Способ получения протеолитического фермента

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕО ЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА, заключающийся в выращивании продуцента Nocardia sp.1 на среде мясопептонного бульона с 3%-ным содержанием глюкозы с последующим перенесением на синтетическую среду СР-1, инкубацией и высаливанием фермента сернокисльп : аммонием из культуральной жидкости, о тли чающийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, после инкубация суспензию клеток продудента смешивают с реагентом, вызывающим процесс гелеобразования, до достижения содержания биомассы в реагенте 0,1-3,0%, затем в полученную смесь вводят инициатор гелеобразования , смесь инкубируют в течение 230 мин при 12-20°С, затем гель или его пленку фрагментируют на гранулы .размером 0,5-1,5 мм и инкубируют на синтетической среде СР-1 в течение 20-24 ч при 28-30 С, после чего отделяют культуральную жидкость от гранул и осаждают из нее целевой продукт. 2.Способ по П.1, отличающийся тем, что в качестве реагента , вызьгоающего процесс гелеобразования , используют 4%-ный раствор альгината натрия, перекристаллиз6ванный акриламнц и 10%-ный раствор поливинилового спирта. 3.Способ по П.1, о тлич ающ и и с я тем, что в качестве иници .атора гелеобразования используют сл 0,1 М раствор CaCfcf,N,N-метиленбис о сл акрштамида и облучение ультрафиолетовыми лучами. 1

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (1>) (1 ) 4(з1) C 12 N 9/68. 11/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

) С

1

К АВТОРСКОМ .Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3634238/28-13 (22) 11.08.83 .(46) 23.05.85. Бюл. В 19 (72) Н.С.Егоров, Г.К.Скрябин, К.А.Кощеенко, Е.А.Борман, Н.С.Ландау и И.Б.Котова (71) МГУ им. М.В.Ломоносова (53) 577. 15(088 .8) (56) 1. Егороз Н.С., Уманова В.И.

О фиоринолитической и протеолитической активности некоторых микробактерий и актиномицетов. — "Прикл. биохимия и микробиология", 1966, 11, 5, 595, 2. Авторское свидетельство СССР

Р 493504, кл. С 12 D 13/ 10, 1975. (54) (57) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕО- "

ЛИТИЧЕСКОГО .ФЕРМЕНТА, заключающийся в выращивании продуцента Nocardia

sp. 1 на среде мясопептонного бульона с ЗХ-ным содержанием глюкозы с последующим перенесением на синтетическую среду CP-1, инкубацией и высаливанием фермента сернокислым аммонием из культуральной жидкости, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, после инкубации суспензию клеток продуцента смешивают с реагентом, вызывающим процесс гелеобразования, до достижения содержания биомассы в реагенте 0,1-3,0Х, затем в полученную смесь вводят инициатор гелеобразования, смесь инкубируют в течение 230 мин при 12-20 С, затем гель или его пленку фрагментируют на гранулы, размером 0,5-1,5 мм и инкубируют на синтетической среде CP-1 в течео ние 20-24 ч при 28-30 С, после чего отделяют культуральную жидкость от гранул и осаждают as нее целевой йродукт.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве реагента, вызывающего процесс гелеобразования, используют 4Х-ный раствор альгината натрия, перекристалли —зованный акриламид и 10Х-ный раствор поливинилового спирта.

3. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве инициатора гелеобразования используют

О, 1 М раствор СаС8,N,N -метиленбисакриламида и облучение ультрафиолетовыми лучами.

1 1157

Изобретение относится к получению ферментных препаратов и может быть применено в микробиологической промышленности, медицине, гематологии, физиологии и биохимии микроорганизмов.

Известей способ получения протеаз иммобилизованными в ПААГ клетками

Streptomyces fradiae, заключающийся в том, что суспензию клеток в фиэи- 10 ологическом растворе включают в 5%ный полиакриламидный гель с содер1 жанием 10% сшивки (N,N -метиленбисакриламида) в течение 10 мин при

S С и атмосфере газообразного азота. 15

Гель с включенными в него клетками разрезают на небольшие блоки (2-3 мм) и обрабатывают реакционной средой (0,5% крахмала, 0,5% мясного экстракта, 0,05% дрожжевого экстракта, 0,02% СаСЕ» 0,01% MgSO< 7Н О) три раза по 2 ч; Для повышения выхода фермента гранулы с клетками обрабатывают 75Х-ным этанолом и используют до 30 раз 1).

