Капсула для клеток, продуцирующих вирусные частицы, способ ее получения и использования
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена капсула для клеток, продуцирующих вирусные частицы, которая состоит из наружной пористой стенки и внутренней полимерной матрицы, заполненной клетками, продуцирующими вирусные частицы. Размер пор пористой стенки не меньше размеров вирусных частиц, продуцируемых клетками, заполняющими полимерную матрицу. Способ получения капсулы включает суспендирование клеток, продуцирующих вирусные частицы, в водном растворе полиэлектролита, после чего суспензию, полученную в форме предварительно сформированных частиц, вводят в осаждающую баню, содержащую водный раствор противоположно заряженного полиэлектролита. Капсула предназначена для использования в генной терапии и/или для лечения рака или любых других сходных заболеваний или расстройств. Изобретение позволяет направленно доставлять ретровирусные частицы в определенный участок организма. 3 с. и 24 з.п.ф-лы, 9 ил.
Изобретение относится к инкапсулированным клеткам, продуцирующим вирусные частицы, в частности ретровирусные частицы, содержащие геном ретровирусного вектора, несущего терапевтические гены; к способам получения таких инкапсулированных клеток; а также к использованию указанных инкапсулированных клеток для доставки генов, в частности терапевтических генов к органам/клеткам-мишеням.
Предпосылки создания изобретения Доставка терапевтически ценных генов к клеткам-мишеням является основным принципом генной терапии. Для того чтобы генная терапия стала обычной процедурой, крайне важно разработать такие системы, которые обеспечивали бы эффективную in vivo-доставку терапевтических генов к клеткам-мишеням. Вирусные векторы, а в частности, векторы на основе ретровирусов, являются наиболее часто используемыми средствами для переноса генов в генной терапии (Morgan и Anderson, 1993). В основе большинства апробированных схем генной терапии лежит ех vivo-метод, который заключается в том, что у пациента удаляют соответствующие клетки, эти клетки генетически модифицируют in vitro, а затем снова вводят пациенту. Этот метод является трудоемким и дорогостоящим, а также ограничен технологическими трудностями. Кроме того, возможности этого метода ограничены конкретными клетками, которые должны быть легко выделены, культивированы и снова имплантированы (Gunzburg и др., 1995). Хотя in vivo-доставка терапевтических генов имеет много преимуществ, однако в той форме, в которой ее осуществляют в этом методе, она является неэффективной и проблематичной. Основной проблемой, связанной с низкой эффективностью переноса генов в данном методе, является необходимость многократного введения вирусного вектора. Такая необходимость осуществления множества циклов доставки вектора делает этот метод не только трудоемким, но также, очевидно, и неэффективным из-за иммунного ответа, продуцируемого против вирусных частиц. Одним из путей решения этой проблемы является непосредственная имплантация клеток, продуцирующих вирусные частицы. Имплантация клеток, продуцирующих вирусные частицы, содержащие геном вирусного вектора, in vivo вблизи органа-мишени или клеток-мишеней, позволила бы также доставлять вирусный вектор непосредственно к клеткам/органам-мишеням. Кроме того, в случае, когда вирусом, используемым для вирусного вектора, является ретровирус, этот метод является более эффективным, чем метод введения множества однократных высоких доз, поскольку в данном случае существует вероятность того, что векторный вирус будет присутствовать при репликации клеток-мишеней, что повышает его шанс инфицировать эти клетки-мишени. К тому же, высвобождение более низких уровней вирусных частиц, но более продолжительное, может оказаться преимущественным, поскольку оно позволяет избежать иммунного ответа против этих вирусных частиц. Для эффективной доставки вирусных векторов клетки, продуцирующие вирусные частицы, должны быть жизнеспособными в течение длительного периода времени после их имплантации хозяину, и в этот период времени должны продуцироваться и высвобождаться из клеток вирусные частицы. В отсутствие значительного иммунного ответа, например после имплантации в головной мозг, эти клетки могут сохранять жизнеспособность в течение продолжительного периода времени (Gulver и др., 1992, Ram и др., 1993). Однако для успешного осуществления имплантации в другие участки организма клетки-продуценты должны быть сначала защищены от иммунного ответа. Таким образом, продолжительная эффективность этого метода зависит от (1) защищенности