Способ диагностики синдрома гиперкоагуляции

 

Изобретение относится к иммунологии . Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа. Из венозной гепаринизированной крови выделяют мононуклеарные .клетки и отмывают их. К лимфоцитам добавляют эритроциты быка, сенсибилизированные к тромбину. Смесь инкубируют, центрифугируют и вьщерживают в холодильнике. .Подсчитывают ксхпичество лимфоцитов, образовавпшх розетки с эритроцитами быка, на 100 клеток. При содержании их более 2% диагностируют синдром гиперкоагуляции . Для идентификации лимфоцитов проводят дополнительно люминесцентную микроскопию. 00 со 4 о X

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСОУБЛИН, (19) (И) (51) 4 С 01 N 33/48

A t

15 I

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3926148/28-14

{22) 05.07.85 (46) 30.08.87. Бюл. 9 32 (71) Семипалатинский государственный медицинский институт .(72) А.И.Кусельман, N.Ý.Керхер и В.В.Иванов (53) 6 15.375 (088.8) (56) Маматкулов Х.М., Цай Т.С. Синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови при сепсисе у детей раннего возраста. — Педиатрия, 1984, Р 3, с. 44-48. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИНДРОМА

ГИПЕРКОАГУЛЯЦИИ (57) Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения — упрощение и повышение точности способа. Из веноэной гепаринизированной крови выделяют мононуклеарные .клетки и отмывают их. К лимфоцитам добавляют эритроциты. быка, сенсибилизированные к тромбину. Смесь инкубируют, центрифугируют и выдерживают в холодильнике.

Подсчитывают количество лимфоцитов, образовавших розетки с эритроцитами быка, на 100 клеток. При содержании их более 2Х диагностируют синдром гиперкоагуляции. Для идентификации лимфоцитов проводят дополнительно люминесцентную микроскопию.

1334

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и коагулоло-. гниа

Цель изобретения — упрощение и пс5 вышение "î÷íîñòè способа диагностики. синдрома гиперкоагуляции.

Способ осуществляют следующим образом, Из веноэной гепаринизированной крови (3-3,5 мл) на градиенте плотности фиколл-верографина (d=-1,077 г/??и) выделяют мононуклеарные клетки с чистотой 85-90%. Выделенные клетки трижды отмывают от сывороточных белков средой 199. Доводят до рабочей концентрации 2-3 10 /мл в среце 199.

В реакции используют эритроциты быка, сенсибилизированные к тромбкну. Их получают следующим образом.

Эритроциты быка отмывают трижды физиологическим раствором. Из отмытых эрктроцитов готовят 10%--ную взвесь на физиологическом растворе, К 3,0 мл 107.-ной взвеси эритроцитов 25 быка добавляют 1,0 мл О, 1%-ного раствора ализариновага красного., приготовленного на физиологическом раст— воре, и тромбина очищенного., без плазминогена (10 ед.), раствореннога Зп в физиологическом растворе (1,0 мл) .

Тщательно перемешивают и ставят в а термастат при 4.5 С на 1 ч. Затем эритроциты быка вновь отмывают трижды физиологическим раствором и готовят

3 3

27-ную суспензию эритрсцитов в физиологическом растворе. В последующем к

0,2 мл лимфоцитов в концентрации

2-3 ° 10 /мл добавляют 0,2 мл 27.-наго раствора эритрацктов быка, сенсибклизированных тромбином. Смесь лнкубируют при 37 С 10 мин, затем центркфугируют прк 1000 аб/мкн 5 мин.и вью, держивают в холодильнике при 4 С 1? ч или оставляют на ночь (18 ч), Далее

5 подсчитывают количество лкмфоцктав, образовавших розетки с эритроцитами быка (3 эритрацита и более), на

100 клеток.

Для исключения неспецифическсга образования розеток ставили параллсльно 3 пробы: отмытые эритроцить? быка к лимфапиты; эритроциты быка, сенск-билизкрованные О, 17.-ным растворам ализаринового красного, и лимфоцкты„ эритроциты быка, сенсибилизированные алкзаринсвым красным и нагруженные тромбинам, и лимфацкты.

085 2

Обследована 57 детей, из нкх 16 здоровых и 41 с ОРЗ,, бронхитом из разчичнай формой пневмонии.

Пример 1. Проведена исследо?а???le здаравог„ребенка 2 лет.

3 р 0 мл гe?IBркнкзкр ованнои крови (25 ед/мл} разводят физиологическим растворам в 2 раза и наслаивают на

3,0 мл фикалл-версграфина (плотность

1,077 г/мл), Центрифугируют 40 мин прк 1500 oo/ìè??. Снимают с интерфазной поверхности взвесь лимфоцитов и отмывают средой 199 три раза при .000 об/мкн в течение 10 мин., затем проверяют жизнеспособность выделения лимфоцктов по суправитальной окраске с тркпанавым синим к осуществляют подсчет лимфацктав в 1 мл. Готовят рабочий раствор (2-3 10 /мл) лимфо-. цктав в среде 199. Параллельно с описанной процедурой осуществляют трехкратное отмывание эритрсцитов быка,, гогсвят 107-ную суспензию в физиологическом растворе., В 3 пробирки разливают по

3„0 мл 10%-ного раствора эритроцитов быка. В 1 — ю пробирку добавляют 2,0 мп физиологического раствора, во 2-ю1,0 мл 0,17-нага раствора ализариновага красного и 1.0 мл физиологического раствора, в 3-ю — 1,.0 мп О, 17ного раствора ализариновогс красного

1,0 мл трамбкна в дозе 10 ед/мп.