Однако этот способ неэкономичен вследствие получения фермента иммобилизованными клетками на дорогocTo ящей реакционной среде, содержащей

0,5Х крахмала, 0,5Х мясного экстрак- З0 та и 0,05%. дрожжевого экстракта, трудоемок вследствие проведения дополнительной обработки гранул реакционной средой и этанолом, достаточно длителен и у целевого продукт та отсутствует фибринолитическая активнос.ть

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ по- 40 лучения протеолитического фермента фибринолитического действия, который предусматривает использование проактиномицетов (в частности, Nocardia зр.1) в качестве продуцентов фибри- 45 нолитических (фибрин — основная составная часть тромба) ферментов.

Продуцент выращивают на посевной среде (МПБ+3% глюкозы) в течение

3 сут, а затем на ферментационной 50 среде (синтетическая среда CP-1) также 3 сут отделяют клетки, а из культуральной жидкости с помощью . сернокислого аммония высаливают фермент с последующим диализом и лио- . 55 . фильным высушиванием 12).

Однако известный способ обладает недостаточно высоким выходом целевого

057 2 продукта и невысокой скоростью его получения. Кроме того, способ неэкономичен вследствие необходимости многократного выращивания посевного материала и длительности процесса и трудоемок.

Цель изобретения — упрощение процесса и увеличение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения протеолитического фермента, заключающемуся в выращивании продуцента

Nocardia sp.1 на среде мясо-пептонного бульона с ЗХ-.ным содержанием глюкозы с последующим перенесением на синтетическую среду CP-1, инкубацией и высаливанием фермента сернокислым аммонием из культуральной жидкости, после инкубации суспензию клеток продуцента смешивают с реагентом, вызывающим процесс гелеобразования, до достижения содержания биомассы в реагенте О, 1-3,0%, затем в полученную смесь вводят. инициатор гелеобразования, смесь инкубируют в течение 2-30 мин при 12-20 С, затем гель или его пленку фрагментируют на гранулы размером 0,5-1,5 мм и инкубируют на синтетической среде СР-1 в течение 20-24 ч при 28о

30 С, после чего отделяют культуральную жидкость от гранул и осаждают из нее целевой продукт.

В качестве реагента, вызывающего процесс гелеобразования, используют

4%-ний раствор альгината натрия, перекристаллизованный акриламид и

10%-ный раствор поливинилового спирта.

В качестве инициатора гелеобразования используют О, 1 М раствор

CaCP„N,N -метиленбисакриламида и облучение ультрафиолетовыми лучами.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

В среду МПБ с 3%-ным содержанием глюкозы вносят смыв клеток Nocardia зр.1 с агариэованной среды этого же состава и культивируют 48 ч, после чего проводят процесс гелеобразования с участием инициатора гелеобразования, смесь инкубируют в течение 2-30 мин при 12-20 C затем гель или его пленку фрагментирукт на гранулы размером 0,5- 1,5 мм и инкубируют на синтетической среде CP-1

1157

3 в течение 20-24 ч при 28-30 С, после чего отделяют культуральную жидкость от гранул и осаждают из нее целевой продукт.

Предлагаемый способ является более упрощенным, так как не содержит операций обработки альгината натрия карбонатом магния, обработки включенных в ПААГ клеток реакционной средой и этанолом, насыщения полимери- ig зуемой смеси газообразным азотом.

Пример 1. В среду МПД+3% глюкозы вносят смыв клеток Nocardxa зр. 1 с агаризованной среды этого же состава, культивируют 48 ч при 2830 С в колбах .на 750 мл со t00 мп среды на круговых качалках (220 об/мин), после чего клетки с культуральной жидкостью (to мл) смешивают с 4 -ным раствором альгината натрия (10 мл) на дистиллированной воде. Смесь вносят по каплям (диаметр отверстия 1 мм) с помощью пипетки в О, 1 M раствор СаСЕ> при комнатной температуре. Образовавшиеся 25 шарики геля диаметром t,5 мм оставляют в растворе хлорида кальция при

4 С на 1-2 ч для стабилизации.