клеток от иммунной системы хозяина, которая обычно элиминирует клетки, продуцирующие вирусные частицы, особенно если эти клетки происходят от разных видов, как это обычно имеет место в случае таких клеток; и (2) выживаемости клеток in vivo в течение продолжительного периода времени, которое может потребоваться для васкуляризации. Инкапсуляция клеток в проницаемых структурах, которые допускают высвобождение некоторых биологически активных молекул, но которые, в то же время, защищают клетки, продуцирующие эти молекулы, от иммунной системы хозяина, имела определенный успех (см. обзор Chang, 1995). Были инкапсулированы клетки, подвергнутые генетической модификации для продуцирования гормона роста человека (hGH) (Tai и Sun, 1993) или секретируемой формы аденозиндеаминазы человека (Hunges и др., 1994). В обоих этих исследованиях, клетки были инкапсулированы в поли-L-лизин-альгинатные микрокапсулы, и было показано, что эти клетки остаются жизнеспособными в течение длительного периода времени в культуре. Таким образом, было осуществлено длительное продуцирование фермента или гормона. Кроме того, было показано (Tai и Sun, 1993), что после трансплантации микрокапсул мышам клетки остаются жизнеспособными в течение 1 года и продолжают продуцировать hGH, что свидетельствует о том, что капсулы защищают трансфецированные клетки от деструкции иммунной системой хозяина. Сообщалось также о проведении инкапсуляции клеток с использованием других материалов. Клетки почки детеныша хомячка, модифицированные так, чтобы они продуцировали фактор роста нервной ткани, были инкапсулированы в полиакрилонитрил/винилхлорид и имплантированы в головной мозг крысы. Инкапсулированные клетки сохраняли жизнеспособность в течение, по крайней мере, 6 месяцев, и продолжали продуцировать NGF (Winn и др., 1994; Deglon и др., 1995). Кроме того, гепатоциты были успешно инкапсулированы в полиэлектролитный комплекс сульфата целлюлозы и полидиметилдиаллиламмония (Stange и др., 1993). Более 90% инкапсулированных гепатоцитов сохраняли свою жизнеспособность, и в противоположность гепатоцитам, культивированным в виде монослоя, инкапсулированные клетки обнаруживали повышенную метаболическую активность. Однако в этой работе не было высказано каких-либо предположений относительно того, что капсулы из сульфата целлюлозы/полидиметилдиаллиламмония способны обеспечивать рост клеток другого типа, таких как клетки, продуцирующие вирусные частицы, или обеспечивать выход вирусных частиц из этих капсул. Получение капсул из сульфата целлюлозы, используемых в настоящем изобретении, было подробно описано в работе DE 4021050 A1. В этой патентной заявке был также описан синтез сульфата целлюлозы. Методы для полной характеризации капсул из сульфата целлюлозы были разработаны Н. Dautzenberg и др. (Biomat., Art. Celles & Immob. Biotech., 21(3), 399-405 (1993)). Другие капсулы из сульфата целлюлозы были описаны в патенте GB 2135954. Свойства целлюлозных капсул, т.е. размер, размер пор, толщина стенки и механические свойства, зависят от нескольких факторов, например, таких как физические условия, при которых были получены эти капсулы; вязкость осаждающей бани; ее ионная сила; температура; скорость добавления суспензии клеток/сульфата целлюлозы; и структура сульфата целлюлозы; а также от других параметров, описанных группой Dautzenberg. Неожиданно было обнаружено, что продолжительное продуцирование вирусных частиц из имплантированных клеток может быть достигнуто путем инкапсуляции клеток в полиэлектролитном комплексе. Хотя поры таких капсул являются достаточно большими и способны пропускать внутрь капсул антитела и комплемент, которые, как известно, инактивируют вирусы (Welch и др., 1975, Cornetta и др. , 1990), однако каких-либо значительных иммунных или воспалительных реакций либо некроза в области имплантации капсул не наблюдалось. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что капсулы настоящего изобретения хорошо имплантируются хозяину и быстро васкуляризируются. Поэтому инкапсулированные клетки настоящего изобретения обеспечивают пролонгированную доставку вирусных векторов, несущих терапевтические гены in vivo. