жидких питательных средах в течение 2-3 мес при 4 С. Штамм хорошо а хранится в лиофильно-высушенном сос-. тоянии, не теряя своей жизнеспособности, по имеющимся данным, в течение

6 лет.

Физиологические и биохимические признаки. В качестве источников углерода штамм утилизирует: глюкозу, арабинозу„ рамнозу, сорбит, лактозу, инозит, ксилозу, дульцит, маннит, сахарозу. Не утилизирует мальтоэу.

ДНК штамма содержит 35-427 Г+Ц, Нет цитохром-оксидазной системы и гемсодержащих каталазы и пероксидазы.

Хорошо восстанавливает теллур из теллуристого калия и не восстанавливает селен из селено-кислого натрия.

Оптимальная температура роста о

37 С, температурный интервал роста

20-40 С, время роста 20-24 ч (зависит от вида питательной среды). Перекись водорода не продуцирует. Не является

in vitro антагонистом бактерий.

Отношение к антибиотикам: резистентен к стрептомицину — минимальная

1406156

Mycococcus hypегоaydans 167VR, но отличаются по преимущественному выражению оксидазнрй или редуктазной активности.

Колонии-ревертанты вырастают на среде на 5-10-е сутки. При повторных пересевах рост клонов стабилизируется в течение первых же пересевов и равен

24-48 ч. !

В табл.1 приведена сравнительная характеристика штамма Aегоcoccus viridans (Mycococcus Ьуpегоxydans)

GK 308 и исходного штамма Mycococcus

hvpегоxydans 16.7 VR

Таблица1

GK 308

167 VR

Свойства

Морфология клеток при росте на мясопептонном агаре

Кокки, располагающиеся тетрадами и скаплениями, неправильной формы, грамположительные

Морфология та же (MIIA) MIIA с 10% лошадиной сыворотки

Характер роста на:

MIIA

Рост хороший, колонии (1-2 мм в диаметре) с ровными краями, выпуклые, несливающиеся

Рост скудный.

Мелкие точечные колонии

Рост скудный, в виде налета, точечные уплощенные колонии с тенденцией врастания в среду

МПА с 10/ лошадиной сыворотки

MIIA (мясо-пептонный бульон) Рост хороший в виде пристеночного и придонного осадка

Рост хороший, крупные (2-3 мм в диаметре) колонии красного цвета

Рост хороший, колонии среднего размера (1-2 мм в диаметре), неокрашенные

Рост отсутствует

MIIA с 0105% селенистокислого натрия

MIIA с 0,01 теллуристого калия

M1IA с 0,05/ теллуристого калия

MIIA с З крови

Рост хороший. Колонии черного цвета (1-2 мм в диаметре)

Рост очень скудный.

Рост обильный. подавляющая концентрация антибиотика (МПК) равняется 61,44 мкг/мл; к лизоциму (MIIK-3000 мкг/мл); диоксидину (M1IK - 500 мкг/мл); димексиду (MIIK—

3000 мкг/мл). К остальным препаратам чувствителен.

Изменчивость. Штамм обладает повышенной изменчивостью морфологии клеток при выращивании на питательных 10 средах, обедненных белком.

При высеве популяции штамма на питательную среду (мясо-пептонный агар) вырастают колонии — ревертанты, клОны из KOTopbIx близки по мОрфОлоги- 15 ческим свойствам к исходному штамму

Кокки, вытянутые кокки, овоиды, гантелевидные, булавовидные клетки, зерна,грамположительные

Однородные вытянутые кокки, овоиды

Рост обильный, сливной. Крупные (2-3 мм в диаметре) колонии с ровными краями

Рост хороший в виде гомогенного помутнения, пристеночного и придонного осадка

Рост скудный, точечные бесцветные коло-. нии

Рост средний, колонии среднего размера (0,5-1,5 мм в диаметре, неокрашенные) 1406156.6

Продолжение табл, 1

Крупные колонии Точечные колонии. (2-3 мм в диамет- Зеленение среды отре), зеленящие сутствует кровяной агар

