Штамм бактерий аzотовастеr снrоососсuм-несимбиотический азотфиксатор для ячменя

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии. Оно представляет собой новый штамм азотобактера . Штамм обладает сродством к ризоплане ячменя и имеет генетическую метку. Размножается и функционирует на ризоплане ячменя по крайней мере в течение 2 мес. Штамм вызывает ростостимулирующий эффект, продуцирует гетероауксин, витамины группы В, гиббереллин, формирует с ячменем азотфиксирующую ассоциацию, повьппает урожай и продуктивность растений по содержанию азота. Штамм может быть использован для создания бактериального удобрения под ячмень. 5 табл. (О (Л СО 05 00 со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

<511 4 С 05 Е 11/08, С 12 И 1/20 //

С 12 R 1 065 С 12 J 1/20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3907786/28-13 (22) 07.06.85 (46) 15.03.88. Бюл. М 10 (71) Институт генетики и цитологии

АН БССР (72) Н. А. Троицкий, М. А. Новицкая и Т. М. Троицкая (53) 63:576.8(088.8) (56) Рубенчик Л. И. Азотобактер и его применение в сельском хозяйстве. Киев. 1960.

Гекасина Е. В.,Новогрудская E Д. и Фаизова Г. К, Азотобактерии, производство и применение. Обзор, Сер. VZ.

Получение и применение микробиологических средств защиты растений, кормовых антибиотиков, бактериальных удобрений. М., 1982.

Мишустин Е. Н, и Емцев В, Т. Микробиология. М., 1978.

„„SU„„1316189 A 1 (54) ШТАММ SAKTEPKi А20ТОВАСТЕЯ CHROOC0CCU. — НЕСИ11БИОТИЧЕСКИИ АЗОТФИКСАТОР ДЛЯ ЯЧМЕНЯ (57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии. Оно представляет собой новый штамм азотобактера. Штамм обладает сродством к ризоплане ячменя и имеет генетическую метку. Размножается и функционирует на ризоплане ячменя по крайней мере в течение 2 мес. Штамм вызывает ростостимулирующий эффект, продуцирует гетероауксин, витамины группы

В, гиббереллин, формирует с ячменем азотфиксирующую ассоциацию, повышает урожай и продуктивность растений по содержанию азота. Штамм может быть использован для создания бактериального удобрения под ячмень. 5 табл.

1316189

45

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый ип амм азотобактера, которыи может быть использован для разработки и производства бактериального удобрения, повышающего урожай и содержание азота н ячмене на бедной по азоту почве без внесения минеральных азотных удобрений, и в научно-исследовательской работе.

Целью изобретения является получение нового штамма азотобактера, фиксирующего атмосферный азот, выделяющего ростовые вещества и обладающего сродством ь. поверхно с ти корней, т. е . вступающего в ассоциативный симбиоз с ячменем, а также имеющего генетическую метлу, позволяющую легко отличить его от природных штампов. 20

Штамм получен путем многоступенчатой селекции бактерий на поверхности корней ячменя, предварительно обрабо" таиных в почве штаммом А.",о1" . ас1.-= .- г,-- с: .:.з; 1:,:-., несущим трансмиссивную плазмиду, позволяющую гене" тический обмен с широким кругом природных видов бактерии ризопланы.

Штамм Акс> .1 —.г:: "- . — cc .-.

t«> ty"енны из штамлла .-. -1. 1- - с ег

1.гоо сс з, хранится в Центральном Музее промышленных микроорганизмов под 1 ЦМПМ Б-2375. В 1;ентральном музее промышленных микроорганизмов новый штамм зарегистрирован под

11" ЦМ11М Б-3173, Штамм ... .:; с е" - -,-с-,-..-;с

:- -3173 имеет следующие морфологические и физиологические :,арактеристики

Морфо:1огические пpkfзнаки, 40

При росте штамма Б-3173 на агаризованной среде hýðêа — штрих двух— суточной культуры цне та слононои кости, слизистой консистенции с нолнистыми краями, непрозрачный, поверхность блестящая, кол >нии округлой формы н диаметре 1,5-2,5 мм с ровными краями, непрозрачные, цвета слоновой кости, более слизистой консистенции, чем штрих. 50

Клетки штамма i>-3173 н молодом возрасте имею" форму толстой палочки с закругле -.ными концами,,3-7 х 1,52,5!, покрытой студенистой капсулой.

Имеются жгутики. Б зависимь сти от возраста и среды могут иметь самые разнообразные формы и размеры: кокки, сарцины. Клетки могут быть расположены одиночно, парами, короткой цепочкой и сарциноподобными пакетиками, окруженными общей капсулой. Покоящаяся форма — циста. При старении культура приобретает коричневую Ок» раску. Пигмент не проникает в среду.

Окрасить клетки можно анилиновыми красителями по Граму.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм В-3173 — аэроб. Оптимальная температура роста 28-32 С, минимумl0 С, максимум — 45 С. Реакция штамма на рН: оптимум 7-7,8, максимум—

9, минимум — 6.

