Способ определения перекиси водорода при ферментативной реакции

 

Изобретение относится к биологической химии, точнее к определению перекиси водорода при ферментативной реакции. Цель изобретения - повышение воспроизводимости способа путем сохранения стабильности окрашенного комплекса. Дпя этого к испытуемой пробе добавляют буферный раствор оксидазы, производное антипирина и фенольное соединение. Фотометрически определяют уровень перекиси водорода протекающей ферментативной реакции. В качестве фенольного соединения, сочетающегося с 4-аминоантипирином, оптимален п-хлорфенол, фенол и другие его производные, производные анилина , нафтол и его производные, нафталинамин и его производные, аминохинолин, оксихинолины и т.п. Взаимодействие проводят в буферном растворе с рН 6-9. 1 табл. I О) со со 00 00 см

СО103 СОВЕТСКИХ

СО01ИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (1Е (И) А3 ьв4С 0 1 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3244903/28-14 (22) 04.02.81 (31) P 3100807.0; Р 3039207.5;

P 3004129.3 (32) 01.01.81; 07.10.80; 05.02.80 (33) РЕ (46) 15.09.87. Бюл. У 34 (71) Берингер г1аннхайм ГмбХ (DE) (72) Ханс Георг Батц (ПЕ) (53) 616.07 (088.8) (56) Апп. Chin. Biochem,, 6, 1969, р. 24-27. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА ПРИ ФЕРМЕНТАТИВНОИ РЕАКЦИИ (57) Изобретение относится к биологической химии, точнее к определению перекиси водорода при ферментативной реакции. Цель изобретения — повышение воспроизводимости способа путем сохранения стабильности окрашенного комплекса. Для этого к испытуемой пробе добавляют буферный раствор оксидазы, производное антипирина и фенольное соединение. Фотометрически определяют уровень перекиси водорода протекающей ферментативной реакции.

В качестве фенольного соединения, сочетающегося с 4-аминоантипирином, оптимален п-хлорфенол, фенол и другие его производные, производные анилина, нафтол и еro производные, нафталинамин и его производные, аминохинолин, оксихинолины и т.п. Взаимодействие проводят в буферном растворе с рН 6-9. 1 табл.

1 1338

Изобретение относится к биологической химии, в частности к определению перекиси водорода при ферментативной реакции.

Целью изобретения является повышение воспроизводимости способа за счет сохранения стабильности окрашенного комплекса.

Способ осуществляют следующим об; разом.

К испытуемой пробе добавляют буферный раствор оксидаэы, производное антипирина и фенольное соединение. С помощью фотометрии полученного окрашенного комплекса определяют уровень перекиси водорода, образующейся в процессе ферментативной реакции. Согласно изобретению можно испольэовать обычные фенольные соединения, которые могут сочетаться с 4-аминоантипирином с образованием красителя.

Предпочтительным в качестве фенольного соединения является п-хлорфенол.

Примерами других подходящих соединений является фенол, другие производные фенола, производные анилина, нафтол, производные нафтола, нафталинамин, производные нафталинамина, аминохинолины, оксихинолины, диоксифенилуксусная кислота и т.п. Взаимодействие проводят в буферном растворе. В качестве буферного вещества и значения рН пригодны условия, известные в химии пероксидазы. Предпочтительны значения РН среды в интервале 6 — 9. В остальном выбор буфера и значение рН в случае реакции, включающей энзиматическое образование

Н О, обуславливается прежде всего требованиями, предъявляемыми к буферу и значению рН энэима, участвующего в реакции.

Пример 1. Определение образования Р О при окисления глицерина с помощью глицериноксидаэы.

° Приготавливают реагент 1:0,1 моль/л буфера триэтаноламина (НС1, рН 8,0, 3,6 ммоль/л или 2 г/л иэотридецилового эфира, 4,7 ммоль/л или 2 г/л натрийхолата, 10 ммоль/л п-хлорфенола, 0,5 ммоль/л аминозамещенного 4-аминоантипирина, 10 Е/мл пероксидазы); реагент 2:500 Е/мл глицериноксидаэы..