Трамбин очищенный, без плазминагена, Каунасскога производства.. Все три о пробирки ставят в термастат при 45 С

??a i ч, Затем триждь. отмывают эритроциты к готовят 2%-ную суспензию на физиологическом растворе. Ставят параллельна 3 пробы, для чего в 3 пробирки разл??вант пс 0,2 мл суспензии лимфацитов и соответственно добавляют по 0.,2 мп приготовленных предварительна эритроцитов быка. Пробы тщательно перемешивают и ставят в термастат при 37 С на 10 мин, затем центрифугкр)ют прк 1000 аб/мин 10 мин к кнкубируют прк 4 18 ч.

После инкубацкк в"e три пробы ресуспензируют к подсчитывают количество лкмфацитсв, образовавших розетки не менее чем с тремя эритроцитами быка.

В 1-к пробирке розеток не обнаружена, ео втсрай >..акже нет розеток, в третьей выявлены 2 разеткообразуюк??ле клетки (кз 100),, к KoTopbM в од— ном случае прксаединилксь 4 эритроцкта быка. возле др той клетки образовалась lloJ?óìîð÷ëà, з 13

Для идентификации лимфоцитов проведено дополнительное исследование с помощью люминесцентной микроскопии.

Подтверждено наличие лимфоцита в центре розетки зеленым свечением ядра.

Таким образом, показана возможность наличия рецепторов к тромбину на лимфоцитах у здорового ребенка.

Всего обследовано 16 здоровых детей; средяя величина содержания розеток—

1, 1Ф0,2.

34085

Способ диагностики синдрома гиперкоагуляции у детей, больных острой пневмонией, путем исследования кро55 ви, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, из исследуемой периферической крови выделяют лимфоциты, определяют в реакции розеткоПример 2. Ребенок Ч., 6 мес.

Диагноз: острая двухсторонняя очаговая пневмония, острый период. 3,0 мп гепаринизированной крови (25 ед/мл) разводят физиологическим раствором в

2 раза и наслаивают на 3,0 мп фиколлверографина (плотность раствора

1,077 г/мл). Последующая процедура выделения клеток и постановка проб аналогичны описанным в примере 1 ° В

1-й пробирке розеток не обнаружено. во 2-й — 2 розетки, в 3-й — 9 розеток. К лимфоцитам прикрепилось от 3 до 10 эритроцитов быка. Следовательно, в острый период пневмонии экспрессия рецепторов к тромбину более выражена, что обусловлено активацией свертывающей системы, большим содержанием тромбина в кровотоке и возможной сенсибилизацией лимфоцитов, это свидетельствует о наличии у больного синдрома гиперкоагуляции. Для подтверждения этого известными методами необходимо провести ряд исследований: определение тромботеста; определение времени рекальцификации; определение содержания фибриногена; определение тромбинового времени; определение протромбинового индекса, запись тромбоэластрограммы. Проведенные исследования показали, что время рекальцификации составляло

115 с; концентрация фибриногена

340 мг Х; тромбиновое время 23 с; протромбиновый индекс 97Х. Данные

It тромбоэластограммы: P — - 4 мин, 30

К вЂ” 2 мин; мА — 50 мм. Только по одному из проведенных исследований судить о состоянии системы гемостаза не представляется возможным. Анализ коагулограммы (совокупности исследований) свидетельствует о тенденции к гиперкоагуляции, т.е. для обоснования данного вывода необходимо бы" ло провести шесть исследований.

Таким образом, предлагаемый способ упрощает диагностику гиперкоагуляции. Поскольку способ отражает экс 5 прессию рецепторов лимфоцитов к тромбину, то он обеспечивает повышение точности диагностики, так как отражает уровень циркулирующего в периферической крови фермента тромбина, который является ключевым в системе гемостаза, и его содержание увеличивается при гиперкоагуляции.

Пример 3. Ребенок И, 1 г.

4 мес. Диагноз: двухсторонняя пнев15 мония, справа полисегментарная, ДН и, CH > . Лимфоциты сенсибилизированные тромбином эритроцитов быка, получают аналогично описанному в примере 1. Количество лимфоцитов, обра2р зовавших розетки — 14, что свидетельствует о значительной концентрации в периферическом кровотоке тромбина и, следовательно, о более выраженной гиперкоагуляцни по сравнению с примером

25 2. Это связано с более тяжелым и распространенным процессом в легких.

Проведенные рутинные исследования системы гемостаза также свидетельствовали о значительно выраженном ги3п перкоагуляционном синдроме. Так, время свертывания крови по Ли-Уайту составляло 3 мин, время рекальцификации 85, степень тромботеста VI, тромбиновое время 19;протромбиновый индекс 95Х; фибриноген 308 мг X.

Следовательно, по предлагаемому способу можно дать интегральную оценку состояния гемостаза в данный момент, не прибегая к многочисленным рутинным методам исследования.

Всего обследован 41 больной, причем среднее содержание розеток при пневмонии составило 8,2+1,1.

Способ прост, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов и может быть осуществлен. в любой лаборатории клинической иммунологии.

Формула изобретения

Составитель Л.Падюков

Техред Л. Сердюкова

Редактор А.Огар

Корректор В. Бутяга

Заказ 3958/42 Тираж 776

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

1334085 6 образования количество клеток, несу- держании их более 2Х диагностируют щих рецепторы к тромбину, и при с - синдром гиперкоагуляции.