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение, inter alia, включает (отдельно или в комбинации): продуцирующие вирусные частицы клетки, заключенные в капсулу, состоящую из ядра, содержащего клетки, и пористой стенки, окружающей это ядро; причем указанная пористая стенка капсулы является проницаемой для указанных вирусных частиц; вышеуказанные клетки, заключенные в капсулу, пористая стенка которой состоит из полиэлектролитного комплекса, образованного противоположно заряженными полиэлектролитами; вышеуказанные клетки, заключенные в капсулы, пористая стенка которых состоит из полиэлектролитного комплекса, образованного из полисахаридов, содержащих сульфонатную группу, или производных полисахарида, или из синтетических полимеров, содержащих сульфонатную группу, и полимеров с четвертично-аммониевыми группами; вышеуказанные клетки, заключенные в капсулы, где полисахаридами, содержащими сульфатную группу, или производным полисахарида являются сульфат целлюлозы, ацетосульфат целлюлозы, сульфат карбоксиметилцеллюлозы, сульфат декстрана или сульфат крахмала; а синтетическим полимером, содержащим сульфонатную группу, является сульфонат полистирола; вышеуказанные клетки, заключенные в капсулы, в которых полимером с четвертично-аммониевыми группами является полиметилдиаллиламмоний или поливинилбензил-триметиламмоний; вышеуказанные клетки, заключенные в капсулы, в которых пористая стенка капсулы состоит из комплекса, образованного из сульфата целлюлозы и полидиметилдиаллиламмония; вышеуказанные клетки, заключенные в капсулы, имеющие форму микрокапсул с диаметром 0,01-5 мм, а предпочтительно 0,1-1 мм;вышеуказанные клетки, заключенные в капсулу, которая состоит из матрицы на основе губчатой сульфатной целлюлозы, образующей внутреннюю часть капсулы, окруженную поверхностью стенки капсулы, содержащей поры; причем указанная губчатая матрица заполнена клетками;
вышеуказанные клетки, заключенные в капсулы, где пористая стенка капсулы имеет размер пор от 80 до 150 нм, а предпочтительно от 100 до 120 нм;
вышеуказанные инкапсулированные клетки, продуцирующие вирусные частицы, где указанными вирусными частицами являются ретровирусные частицы, содержащие геном ретровирусного вектора;
вышеуказанные инкапсулированные клетки, продуцирующие ретровирусные частицы, где указанные инкапсулированные клетки представляют собой упаковывающую клеточную линию, трансфецированную экспрессионным вектором, несущим ретровирусную векторную конструкцию, способную инфицировать и регулировать экспрессию в клетках-мишенях одной или нескольких кодирующих последовательностей, присутствующих в указанной ретровирусной конструкции; причем указанная упаковывающая клеточная линия включает по крайней мере один экспрессионный вектор, несущий гены, кодирующие белки, необходимые для упаковки ретровирусной векторной конструкции;
вышеуказанные инкапсулированные клетки, где по крайней мере одну из указанных последовательностей, кодирующих гетерологичные пептиды, выбирают из маркерных генов, терапевтических генов, противовирусных генов, противоопухолевых генов и генов, кодирующих цитокины;
вышеуказанные инкапсулированные клетки, где указанный маркерный ген выбирают из группы, включающей маркерные гены, которые кодируют такие белки, как
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
вышеуказанные инкапсулированные клетки, где линию клеток с дефектом упаковки выбирают из psi-2, psi-crypt, psi-АМ, GP+E-86, PA317, и GP+envAM-12;
вышеуказанные инкапсулированные клетки, где экспрессионным вектором, трансфецированным в упаковывающую клеточную линию, является pBAG, pLXSN, p125LX, pLX2B1 или pc3/2B1, или их производные;
способ получения вышеуказанных инкапсулированных клеток, заключающийся в том, что клетки, продуцирующие вирусные частицы, суспендируют в водном растворе полиэлектролита, а затем суспензию в форме предварительно сформированных частиц вводят в осаждающую баню, содержащую водный раствор противоположно заряженного полиэлектролита;
вышеуказанный способ, в котором образование частиц происходит путем распыления;
вышеуказанный способ, в котором клетки суспендируют в водном растворе полисахарида, содержащего сульфатную группу, или его производного, или синтетического полимера, содержащего сульфонатную группу;
вышеуказанный способ, где полисахарид, содержащий сульфатную группу, или производное полисахарида выбирают из сульфата целлюлозы, ацетосульфата целлюлозы, сульфата карбоксиметилцеллюлозы, сульфата декстрана или сульфата крахмала; а синтетическим полимером, содержащим сульфонатную группу, является полистиролсульфонат;
вышеуказанный способ, где осаждающая баня содержит водный раствор полимера с четвертично-аммониевыми группами;
вышеуказанный способ, где полимером с четвертично-аммониевыми группами является полидиметилдиаллил- или поливинилбензилтриметиламмоний;
вышеуказанный способ, в котором клетки суспендируют в водном растворе сульфата натрий-содержащей целлюлозы, и полученную суспензию вводят в осаждающую баню, содержащую водный раствор хлорида полидиметилдиаллиламмония;
