Способ определения ферментов, обладающих амидазной активностью
Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к способам анализа ферментов, гидролизующих амидные связи. Пель - повъшение чувствительности способа определения. Способ заключается в том, что для определения амидазной активности ферментов к термостатированному водному раствору субстрата - 1 -(аминоацил)- -аминонафталин-5-сульфамида добавляют известное количество препарата фермента и полученный раствор инкубируют при постоянной температуре в течение фиксированного.интервала времени, после чего добавляют раствор проявителя , содержащий диазоль, например борфторид нитрофенилдиазония,и кислоту , останавливающую действие фермента . Полученный раствор красителя помещают в кювету спектрофотометра и определяют оптическую плотность в максимуме поглощения красителя. По величине оптической плотности рассчитывают количество продукта «реакции и далее активность фермента, сравнивая ее со стандартным образцом. 1 табл. (Л со ел ОО 00
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (19) (11) (51) 4 С 12 Я 1/00
ОПИСЛНИК HSOEPETEHHR
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4021732/31-13 (22) 10.02.86 (46) 23. 11.87. Бюл. Р 43 (71) Институт молекулярной генетики
АН СССР и 1-й Московский медицинский институт им. И.M.Ñå÷åíoâà (72) А.А.Недоспасов, В.Н.Незавибатько, А.Д.Яхимович, Т.Д.Большакова, В.А.Кузнецов и А.Я.Смоляницкий (53) 577. 15 (088.8) (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АМИДАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к способам анализа ферментов, гидролизующих амидные связи. Цель — повышение чувствительности способа определения.
Способ заключается в том, что для определения амидазной активности ферментов к термостатированному водному раствору субстрата — 1 -(аминоацил)-аминонафталин-5-сульфамида добавляют известное количество препарата фермента и полученный раствор инкубируют при постоянной температуре в течение фиксированного интервала времени, после чего добавляют раствор проявителя, содержащий диазоль, например борфторид нитрофенилдиазония,и кислоту, останавливающую действие фермента. Полученный раствор красителя помещают в кювету.спектрофотометра и определяют оптическую плотйость в максимуме поглощения краситепя. По величине оптической плотности рассчитывают количество продукта реакции. @ и далее активность фермента, сравнивая ее со стандартным образцом.
1 табл. С:
13
Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к способам анализа ферментов, гидролиэующих амидные связи, Цел ь изобретения — повьнпе ние чувствительности способа.
Способ заключается в расщеплении под действием определяемого фермента аминоациламино-нафталинсульфамидов и спектрометрическом определении образующихся амино-нафталинсульфамидов цветной реакцией с солями арилдиазония, например 4-сульфофенилдиазония или 4-нитрофенилдиаэония.
Для определения амидаэной активности ферментов по предлагаемому способу к термостатированному водному раствору субстрата-1-(аминоацил)—
-аминонафталин-5-сульфамида, содержащему компоненты, необходимые для нормального функционирования фермента (например, соли, поддерживающие оптимальное значение рН), добавляют известное количество препарата .фермента, Полученный раствор инкубируют при постоянной температуре в течение фиксированного интервала времени, после чего добавляют раствор проявителя, содержащий диазоль, например борфторид нитрофенилдиазония, и кислоту, останавливающую действие фермента. Полученный раствор красителя помещают в кювету спектрофотометра и определяют оптическую плотность, предпочтительно, в максимуме поглощения красителя, используя в качестве раствора сравнения аналогичный по составу раствор, в который фермент был добавлен лишь после добавления проявителя. По величине оптической плотности рассчитывают количество продукта реакции и далее активность фермента, сравнивая ее со стандартным образцом.
Пример 1. Определение активности трипсина с использованием ,1-(N-карбобенэоксиаргинил)-аминонафу s талин-5-(N N -пентаметилен) -сульфамида.
Готовят следующие рабочие растворы.
P аствор 1 ° 1мИ 1-(N-карбобензоксиаргинил)-аминонафталин-5- N, N-пента53809 2 метиленсульфамида в 0,1 M трис-HCI1 буфере рН 7,8.
Раствор 2. 1 мМ борфторида нитро5 фенилдиазония в 0 9 М уксусной кислоУ те.
К 1 мл термостатированного при
25 С раствора 1 добавляют 10 мкл раствора фермента, перемешивают ВСтряхиванием, инкубируют 20 мин, бавляют 1 мл раствора 2, через 5 мин определяют оптическую плотность при
500 нм, используя в качестве раствора сравнения инкубировавшуюся смесь
1 мл раствора 1 и 1 мл раствора 2, в которую фермент добавляют после приготовления смеси. Содержание фермента определяют иэ отношения оптических плотностей анализируемого и стандартного растворов.
Аналогичным образом могут быть определены амидаэные активности других ферментов, Результаты опытов приведены в
25 таблице..
Использование изобретения позволит повысить чувствительность определения амидазной активности ферментов, что особенно важно при проведении э0 клинико-лабораторных исследований.
Формула и э о б р е т е н и я
Способ определения ферментов, обладающих амидазной активностью, предусматривающий проведение ферментативной реакции гидролиэа аминоацильного производного соединения нафталинового ряда, азосочетание продукта реакции с солью диазония с последующей регистрацией поглощения света, отличающийся тем, что, с целью повьппения чувствительности способа, в качестве субстратов ферментов используют 1-(ами4> ноацил)-аминонафталин-5-сульфамиды общей формулы ьО где R — аминоацил, ациламиноацил, пентидил; — сульфамидная группа.! 31:!809
О
I vm o cd е О О О О CI
° Oa ф Е О Ф Ch м со л C»I м
О
О!
1 о
I ccc
1 «б
C»I C»I
0-\
1 I
1 и
1 1-» а
an о
М С»1 СЧ л л л м м м м м3 л м
an с»а
Й!
О О а an ю м
А н и х
v х
»
I о
v х
v х а
X CO
Ф л л
-х
О а
Х Ф
» и! ЛО
° х
О О, + c»c ю ф
О
О а
v.
I а 1 юи
»5( .Л !! 1
1 cd а
1 и аЕа
5*é х х хи !
Х cd й! уу
Ф 1 1
И
1 I о
1-л са хо о Х!
5»
cd
I4 63
I4 о э ахld
O dI O
cd
cd х о а
М х х
1 cO
X о
Р н х х
v х х а
1в
I e баd!
О ф an aO Л Co Ch а
X х
I а а о о, 3
1 а
1 Ф
I e
1 Е
IO
1 хс» И
O I х О \ х
v x
I4 Х
Щ 8
О cd о х е о а х ц an
О ах
1 3
Ф х &
Й 1» Х cd
СхОЕ
G х
v х а
dl
М
Х о аф
О
В х
О а
В м и х
1% о, 1 йо
Ф а ccCa Q
О О.m
v ф хих
1 а
0 ао
Ф ñî
Ф ел
О
Ф ЙЗ
О а
an
1 хх
Ю х .Я 1» х х о е о х
1 о х а
1 (Ч
CO ю
О Х а