Для проведения определения 2 мл реагента 1 и 0,2 мл реагента 2 добавляют пипеткой в кювету. Экстинкцию Е отсчитывают на потенциометре при

546 нм. Непосредственно после этого

787

40 на

2,0 мл реагента 1 вносят в кювету пипеткой, добавляют 10 мкл реагента 2 (пробу! и смешивают. Экстинкцию проводят через 70 мин. Далее опреде45 ляют контРольное значение. При этом вместо раствора Н О к реагенту 1 добавляют буфер °

Результаты исследований приведены в таблице.

t)

35 реакц пп начинают добавлением 20 мл пробы. Через 20 мин отсчитывают экстинкцию Е,. Температура инкубации составляет 25 С. Оценку проводят через калибровочную прямую, при которой измеренная разница экстинкций a F E,—

Е, стандартного раствора глицерина к концентрации глицерина находится в соотношении. Концентрации испытуемой смеси составляют 0,09 моль/л буфера триэтаноламина HCI рН 8,0, 1,8 г/л (3,2 ммоль/л) изотридецилового эфира, 4,3 ммоль/л натрийхолата, 9ммоль/л п-хлорфенола, 0,45 ммоль/л аминозамещенного 4-аминоантипирина, 4 Е/мл пероксидазы, 45 Е/мл глицериноксидазы.

Пример 2. Исследована стабильность окраски пяти соединений. В качестве соединений для сравнения взяты 4-аминоантипирин и сульфированный 4-аминоантипирин. С этими сравнительными соединениями и новыми соединениями при использовании и-хлорфенола, 2,4-дихлорфенола и этилокситолуидина (сульфированного) в качестве фенольного компонента сочетания определяли экстинкцию f стабильность получающегося красителя и

При проведении испытания испольэовали следующие реагенты: реагент 1:

0,1 моль/л фосфата калия в качестве буфера, РН 8,0, 0,1 ммоль/л производного 4-аминоантипирина, 1,0 ммоль/л фенольного компонента, 2 Е/мл ПОД; реагент 2: 0,01 моль/л раствора Н О

Условия определения: измерительное излучение 546 нм, толщина слоя кюветы 1 см, температура инкубации комПроцентные данные стабильности красителя (60 мин при комнатной температуре) относятся к отклонению, касающемуся измерительного сигнала, который возникает при появлении Н 0

Иэ таблицы видно, что на 3„„, новые соединения изобретения оказывают лишь незначительное влияние, также и на значение экстинкции. Соединения согласно предлагаемому способу пре3

1338/87 восходят сравнительные соединения по целью повьппения воспроизводимости стабильности окрашенного комплекса. способа за счет сохранения стабильности окрашенного комплекса, в каФормула л а и э о б р е т е н и я честве производного антипирина ис5

Способ определения перекиси водо- пользуют вещество, выбранное иэ групрода при ферментативной реакции, пы: 4-аминоантипирин, 1 — (С-этиламивключающий взаимодействие пробы с бу- нофенол-4-аминопиразолон-(5), 1ферным раствором оксидазы, добавле- (амино-п-амино-толил)-2, 3-диметил-4ние производного антипирина и феноль- I o аминопиразолон- (5), 1- (п-диэтил-аминого соединения с последующим фото- нофенил)-2,3-диметил-4-аминопиразометрированием окрашенного комплекса, лон-(5), в количестве О, l-О, 5 ммоль/л о т л и ч а ю ш и Й с я тем, что, с ре ак ционно Й сме си.

Т! (омпонент 4-амнно" 4-амнно4-амнноан"

I -(о-этнл)амннофеннл

2,3-днметип4-амннопнраэолон (5)

0,2 ммоль/a

1! - (амннои-толнл)2,3-днметнл

4-амнно1а /и-ацетамннофеннл2,3-днметнл4"амннопнраэолон-(5)

0,3 ммоль/л

1- (n-днэ тнл. амннофеннл)

2, 3-днметнп4-амннопнра эоло н- (5 )

0,5 ммоль/л нтипнреакцнн антнпн- тнпнрннPNH вмнн

1 (сульфн- 0,1 ммОль/л

, рованньй)

| пираэолон-(5)

0,4 ммоль/л

Хло рфе нол, мкмоль/мл 12+5I 12+4I

14+I I

91OI

19+ I I

2010I

19+ 03

Стабильность красителя, маКс

505

500 502

503

502

503

Днхлорфенол, мкмоль/мл

I O+2I 18+73 27+ II

15+22

25-12

22+Ol

41+ II

Стабнльность краснтеля, маас

507

$05

508

507

508

502

Фенокситолундин (сульфнрованнаа11, мкмоль/мл

33+1Ы Зг-1 12

25-7I

23-32

25-5I

37-4 I

Стабнльность красите550

550 546

548

546

546

550

Корректор В.БУтЯга

Техред И.Попович

Редактор Е.Копча

Заказ 4151/59 Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.; д. 4/5.Проиэводственпо-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проект

П оектная 4