вышеуказанный способ, где водный раствор сульфата целлюлозы состоит из 0,5-50%, а предпочтительно 2-5% сульфата натрий-содержащей целлюлозы, и из 2-10%, предпочтительно 5% фетальной телячьей сыворотки в забуференном физиологическом растворе;
вышеуказанный способ, где водный раствор в осаждающей бане состоит из 0,5-50%, предпочтительно 2-10%, а более предпочтительно 3% хлорида полидиметилдиаллиламмония в забуференном растворе;
вышеуказанные инкапсулированные клетки, полученные вышеописанным способом;
использование вышеуказанных инкапсулированных клеток для доставки генов к органам/клеткам-мишеням, предусматривающее:
a) культивирование инкапсулированных клеток в подходящей среде; и
b) имплантацию инкапсулированных клеток в живой организм животного, включая человека;
использование, описанное выше, где органом-мишенью/клетками-мишенями являются молочная железа или поджелудочная железа; и
использование, описанное выше, где органом-мишенью/клетками-мишенями являются клетки гладкой мышцы и клетки других типов, окружающие артерии. Цели настоящего изобретения
Целью настоящего изобретения является получение инкапсулированных клеток, продуцирующих вирусные частицы, причем указанные капсулы позволяют высвобождаться вирусным частицам, продуцируемым клетками, не вызывая при этом значительного иммунного или воспалительного ответа хозяина после их имплантации этому хозяину. Другой целью настоящего изобретения является способ получения указанных инкапсулированных клеток, продуцирующих вирусные частицы. Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа доставки генов, а в частности, терапевтических генов, к органу-мишени/клеткам-мишеням путем имплантации указанных инкапсулированных клеток, продуцирующих вирусные частицы, хозяину; и тем самым способа продолжительного продуцирования и высвобождения вирусных частиц в органах-мишенях или вблизи клеток-мишеней. Описание изобретения
В соответствии с настоящим изобретением, клетки, продуцирующие вирусные частицы, заключают в капсулы, которые способны высвобождать вирусные частицы, продуцируемые клетками, не вызывая при этом значительного иммунного или воспалительного ответа хозяина после их имплантации этому хозяину. Инкапсулированные клетки настоящего изобретения могут быть получены путем суспендирования клеток, продуцирующих вирусные частицы, в водном растворе полиэлектролита (например, выбранного из полисахаридов, содержащих сульфатную группу, или их производных, и синтетических полимеров, содержащих сульфонатную группу), с последующим введением суспензии, полученной в виде предварительно сформированных частиц, в осаждающую баню, содержащую водный раствор противоположно заряженного полиэлектролита (например, полимера с четвертично-аммониевыми группами). Полисахаридами, содержащими сульфатную группу, или их производными являются сульфатная целлюлоза, ацетат сульфатной целлюлозы, сульфатная карбоксиметилцеллюлоза, сульфат декстрана, или сульфат крахмала в форме соли, а в частности, натриевой соли. Синтетическим полимером, содержащим сульфонатную группу, может быть полистиролсульфонатная соль, а предпочтительно натриевая соль. Полимерами, имеющими четвертично-аммониевые группы, являются полидиметилдиаллиламмоний или поливинилбензилтриметиламмоний в форме их соли, предпочтительно хлорида. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки, продуцирующие вирусные частицы, инкапсулированы в комплекс, образованный из сульфатной целлюлозы и полидиметилдиаллиламмония. Указанные капсулы получают предпочтительно путем суспендирования клеток, продуцирующих вирусные частицы, в растворе, содержащем 0,5-50%, предпочтительно 2-5% натрий-сульфатной целлюлозы, и 5% фетальной телячьей сыворотки, необязательно в буфере. Затем эту суспензию с помощью дозирующего устройства (например, воздушного эжектора или пьезоэлектрической системы) вводят, размешивая при этом, в осаждающую баню, содержащую 0,5-50%, предпочтительно 2-10%, а наиболее предпочтительно около 3% хлорида полидиметилдиаллиламмония, необязательно в буфере. Образование капсул происходит за миллисекунды, и клетки-содержащие капсулы выдерживают в осаждающей бане в течение времени от 30 секунд до 5 минут, а затем промывают. Быстрота этого метода дает гарантию того, что инкапсулируемые клетки не будут подвергаться чрезмерному стрессу во время всей процедуры (Stange и др., 1993). Капсулы настоящего изобретения имеют диаметр, варьирующий от 0,01 до 5 мм, а предпочтительно от 0,1 до 1 мм. При этом могут быть