20 мл гранул с клетками помещают

*в колбу на 250 мл, содержащую 50 мл среды СР-1 с 0,05 M СаСЮ, и инкубируют при 28-30 С на круговой качалке (220 об/мин). Через 20 ч культуральную жидкость сливают с гранул, промывают их физиологическим раство- 35 ром и запивают 50 мл свежей среды

CP-1 с 0,05 М CaC8 . Иэ полученной . культуральной жидкости фермент.осаждают сернокислым аммонием при насыщении 0,6-0,8. Биосинтез фермента на 40 синтетической среде CP-1 с помощью иммобилизованных в Са-альгинатный гель клеток продуцента повторяют многократно. Получают суммарный выход целевого продукта 13 100 усл.ед./мл. 4>

Пример 2. Клетки продуцента, выращенные на МПБ+З глюкозы, как в примере 1, отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин.

Клеточную суспенэию в физиологическом растворе включают в 10 ПААГ с 5 ным содержанием сшивающего агентаN,N -мечнленбисакрнламида (МБА).

Для этого к 11 мл водного раствора, содержащего 1,9 г перекристаллизованного акрнламида (АА) и О,! г МБА, добавляют 6 мл клеточной суспензии, 057 4 содержащей 600 мг биомассы, 3 мл

iX-ного водного раствора персульфата аммония и 0,4 мл N,N,N,N -теграметил ( этилендиамина (ТЕМЭД) . Полимериэацию ведут при 12-!4 C в течение 2-4 мин, Полученный блок геля механически фра ментируют продавливанием через сито. Гранулы размером 0,5 мм многократно промывают декаитацией физиологическим раствором для удаления невключающихся в гель клеток и остатФ ков компонентов полимеризационной смеси.

20 мл гранул с клетками используют для биосинтеза фермента на среде CP-1, как описано в примере 1.

Суммарный выход целевого продукта составляет 28764 усл.ед./мл.

Пример 3. 10Х-ный раствор поливинилового . спирта в дистиллированной воде нагревают на водяной бане до полного растворения. 10 мл охлажденного ПВС перемешивают с суспензией клеток, содержащей !50200 мг биомассы, полученной, как в примере 1, и отделенной от культуральной жидкости центрифугированием, как в примере 2. Осмесь выпивают в чашку Петри (диаметр 10,5 см, слой 0,5 мм) и облучают 5-15 мин ультрафиолетовьии лучами (кварцевая лампа ПРК) при комнатной температуре. Полученную пленку высушивают

1,5-3,0 сут, фрагментируют на кусочки размером около 1 мм. Перед фрагментацией вожможно также выдерживание пленки с клетками 9 сут при 4 С для повышения ферментативной активности иммобилизованных в ПВС клеток иродуцента.

Измельчейную пленку геля с клетками помещают в колбу на 250 мл с

50 мл среды CP-1 и инкубирают 24 ч при 28-30 С на качалке (220 об/мин).

Затем культуральную жидкость отделяют декантацией, выделяют из нее фермент, как в примере 1. Гель с клетками промывают физиологическим раствором и заливают свежей средой

CP-1. Эти процедуры многократно повторяют. Получают суммарный выход целевого продукта 30030 усл.ед./мл.

Сравнительные данные результатов опытов по известному и предлагаемому способам представлены в таблице.

Из данных, приведенных в таблице, видно, что суммарный выход фер5 1 мента при использовании нммобилиэованных клеток нокардии возрастает в

6-14,5 раз, а скорость синтеза фермента — в 3,5-3,9 раза по сравнению с известным способом (свободные клетки). В предлагаемом способе происходит не только ускорение и увеличение выхода фермента, но и возрастание экономичности способа в силу того, что культуру продуцента выращивают один раз, а весь осталь157057

Суммарный выход фермента

Вариант опыта интеэа уел.ед./мл 7

2081

100

28,9

100

Свободные клетки

Nocardia ар.1

629 112,5

1443 83,6

1382 83,1

13100

389

348 в поливиниловый спирт

30030 в полиакриламидный гель 28764

346

Составитель Е.Лаврова

Техред А.Бабннец Корректор А.Зимокосов

Редактор Н.Яцола

Эаказ 3282/23 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 1 13035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал IHTff "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная. 4

Ф

Клетки Nocardia ар.1 иммобилизированы в Са-альгинатный гель, ной процесс проводят на этих же, закрепленных в геле, клетках, меняя ежедневно ферментационную среду определенного состава. Использова5 ние,нммобилнэованных клеток повышает экономичность и дает возможность сократить время, затрачиваемое на биосинтез фермента,, в 2-3 раза и облегчает очистку, так как сразу получают раствор фермента, свободный от клеток продуцента.