Штамм бактерий еsснеriснiа coli, используемый для изготовления антигена для диагностики колибактериоза птиц

А1!!9) (!1) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К д BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (- + Ф

) ; г.щ> 1! ссюз сОВетсних ),ф "," =:. СО!.1ИАЛИСТИЧННИХ ! ф - — — РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (46) 15.04.91. Бюл. В 14 (21) 3779778/15 (22) 10.08.84 (71) Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт Восточно-. го отделения ВАСХНИЛ (72 ) С. А, Ларин (53) 576.8.077.34:576,851,48 (088,8) (56) Справочник . Ветеринарные препараты, Под ред, Д,Ф,Осидзе, И.: Колос, 1981; с. 234-236, (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia cdli, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ КОЛИБАКТЕРИОЗА

ПТИЦ (57) Изобретение относится к ветеринарной микробиоло) ии. Целью изобретения является штамм ЕзсЬег1сЫа

coli ВГНКИ 1I 37-387-. а/14, обладающий высокой агглютинабельностью и широким набором О-антигенов. Штамм получен методом направленной селекции и последующего. отбора по агглютинабельности. Для получения диагностического антигена культуру штамма sa1 (51)5 С 12 N 1/20. А 61 К 39/108//

С 12 N I /20, С 12 R 1:19 севают иа поверхность мясопептонного агара. Инкубируют при 40 С в течение.

48 ч. Выросшую бактериальную массу отмывают физиологическим раствором центрифугированием при,5000 об/мин в,течение !5 мин. Надосадочную жидкость сливаю1, декантируют осадок буферным раствором с рН 6,9-7,1, Устанавливают концентрацию бактерий в пределах 18-20 млрд/мл микробных тел, Взкесь нагревают в течение 2 ч при 100 С, затем добавляют по 1 мл

20Х-ного раствора фенола и 40Х-ного раствора лимонно-кислого натрия на

100 мп антигена, Полученный антиген используют дпя постановки реакции агглютинацни .с целью диагностики колибактериоза птиц. Штамм обладает двадцатью двумя перекрестными О-антигенными связями наиболее распространенныж серогрупп кишечной палочки, что позволит сократить сроки диагностических исследований от 2-3 сут до

3-5 мин. 2 табл.

И э с б р е т е нтт e еo THo cHт с я:< в е терн и Фр" нОЙ микрОбнслагйи - B:зстнОсти K nc лучению штамма.„. Нспальэуемага для

1 юагностики колибактерноэа птиц и

5 выявления скрытых бзктерианасителей, Целью изОбретения явля ется штамм

Zscherichia co)i обладающий Высокой

ЯГГлютикабельнОстью и широким ИЯба рОМ 0-ЯнтигeHoB псэвсляющиЙ loJI HHTb ;0 эффективные диагностические биопрепараты.

Щтзмм +a che rich j лс 1 j P 380 тАПК т получен методом направленной селекЦии и последующего î-бора пс агглюти — 1 н Ябельна сти штамм Es chcrich i v co Il 380 "т,) К депонирован н коллекции микроорганиз- мов Всесоюзного государственного 20 научно-контрольногс института ветеринарных препаратов и имеет регистряциан птй номер 37-387-.Я/1ч, Штамм Escherichia сс Ы ВГ111И

iIl 37-387" à/14 характеризуется следующими приз някяъи, 1 тсрфслот ические признаки Яикрсбиые клетки полиморфные, годвнжные палочки с закругленными концами размером (0,5-0,.7)(1,ч-2,0) мк„ Спор и капсул ке образует пс м тоцу т рама окрашивается Отрицатель »о а

Культу ральные СБОЙства КультивиPУЕТСЯ K(G РЯЭЛИЧНЫХ ПИТЯ т ЕЛЬКтЫХ СРЕ "

В частности на МПА - мяс Опеп- Вт„. тонном агаре ИПБ — мясопептонком бульоне,, полужидком ИЛА — мясспептоьном arape агаре Энда при рН 6,9-7,2, Ба скошенном 11ПА растет в виде полупрозрачных cepoBGTblbl колоний с @О

Голубоватым оттенком., на среде Эндов виде мелких и крупных выпуклых колОний круГлОЙ фОрмы кряснОГО цветя

С МЕтаЛЛИЧЕСКИМ бЛЕСКОМ т ЦИТЯТЕЛЬНЪЬЙ

aràð вокруг колоний приобретает кра"ное окрашивание.