Штамм В-3173 ассимилирует следующие ис точники углерода: глюкозу, левулезу, декстрин, галактозу, сахарозу,мальтозу, арабинозу, ксилозу и маннозу — из спиртов: маннит, глицерин и этиловый спирт.

Штамм Б-3173 не ассимилирует соли формиатной, салициловой, олеиновой кислот, метилоный спирт, фенол, целлюлозу, гелицеллюлозу, лигнин.

Штамм В-3173 использует свободный азот, азот аммониевых, нитритных и нитратных солей. Нитратный и нитритный азот сначала превращается в амлюний, а затем уже используется азотобактером.

Штамм Б-3173 для развития нуждается в магнии, кальции, в небольших количествах молибдена и железа °

Штамм В-3173 на МПЛ растет плохо.

Колонии двухсуточной культуры имеют н диаметре 0,5-1 мм и более интенсивную окраску.

Штамм Б-3173 в отличие от штамма К обладает повышенной способностью прикрепляться к поверхности корней ячменя и функционировать на них не менее

2 мес. после инокуляции.

Пример 1. Недельные проростки растений ячменя сорта Фаворит, растущие на жидкой питательной среде, обрабатывают равным количеством клеток штаммов Б-3173 (опыт) и К (контроль) и продолжают выращивание на све-у в течение суток. Затем корни отделяют и последовательно отмывают в семи колбах со средой Бэрка (дне последние с песком), как при селекции штамма ° Равные навески корней растирают в измельчителе и после разведений высевают на индикаторную среду Бэрка. В результате подсчета колоний в ризоплане ячменя обнаружено 26+5 -)0 клеток штамма В-3173 на

1 г корней и 2 + 1,4 -10 клеток штам1316189 ма К на 1 г корней. Таким образом, способность клеток штамма В-3173 прикрегляться к поверхности корней ячменя сорта Фаворит в 13 раз выше, чем у известного штамма.

Наличие клеток штамма В-3173 на поверхности корня в процессе вегетации ячменя после инокуляции почвы с недельными проростками растений оп-lp ределяют методом обрастания. Через

1,2 мес вегетации корни, очищенные от почвы, накладывают на поверхность индикаторной среды. Через двое суток отмечают интенсивное и одновремен- 15 ное обрастание поверхности корней сплошной массой клеток штамма В-3173.

В контроле при обработке штаммом К сплошного обрастания не обнаруживают. Таким образом, клетки штамма 20

В-3173 обладают способностью колонизировать поверхность корней ячменя сорта Фаворит по крайней мере в течение 2 мес. после инокуляции.

Штамм В-3173 выделяет во внешнюю 25 среду белок, отсутствующий у штамма

К, и обладает повышенным по сравнению со штаммом К синтезом другого белка. Эти белки, обнаруженные при сравнении электрофореограмм экзобел- 30 ков штаммов В-3173 и К (чертеж,, возможно ответственны за сродство клеток штамма В-3173 к ризоплане ячменя.

Штамм В-3173 обладает способностью

В определенных условиях формировать аэотфиксирующую ассоциацию с ячменем. Азотфиксация растений ячменя, обработанного культурой штамма В-3173 в вегетационных сосудах с дерновоподзолистой почвой без азотных удоб- 40 рений, измеренная ацетиленовым методом, выше, чем азотфиксация в природной ассоциации без инокуляции.

Пример 2. Вегетационные сосуды с дерново-подзолистой супесча- 45 ной почвой (10 кг на сосуд без минеральных азотных удобрений, 1) без растений, 2) с культурой ячменя сорта Фаворит в стадии колошения, 1.1 и 2.1) инокулированные бактериями штамма В-3173 через 10 дней после прорастания — по 50 мл суспензии клеток с концентрацией 10 кл/мл на соS суд, 1.2 и 2.2) без инокуляции) герТаблица l

Почва без растений Штаммом

В-3173

Следы

Ячмень Штаммом сорта В-3173

Фаворит

0,21

0,046

Из данных табл. 1 следует, что клетки штамма В-3173 формируют азотфиксирующую ассоциацию с ячменем, превышающую по нитрогеназной активности ассоциацию ячменя с дикими почвенными диазотрофами.

Штамм В-3173 при инокуляции бактерий в корневую зону проростков обладает способностью повышать продуктивность растений ячменя по содержанию общего азота и особенно небелкового азота свободных аминокислот.

TI р и м е р 3. В вегетационном опыте (по 6 сосудов с 60 растениями в каждом варианте опыта) дерновоподзолистую почву с недельными проростками ячменя сорта Фаворит инокулируют (25 мл на сосуд) суспензией клеток штамма В-3173 в концентрации

10 кл/мл. После вегетации исследуют

S содержание общего и небелкового азота в зерне. В варианте опыта без добавления в почву азотных удобрений количество азота в зерне в процентах от абсолютно сухой массы составляет (табл. 2 . метично закрывают изолятором из полиэтиленовой пленки объемом 10 л. В изоляторы вводят по 0,4 л ацетилена.

Через 24 ч берут пробы газа и анализируют на газовом хроматографе Хром-5.

Содержание этилена в пробах приведены в табл. 1.