Рост

Рост

Рост

Рост

Нет

Устойчив

Нет

Устойчив

Нет

Нет

5е5 — ЬрО

Не разжижает

5,8 — 6,1

Не разжижает

Не гидролизует Не гидролизует

Не гидролизует Не гидролизует

Способность расти в присутствии 40%: желчи при рН 9,6 при 45 С

Усточивость к выдерживанию: при 60 С

30 мин в 15%-ном растворе Н О . MIIK веществ, мк г/мл;

Пенициллин

Оксациллин

Метициллин

Стрептомицин

Лизоцим

Биклиноциклин

Карбенициллин

Целоспор

Кефлин

Цефалотин

Полимиксин

Рифампицин

Нитроксолин

Грамурин

Хиноксидин

Диоксидин

Невиграмон

Димексид

Восстановление 1%— ной метиленовой сини в молоке

Конечное рН в

1Х-ном глюкозном бульоне

Желатина

Гидролиз:

Аргинина

Крахмала

Утилизация углеводов:

Арабиноза

Рамноза

Инозит

Ксилоза

Сорбит

Дульцит

Глюкоза

500

500

3,84

2000

250

61,44 3, 84

3,84

30,72

30,72

500

500

15,36

500

500

1000

30,72

750

О, 12

0,12

0112

61, 44

0,12

0,12

0,12

0,12

0,12

0,12

О, 12

0,12

0,12

0,12

1,92

2000

1406156

Продолжение табл. 1

Лактоза

Мальтоза

Маннит

Сахароза

Содержание Г+Ц в

ДНК, штаммов, %

30 — 42

35 — 42

Питательная среда

167 VR GK 308

Мясо-пептонный агар (МПА)

МПА+10% лошадиной сыворотки

МПА+0,2% лизоцима

ИПА+3%

0,8 + 0,1 0,3 + 0 05

0,08+0,01 3,1 + 0,2

0,03+0,006 2,3 + О, 31

1,3 + 0,1 0,16+0,02 крови в популяциях

167 VR СК 308

Характерный рост для основной массы популяции

1 ° 10 — 1,2 ° 10

Не выражен

Неокрашенные колонии без цветной реакции

Красные колонии без цветной реРедуктаэный акции

Красные колонии с черной зоной

3,2 10 -1 -10

Оксидазноредуктазный

Штамм GK 308 при выращивании на мясо-пептонном агаре с добавлением

10% лошадиной сыворотки дает обильный рост, значительно превышающий рост известного штамма.

В табл.2 представлены сравнительные данные о способности роста штаммов 167VR и GK 308 при росте на разных питательных средах.

Т а б л и ц а 2

Данный штамм является продуцентом, широкого спектра клонов с разной выраженностью оксидаэной и редуктазной

Вид колоний Вид активности активности. Разная оксидазная и редуктаэная активность получаемых клонов отражается на их свойствах. Чис

15 тые культуры с преимущественной оксидазной активностью характериэуются усилением продукции перекиси водорода, превышающей этот признак известного штамма (до 9,8 мМ вместо 2,1мМ соответственно), повышенным антагонизмом против патогенных бактерий.

Чистые культуры с преимущественно выраженной редуктазной активностью

25 характеризуются слабой продукцией перекиси водорода (до 0,01 мМ) и вместо с тем сильной антагонистической активностью против патогенных бактерий.

Повышенная изменчивость штамма

З0 GK 308 проявляется в появлении разного типа колоний при его рассеве на питательной среде для индикации оксидазной и редуктазной активности микроорганизмов, продуцирующих пере35 кись водорода.

B табл.3 представлены данные о частоте колоний разного типа в есте40 ственном рассеве исходного 167VR и предлагаемого GK 308 штаммов.