изготовлены капсулы, содержащие разные количества клеток. С использованием способа инкапсулирования настоящего изобретения в полиэлектролитный комплекс может быть инкапсулировано до 1010, а предпочтительно 105-107 клеток, продуцирующих вирусные частицы. Капсулы, состоящие из сульфатной целлюлозы и полидиметилдиаллиламмония имеют прекрасные механические свойства и могут быть изготовлены в различных размерах и с различным размером пор. Размер пор капсул составляет от 80 до 150 нм, а предпочтительно от 100 до 120 нм. Инкапсулированные клетки могут быть культивированы в нормальной среде для культивирования клеток (природа которой зависит от конкретно инкапсулируемых клеток) при стандартных условиях влажности, температуре и концентрации СО2. Высвобождение вирусных частиц из капсул в культуральную среду в процессе культивирования может быть продемонстрировано либо с использованием RT-PCR-технологии (посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой), либо путем переноса бесклеточного супернатанта (отфильтрованного через 0,45-микронный фильтр) к клеткам-мишеням с последующим выявлением вирусной инфекции с помощью анализа на активность маркерных белков, кодируемых генами, несущими вирусную векторную конструкцию, содержащуюся в вирусной частице. Если маркерный ген, присутствующий в вирусном векторе, является геном, несущим устойчивость к специфическому соединению на клетке-мишени, то может быть установлен титр вируса, продуцированного этой системой. После соответствующего периода культивирования (обычно, не менее 1 часа и не более 30 дней) капсулы, содержащие клетки, могут быть хирургически имплантированы либо непосредственно, либо путем инъекции с использованием шприца в различные участки организма. Вирусные частицы, продуцируемые инкапсулированными клетками настоящего изобретения, могут быть получены на основе любого вируса, используемого для генной терапии, включая, но не ограничиваясь ими, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса или ретровирусы; см., например, обзор Gunzburg и Salmons, 1995. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения инкапсулированными клетками являются упаковывающие клеточные линии, продуцирующие ретровирусные частицы, содержащие геном ретровирусной векторной конструкции, несущей маркерные и/или терапевтические гены. Ретровирусные векторные системы состоят из двух компонентов:
1) первым компонентом является экспрессионный вектор (плазмидный вектор), несущий ретровирусную векторную конструкцию, представляющую собой модифицированный ретровирус, в котором гены, кодирующие вирусные белки, были заменены терапевтическими генами, включая, но необязательно, маркерные гены, предназначенные для перенесения к клеткам-мишеням. Поскольку замена генов, кодирующих вирусные белки, приводит к значительному повреждению вируса, то он должен быть "спасен" с помощью второго компонента данной системы, который обеспечивает защиту модифицированного ретровируса от возможного его повреждения вследствие утраты вирусных белков;
2) вторым компонентом является линия клеток, которая продуцирует большое количество вирусных белков, но которая при этом не способна продуцировать компетентный в отношении репликации вирус. Эта клеточная линия известна как упаковывающая клеточная линия и представляет собой клеточную линию, трансфецированную плазмидами, несущими гены, позволяющие осуществлять упаковку модифицированного ретровирусного генома. Эти плазмиды регулируют синтез нужных вирусных белков, необходимых для продуцирования вириона. Для генерирования упакованного ретровирусного вектора векторную плазмиду трансфецируют в упаковывающую клеточную линию. В этих условиях модифицированный ретровирусный геном, включающий встроенные терапевтические и необязательно маркерные гены, транскрибируется с векторной плазмиды, и генерированный в результате этого модифицированный ретровирусный геном упаковывается в ретровирусные частицы. Клетка, инфицированная такой вирусной частицей, не может продуцировать вирусные частицы, поскольку в этих клетках отсутствуют вирусные белки. Однако в инфицированных клетках присутствует ретровирусная векторная конструкция, несущая терапевтические и маркерные гены, и эта конструкция может экспрессироваться в данных клетках. В WO 94/29437, WO 89/11539 и WO 96/07748 описаны различные типы ретровирусных векторных систем, которые могут быть использованы в целях настоящего изобретения. Вирусные частицы, продуцированные инкапсулированными клетками настоящего изобретения, могут быть сконструированы так, что они будут содержать геном вирусного вектора, несущего маркерные и/или терапевтические гены. Примерами маркерных или терапевтических генов, присутствующих в вирусном векторе, могут служить гены, которые кодируют такие белки, как