1316189

Таблица 2

Опыт с инокуляцией

1,77 10,1

1,94

0917

Контроль без инокуляции

1,61

9,2

1,73

0,21» (127.) О, 16» 0,9» (9,97) 0,053» (45Z) Прибавка

» — прибавка достоверна с вероятностью Р," 0,05. колоний штамма В-3173 не ингибирует20 ся. Известный штамм чувствителен к этим антибиотикам и не растет при указанных концентрациях. Это свойство штамма В-3173 можно использовать для быстрой идентификации штамма на кор25 нях растений в полевых условиях.

Пример 5. Корни растений, инокулированных штаммом В-3173, накладывают на поверхность агаризованной среды Бэрка, содержащей ампициллин, канамицин и тетрациклин в концентрациях 100; 10 и 50 мкг/мл соответственно ° Через 2 сут наблюдают сплошное обрастание корней биомассой клеток штамма В-3173 при отсутствии

35 сплошного обрастания у штамма К. й

6,65+0,27

8,1+0,41

10,8+0,34

12,3+0,6

1,2+0,045

1,3+0,016

В-3173

Штамм В-3173 обладает способностью к стимуляции роста ячменя при обработке семян.

П р и « е р 4 ° Семена ячменя сорта Фаворит после стерилизации поверхности 70K-ным этанолом и диацидом проращивают в колбах со средой Бэрка (контроль, и с суспензией штаммов К и В-3173 в среде Бэрка,по 10 мл с

В концентрацией 10 кл/мл на 1 колбу,, и инокулируют на светоустановке в течение 8 дней (3 опыта по 6 поверхностей). Затем проростки извлекают и взвешивают. Биомасса проростков, инокулированных штаммов К и В-3173, превышает контроль соответственно на

907 и 1067, Таким образом, ростостимулирующая способность штамма В-3173 на 161 выше, чем штамма К, даже при

"словии искусственного насыщения корней бактериями известного штамма.

1Цгамм В-3173 обладает устойчивостью к ампициллину, канамицину и тетрациклину в концентрациях 100; 10 и

50 мкг/мл соответственно.

Уровень устойчивости определяют по максимальной концентрации антибиотиков в среде Бэрка, при которой рост

Пример 6, Предлагаемый штамм повышает урожайность ячменя и усвоение им азота. Это видно из ре40 зультатов, представленных в табл. 3.

В табл. 3 показано сравнение влияния инокуляции проростков ячменя сорта

Фаворит штаммами К и В-3173 на урожай зерна и содержание азота в зерне

45 в вегетационных опытах на дерновоподзолистой почве (1985 г).

Таблица 3

1316189

Продолжение табл. 3

О, 1+О, 047

Разность, г

1 45+0 5

1, 5+0,69

Разность, 7.

21,8

Достоверность разностей, P.-О, 05 (0,0Ä

-О, 05

Продолжение табл, 4

РеЯО

0,003

0,006

Дрожжевой экстракт

0,5

9,8

Пеногаситель (олеиновая кислота) 1,95

0,1 Таблица 4

Водопроводная вода

19,5 л

1 л й

Сахар пищевой

10,00

195,0

К НР04

0,64

12,5

ЕН РО

0,16

3,1

0,20

Мдлс, NaC1

3,9

0,20

3,9

СаБС q 2Н 0

1Яа 11оС

0 05

1,0

0,001

0,002 а б

Azotobact er

chroococcum К2

AzotoÜàctåã

chroococc

В-3173

2+1, 4

Полная

26+ 5

Полное

Штамм В-3173 может быть использован для приготовления бактериального удобрения на торфяной основе, которое мы назвали "Ризофил" за способность бактерий прикрепляться к корням растений.

Пример 7. Штамм В-3173 вьгращивают в ферментере на модифицированной среде Бэрка следующего состава (см. табл. 4). рН 6,8-7,0 доводится 207.-ным раствором NaCIH или разбавленной НС1 до концентрации 10 кл/мл, и культураль9 чую жидкость инокулируют в полиэтиленовые пакеты с простерилизованными

40 гамма-лучами в дозе 2 .10 г измельченным торфом. Соотношение массы инокулята и торфа 1:3. После поращивания в термостате при 28 С в течение 3 сут удобрение готово к использованию.

45 В табл. 5 представлены сравнительные данные по сродству к ризоплане ячменя и наличию генетической метки известногo и селекционированного штаммов, Отсутствует Отсутствует

° °

131 61 89 бо тки рациональных спо собов их применения.

Формула и з о б р е т е н и я

Штамм A.-;ctobacter с1:roococcum

В-3173, обладающий повышенным сродством к ризоплане ячменя и генетической меткой, может быть использован в сельском хозяйстве для создания новых бактериальных удобрений и разраНо&ю

А ЛЪ1

Повышенное

cvdep owue

& юаг

Составитель А. Поллиская

Редактор N. Стрельникова Техред М.Ходанич Корректор А. Обручар

Тираж 425 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 1201

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 maenad

Azot. bacter

chroococcum

A zo8obact сhroococcurn

В --У77

Штамм бактерий Azotobacter chroococcuv ¹ ЦМПМ В-3173 — несимбиотический азотфиксатор для ячменя.