В МПБ образует равномерное помут-. нение питательной среды без образования пленки, иногда ксжвoa пристеночнОе ХОльЦО, Факультативнътй Яэрсб, ВО тт

Оптимальная температура раста 37-42 С прн рН- 6,9-7,2, Биохимические сВОйствЯ, ОблЯДает редуцирующей способностью навливает нитраты в чиэ.риты, образует HHpoJI р стВОраживя т молока Дя ет положительную реакцию с метиловым красным. Бе разжижает жепатику, Не ферментивует мочевину, ке усваивает

ЦитратаммОнийные сОли т, HP- Образует сероводорода

Отношение к спиртам„ Усваивает маннит, глицерин.

Отношение к углеводам. Расщепляет

Ярабиноэу, глюкозу, мзннит, рамноэу, к cHJIosy, мальта эу „сирбит с образованием ",àçà. Сахарозу расщепляет слабо.

HF ферметинтирует дул ьцит и ННОэит е

ЧУВСТВИТЕЛЕН K НЕСМИЦИНУ т, ЛЕВОМИ цетинуt, мскомицину» стрептомицин» fф-срмзлл ну.

Антнгенные свойства. Итамм имеет антигеннсе родство по откошению к

С-Янтигену к 22 серОварам эшерихий (015Ä 018, 026, 0„-36, 046, 050, 086, 0112, .0115 0117, 0118, 0119 0120, 0126., 0137, 0138, 0139, 0141, 0142, 0143, 0147, Oill8). . Культура штамма, взвешенная в фнэислаГическсм ряствОре хлОридз HGT= рия и "ðîãðåòàÿ при температуре 100 С в течение 2 ч; агглютинируется диаг" нсстическими 0-кслисывсротками и укаэячнътм Выше серогруппям кишечной палочки в титрах от i:200 дс 1:3200 с сценкой от ++ до ++++, В реакции агrJIIÎTHHGIlhH РА HG Стекле GrrJIl0THID:— руется укаэянным cblBOpoTKBNH B pasBe декиях 1:2 — i:10 в Виде мелких и крупных зерен, Взвешеннътх В капле исслеДуемОЙ смеси жиДкаcTeA

Актиген Еэс1тег1СЫЯ сс1 из штамма ВГИКИ Ит 37-387--а/IJl на Выявляет антител в антисыворотках сальмонелл, цитрабактер, протея в пластинчатой реакции агглютинации PA.

Пример 1. Культуру Kscherichia coli ВГНКИ Р 37-387-Я/14 засевяют ня ПОВерхнОсть мясОпептонйОГО агаря с содержанием аминного азота

От 250 до 300 мг/ К-мл, Инкубируют при 40 С 48 ч. дпя посева используют

2 "i" HGOQBую ЯГаравую куль туру Вэве пенную в физиологическом растворе хлориДЯ HatpHH ) В конЦентраЦии i 0 млрд/мл из расчета 0,01 мл взвеси на 1 см поверхности питательной среды о

JQpes 48 H Выросшую бактериальную

:;.а"су смытвают B гредварительна взвешенньe центрифужные стаканы и дважды

oTblblB al0T фиэиолО Гиче ским pact BopOM хлорида натрия В течение 15 мин при

5000 об/мии. После BTopox 0 IleHTpHфугирсвания сливают кядссадочную жидкость, взвешиваЮТ цектрифужные

cтaкaны с оставшейся в осадке бактериальной массой. Определяют вес биомассы культуры по разности весов стаканов с биомассой и пустых. Декантиpym осадок буферным раствором с рН

6;9-7,1 иэ расчета получения 3% взвеси сырой массы бактерий. При этом концентрация бактерий в препарате находилась в пределах 18-20 млрд/мп микробных тел. Приготовлениув взвесь нагревают в течение 2 ч при 100 С.

При прогревании биомассы бактерий учет времени производился с момента достижения температуры кипения. К полученному антигену добавлявт по

1 мл 20%-ного раствора фенола и 40%ного раствора лимонно-кислого натрия на 100 мл антигена, Пример 2, Антиген, полученный по примеру I используют для постановки РА с целью диагностики полибактериоэа птиц, Для постановки кровекапельной агглютинации на предметное стекло

1 при температуре его поверхности плюс о

41-42 С, наносят каплю. крови подопытных цыплят, взятой из подкрыльцовой вены с помощью скарификатора, и две капля испытуемого антигена, ПРИ работе используют грелку-качалкуу.

Каплю крови и две капли антигена смешивают и при покачивании столика качалки учитывают результаты через

60 с.