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
Липофекция РА317 вектором pBAG и выделение резистентных клеток G418
Амфотропные NIH3T3 основанные упаковывающие клетки РА 317 (Miller & Buttimor, 1986) культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% фетальную сыворотку теленка. Затем за один день до липофекции клетки засевали в 10-сантиметровые чашки Петри при плотности 3
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/8226.gif)
Микроинкапсулирование
107 клеток суспендировали в 1 миллилитре забуференного физиологического раствора, содержащего 2,5%-ный натрий-содержащий сульфат целлюлозы и 5%-ную фетальную сыворотку теленка, а затем полученную суспензию вводили с помощью дозирующей системы (эжекторной системы) в баню для осаждения, содержащую 2-3%-ный полидиметилаллиламмоний в забуференном физиологическом растворе. Образование капсулы происходило за миллисекунды с последующим формированием внутреннего, более пористого слоя для механической поддержки, состоящего, в основном, из сульфата целлюлозы. Капсулы, содержащие клетки, выдерживали в бане для осаждения в течение времени от 30 секунд до 5 минут, а затем промывали в среде DMEM (Stange и др., 1993). Для биологических исследований были использованы партии, полученные с различными параметрами, описанными выше, т. е. такими как концентрация натрий-содержащего сульфата целлюлозы, поток в эжекторной системе и время пребывания в бане для осаждения. Примерами характерных условий являются следующие условия: 2,5% натрий-содержащий сульфат целлюлозы, 2% полидиметилаллиламмоний и 1 минута пребывания в бане для осаждения; либо 1,5% натрий-содержащий сульфат целлюлозы, 2% полидиметилаллиламмоний и 0,5 минут пребывания в бане для осаждения; либо 3% натрий-содержащий сульфат целлюлозы, 3%-ный полидиметилаллиламмоний и 2 минуты пребывания в бане для осаждения. Точные параметры были выбраны также с учетом точного размера капсул, которые нужно получить, толщины стенок капсул, а также других свойств. Пример 3
Имплантация микрокапсул в молочные железы мыши
Микрокапсулы вводили в молочные железы двухмесячных самок мышей BALB/с путем операции по типу "ключ-замок", и входное отверстие закрывали одним швом. В каждый участок операции было введено до 6 капсул диаметром 0,5-2 мм. В in vitro-исследованиях вируса, высвобождаемого из микрокапсул, структуру микрокапсул и влияние имплантации капсулы в иммунокомпетентную мышь исследовали с использованием следующих тест-методов:
A)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
Обнаружение инфецированных клеток путем гистохимического окрашивания осуществляли, как описано ранее (Cepko, 1989). Срезы клеток, капсул или ткани промывали охлажденным PBS, а затем фиксировали 2% параформальдегидным раствором в течение 20 минут - 24 часов в соответствии с толщиной образца. После интенсивной промывки фосфатно-буферным раствором срезы клеток, капсул или ткани были инкубированы в растворе, содержащем субстрат Х-gal (20 мМ K3FeCN6, 20 мМ K4FeCN6
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/8226.gif)
4
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/8226.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
Вирусные частицы от 5 мл супернатанта культуральной среды капсул осаждали путем ультрацентрифугирования (240000
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/8226.gif)
Геномную ДНК (1 мкг) амплифицировали с помощью PCR с использованием одного праймера, расположенного внутри остаточных последовательностей env вектора BAG, и другого праймера в полиомной области плазмиды, расположенной за пределами ретровирусных векторных последовательностей (фиг.3В). PCR-реакции проводили, как описано выше, с использованием следующих условий: 1 мин при 94oС, 2 мин при 50oС и 3 мин при 68oС за 35 циклов. PCR-продукт гибридизировали с 32Р-меченым Xbal-ДНК-фрагментом 1,5 kb вектора pBAG, который является специфичным к полиомным последовательностям. F) Электронная микроскопия