Т аб лица 3

|Частота измененных колоний

1406156

Продолжение табл. 3

Вид актив- Частота измененных колоний ности в популяциях

Вид колоний

167 VR GK 308

Окраски вокруг

Бесцветные

Оксидазный

Характерный рост для основной массы популяции

Т а б л и ц а 4

Вид актив- Уровень ности продукции

H202 MM

Оксидазный 2,1 0,3

167 ЧК

GK 308

Оксидазный клон

Редуктазный

50 клон

Оксидазно-редуктазный клон

Не выражен

9,8+2,3

Оксидазный

Редуктазный

Оксидазно0,1 + 0,01

0,5 + 0,021,7+0,4 редуктазный колонии с черной зоной окраски вокруг

Черные коло- Оксидазный нии без зоны окраски вокруг

Черные коло- Оксидазный нии с черной зоной окраски вокруг

Пример 1.. Культуру Aегоcoccus viridans (Mycococcus hypегоxydans) GK 308 выращивают на мясо-пептонном агаре с 10% лошадиной сыворотки. Суспензию суточной культуры проращивают в жидкой питательной среде о в стационарных условиях при 38 С в течение 10 ч при начальной концентрации клеток 1 ° 10 -1 -104 на 1 мл среды.

Производят высев проращиваемой суспензии на питательную среду для индикации оксидазной и редуктазной актнвности микроорганизмов, продуцирующих перекись .водорода. Посевы ино кубируют в течение 6 суток при 37 С.

После инкубации отбирают выросшие колонии с преимущественно выраженной оксидазной или редуктазной активностью. Для получения клонов колонии отсевают на скошенный мясо-пептонный агар и посевы инкубируют в течение

36 ч при 37 С. Полученные клоны подвергают исследованию.

Для изучения вида преимущественной активности полученных клонов производят посев штрихом суспензий суточных культур (10 клеток на 1 мл физиоло1 гического раствора натрийхлорида) на питательную среду для индикации оксидазной и редуктазной активности микроорганизмов, продуцирующих перекись водорода. Посевы инкубируют в термостате в течение 36 ч при 37 С, после о чего производят учет результатов. . Клоны с преимущественной оксидазной активностью дают рост средней интенсивности с окрашиванием в черный цвет

25 штриха растущей биомассы и питательной среды вокруг. Клоны с преимущест. венной редуктазной активностью дают хороший рост с интенсивным красным окрашиванием штриха биомассы.

30 Пример 2. Исследуют уровень продукции перекиси водорода у полученных клонов. Штамм GK 308 перекись водорода не продуцирует.

В табл.4 представлены данные о продукции перекиси водорода известным штаммом 167 VR и клонами, полученными из штамма GK 308.

Пример 3. Определяют антагонистическую активность полученных клонов in vitro в отношении патогенных бактерий родов: Proteus, Pseudomonas, Staphylococcus.

1406 156

12 суспензиями тест-бактерий. После

24-часовой инкубации учитывают зоны подавления роста. тивностью, Т а б л и ц а 5 е

Штамм

Зоны подавления роста, мм, культур

Pseudomonas Staphylococcus

41 культура 30 культур

Proteus

5 культур

167 VR

9,2+ 2,2

7,2+ 1,1

7,9+0,6

31,1 + 1,5

29,7+ 1,3

21 + 1,2 15,3+ 2,3

18,6 2,1

13,2 «+ 1,7

18,1 2,3 14,0 + 1,5 30,7 + 2,5

Преимущества штамма Aerncoccus

viridans (Mycococcus hypегоxydans)

GK 308 заключается в повышенной возможности селекции широкого спектра клонов с преимущественным выражением оксидазной или редуктазной активности, что позволяет рассматривать его

Составитель В.Соина

Редактор Н.Швыдкая Техред А.Кравчук Корректор И.Эрдейи

Заказ 3157/23

Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

ll3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

11

Для определения антагонистической активности полученных клонов производят штриховой посев суспензий их суточных культур (1 млрд. клеток на

1 мл физиологического раствора натрийхлорида) на поверхность мясо-пептонного агара. Посевы ин1субируют при

37 С 24 ч. В герметичных камерах, исключающих контаминацию окружающей среды, производят опыление посевов

GK 308

Оксидаэный клон

Редуктазный клон

Оксидазноредуктазный клон.в

В табл.5 приводится характеристика антагонистической активности полученных клонов в сравнении с известным штаммом 167 VR. Штамм GK 308 не обладает in vitro антагонистической аккак базовый штамм для селекции биологически активных культур.

Формулаизобретения

Штамм бактерий Aегоcoccus viridans

ВНИИА У 1730 для получения клонов с оксидазной и редуктазной активностью,