В результате исследований 500 проб крови от 500 цыплят 35-дневного возраста ни в одном случае не было зафиксировано положительных или сомнительных результатов агглютинации антигена.

При клиническом осмотре 500 цыплят этой группы не было обнаружено цыплят с поносами или больных с признаками, характерными для колибактериоза, В процессе постановки реакции агглютинации с кровью 500 цыплят 75дневного возраста были выявлены в

25 случаях положительные результаты

KKPA. При этом отмечались некоторые различия в характере реакций, которые были крупнозернистыми, четкими

; или мелкозернистыми, образование агглютината наблюдалось или через

10-15 с, или через 35-60 с с момента смешивания капли крови с антигеном на подогретой поверхности предметного стекла. Однако во всех случаях реакция агглютинации легко улавливал ась и спыт ат елями, Все 25 положительна- и отрицательно реагировавших цыплят были подвергнуты убою на санитарной бойне.

Патологический материал (сердце, печень, селезенка, легкое и отрезок

12-перстной кишки) от каждой птицы

10 в отдельности повергнуты бактериологическим исследованиям, С целью сокращения объема работ от каждого органа отдельно взятого цыпленка стериально вырезают участок весом 0,615 1,0 г объединяют и растирают в ступке, готовят эмульсию 1;10, 0,5 мп ее засевают в пробирку с ИПБ, I

Через 24 ч проверяют наличие роста и проводят дробный посев бульонных

20 культур на поверхность агара Энда в чашках Петри, Иэ числа 25 положительна реагировавших птиц с антигеном в 20 случаях или 80% из патологического материа2б ла выделены патогенные бактерии

Е, cali, а у птиц имели место признаки воспаления кишечного тракта и поносы, Антиген не реагирует с кровью

30 птиц, не являющихся носителями патогенных бактерий других видов кишечной группы.

Для сравнения исследовали антиген полученный из эталонного штамма

Escherichza coli 04. Результаты исследования представлены в табл. 1 и 2, Таким образом, антиген из штамма

Escherichia coli ВГНКИ Р 37-387-а!14 обладает высокой активностью и спе-

40 цифичностью..

Штамм Escherichia coli ВГНКИ

11 37-387-а/14 обладает 22 перекрестными 0-антигенными связями при наличии 12 0-антигенных связей у извест45 ного штамма Escherichia coli 04 и содержит в своей генетической основе 0- детерминанты наиболее распро страненных серо групп кишечной палочки, выделяемых от больных колибакте50 риаз ом птиц °

Поливалентность штамма и его выраженная агглютинабельность позволят использовать его в качестве высоко-.

55 эффективного диагностического препарата для выявления больных колибакте риозом птиц, сократить сроки диагностических исследований от 2-3 сут до

3-5 мин, 5

Формула из обретени

Штамм бактерий Еяchericiiin. roli

ВГИКИ 11 37-387-а/14, используемый

134201Ь 6 для изготовлении з!!тмгемл лпл Лнлгмогтини колибактериоза птиц. аблицa!

Эффективность антигенов, приготовленных из штамма ВГНКИ )г 37-387-а/14 и 04 при диагностике колибактериоза у птиц

Количество исследований проб

Результаты PA с сыворотками крови больных птиц

Результаты ККРА с кровь!о птиц неблагополучной группы количест- эффекзффективность, _#_ положительные всего всего проб исследо" ваний во поло ность

7 жительных реакций результаты

27 84„4 220

12 37,5 220

23,6

Эталонный 04 32.

Твблнцв2

Реэультаты сравнительной проверки агглнтинвбильной активности внтигенов нэ штамма ВП1КИ 1К 37-387"а/14 и эталонного в реакции вгглютннвции (РА) с сыворотками крови больных кур кровь+внтигены

Сравнительные реэультвты реакции агглнтнивцин больных птиц иэ щт, АЛК н эталонного 04, сгруппированные но вгглвтинациониым титрам (рвэведенин сывороток крови) Антиген

ss втвммов

1ã:100 1в200 1 1:400 (1 800 !!1600 1!3200 1!6400 1е12800!

i!750

12 19 1 2

7 3 1

1 t674

Составитель В.Романова

Техред И.Ходанич Корректор В,Бутяга

Редактор Л,Павлова

Заказ 1893 Тираж 392 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

l.!3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. IIpopKTHBii 4

Аитнген из шт аммов

Э, коли

ВГНКИ

11i 37-382-а/14

Вгнки

B 373о7-в/!4 52

Эталонный 04 27

Средний вв" ривциониый титр вгглв" тннвбильности