Образцы для оценки сканирующей электронной микроскопией (SEM) и трансмиссионной электронной микроскопией (ТЕМ) промывали в PBS (рН = 7,35), а затем фиксировали в 1% глутаральдегиде в PBS в течение 15 минут, после чего фиксировали в 2% OsO4 в течение 15 минут. Образцы дегидратировали в ступенчатом градиенте этанола, а затем разделяли на две группы: а) SEM-образцы осушали при критической температуре с использованием СО2 и покрывали платиновым слоем 1-3 нм (Emscope SC 500; Ashford, England). Покрытые образцы оценивали в эмиссионном сканирующем электронном микроскопе при 10 кВ (Jeol JSM-6300F; Токио, Япония) с ускоряющим напряжением 5-10 кВ во втором режиме; b) ТЕМ-образцы погружали в Epon. Сверхтонкие срезы дважды окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца, и прослеживали в просвечивающем электронном микроскопе Zeiss ЕМ-10С (Oberkochen, Германия). Результаты
In vitro-исследования вируса, высвобождаемого из микрокапсул
Окрашивание клеток в микрокапсулах, полученных в Примере 2, субстратом X-gal, описанным в вышеуказанном тесте на
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
Были получены срезы микрокапсул, а их структура была проанализирована с помощью электронной микроскопии. Внутреннюю часть капсулы, состоящую из губчатообразной матрицы, заполняли клетками (фиг.4). Анализ поверхности микрокапсул, проведенный с помощью сканирующей электронной микроскопии, выявил присутствие пор, которые являются достаточно большими, что позволяет ретровирусным векторным частицам высвобождаться из капсул, что подтверждает белая полоса на изображении поверхности капсулы (фиг.4), которая представляет средний диаметр ретровирусной частицы. In vivo-стабильность в иммунокомпетентных мышах
Для оценки in vivo-стабильности микрокапсул и для того чтобы определить продуцируют ли микрокапсулы или вирус высокий иммунный ответ, эти микрокапсулы имплантировали в молочные железы двухмесячных самок мышей BALB/c. Мышей умерщвляли в различные интервалы времени после имплантации для количественной оценки присутствующих микрокапсул и для того, чтобы определить продуцируется ли инфекционный вирус. Как можно было явно видеть, имплантированные микрокапсулы были погружены внутрь жирного слоя молочных желез по крайней мере в течение 6 недель после имплантации (фиг.5А). Интересно отметить, что васкуляризация вблизи микрокапсул происходила у всех анализируемых животных (фиг. 5А), что, вероятно, является результатом продуцирования факторов ангиогенеза или факторов роста упаковывающими клетками. Срезы, приготовленные из микрокапсул, и тканевое окружение молочной железы подтверждают, что кровеносные сосуды могут находиться в непосредственной близости от капсул (фиг.5В). С помощью этих срезов было также выявлено присутствие слоя соединительной ткани, расположенного между микрокапсулой и тканью молочной железы, эти срезы не обнаруживали высокого противовоспалительного или иммунного ответа, направленного против микрокапсул или вируса-продуцирующих клеток, которые содержатся в этих микрокапсулах. Для иллюстрации того, что инфекционные ретровирусные векторные частицы высвобождаются из капсул и инфицируют окружающую ткань молочной железы, некоторые срезы были проанализированы на экспрессию
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
В данном примере описано конструирование ретровирусного экспрессирующего вектора для внутриопухолевой инфекции, который содержит ген для цитохрома крысы Р450 2В1. Вектор экспрессии pLX2B1, показанный на фиг.6, конструировали путем лигирования фрагментов, полученных от плазмиды pLX125 и pSWl (Kedzie и др., 1991). Плазмиду pLX125 линеаризовали ферментом Hpal, и полученные тупые концы дефосфорилировали с использованием фосфатазы кишечника теленка. ДНК очищали путем разделения на 1% агарозном геле, а затем вырезали и выделяли в соответствии со схемой Qiaquick (Qiagen). После осаждения этанолом ДНК ресуспендировали в воде. Клонирующий вектор pSWl гидролизовали ферментами Smal и Hincll с получением двух затупленных по концам фрагментов. Смесь для гидролиза разделяли на 1% агарозном геле. Самый короткий фрагмент (1,5 kb), содержащий кДНК цитохрома Р450 2В1 крысы (Fuji-Kuriyama и др., 1982), вырезали и элюировали в соответствии с процедурой экстрагирования ДНК (Qiaquick), а затем осаждали этанолом и ресуспендировали в воде. 7,6 фМолей pLX125 и 24 фМолей Smal/Hincll-фрагмента смешивали и лигировали в течение 3 дней при 12oС с использованием Т4-лигазы (Boehringer). Лигазу инактивировали при температуре 65oС в течение 10 минут, а затем ДНК осаждали 10-кратным объемом бутанола. Осажденную ДНК ресуспендировали в воде и подвергали электропорации в DH10B-бактерию (Gibсо). Колонии, резистентные к ампициллину, отбирали, а затем полученную ДНК гидролизовали ферментами SspBl/Sall, BamHl/SsBl, Pvul и BamHl. Конечную правильно сконструированную плазмиду обозначали pLX2B1. Липофекция
За один день до липофекции, 3
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/8226.gif)
Полученные упаковывающие клеточные линии, продуцирующие ретровирусный вектор, инкапсулировали, как описано выше, в Примере 2. Имплантация
Полученные капсулы вводили хирургически по типу "ключ-замок" возле или в либо трансплантированные, либо спонтанно возникшие опухоли мышей BALB/c или GR. В каждый участок операции было введено 6 капсул диаметром в 1 мм. Этот участок операции закрывали одним швом. Затем мышей обрабатывали циклофосфамидом или ифосфамидом посредством местного введения путем непосредственной внутриопухолевой инъекции 100 мкл - 20 мг/мл или системных концентраций 130 мг GPA/кг массы тела (внутрибрюшинно) и 40-60 мг IFO/кг массы тела (внутрибрюшинно) в течение максимального периода времени 10 недель. В течение этого периода времени ежедневно прослеживали размер опухоли вплоть до ее визуального обнаружения. После этого мышей умерщвляли, а ткань, содержащую введенные капсулы и опухоль, удаляли и получали гистологические срезы для оптической и электронной микроскопии. Эти срезы явно показывали достаточно хорошее приживление капсул, васкуляризацию, а также не обнаруживали наличия лимфоцитов, указывающих на клеточный иммунный ответ. Эти срезы также не показали каких-либо признаков гибели клеток или некроза клеток внутри капсулы. В противоположность этому опухоли обнаруживали некроз и явное визуальное снижение своих размеров во время периода испытаний. Пример 5
В этом примере описана конструкция стабильной клеточной линии, которая экспрессирует цитохром крысы Р450 2В1 конститутивно. Вектор экспрессии рс3/2В1 конструировали путем лигирования фрагментов, полученных от плазмиды pcDNA3 (Invitrogen) и pSW1 (Kedzie и др., 1991). Плазмиду pcDNA3 гидролизовали ферментами XhoI/XbaI, и полученные липкие концы фрагментов дедефосфорилировали с использованием фосфатазы кишечника теленка. ДНК-каркас вектора очищали путем выделения на 1% агарозном геле, вырезали и получали в соответствии со схемой Qiaquick (Quigen). После осаждением этанолом ДНК ресуспендировали в воде. Клонирующий вектор pSWl гидролизовали ферментами XhoI и XbaI с получением двух фрагментов. Гидролизную смесь выделяли на 1% агарозном геле. Наиболее короткий фрагмент (1,5 kb), содержащий кДНК цитохрома крысы Р450 2В1 (Fuji-Kuriyama и др., 1982), вырезали, элюировали в соответствии со схемой экстракции ДНК (Qiaquick), осаждали этанолом и ресуспендировали в воде. 8,3 фМолей каркаса pcDNA3 и 24,8 фМолей XhoI/XbaI фрагмента pSWl смешивали и лигировали в течение одного дня при 12oС с использованием Т4-лигазы (Boehringer). Лигазу инактивировали в течение 10 минут при 65oС и ДНК осаждали 10-кратным объемом бутанола. Осажденную ДНК ресуспендировали в воде и подвергали электропорации в DH10B-бактерию (Gibco). Колонии, резистентные к ампициллину, отбирали и после анализа полученную ДНК гидролизовали ферментами EcoRI, BamHI, EcoRV и XhoI. Конечную правильно сконструированную плазмиду обозначали pc3/2B1. Липофекция
За один день до инфицирования, 3
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/8226.gif)
Фиг. 1: Гистологическое окрашивание инкапсулированных клеток РА317, стабильно трансфецированных вектором pBAG для иллюстрации экспрессии
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/8226.gif)
(B) оптическая микроскопия поперечного сечения капсулы в течение 4 недель после имплантации в молочную железу мыши (увеличение
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/8226.gif)
(C) инфицирование клеток молочной железы мыши после имплантации капсул, содержащих BAG-вектор-продуцирующие клетки РА317. Фиг.6: Структура экспрессионного вектора pLX2B1, содержащего ген, который кодирует цитохром Р450 2В1 крысы и который находится под контролем промотора U3-MMT после конверсии промотора. References:
Cepko, С. (1989). Lineage analysis in the vertebrate nervous system by retrovirus-mediated gene transfer. Meth. Neurosci. 1, 367-392. Chang, P.L. (1995). Nonautologous somatic gene therapy. In Somatic Gene Therapy. P.L. Chang, ed. (CRC Press, Boca Raton) pp.203-223. Cornetta, K. , Moen, R.C., Culver, K., Morgan, R.A., Mclachlin, J.R., Sturm, S., Selegue, J., London, W., Blaese, P.M., and Anderson, W.F. (1990) Amphotropic murine leukemia retrovirus is not an acute pathogen for primates. Hum. Gene Ther. 1, 15-30. Crandelll, R. A. , Fabricant, C.G., and Nelson-Rees, W.A. (1973). Development, characterization, and virus susceptibility of a feline (Felis catus) renal cell line (CRFK). In vitro 9, 176-185. Culver, K. W. , Ram, Z., Wallbridge, S., Ishii, H., Oldfield, E.H., and Baese, P. M. (1992). In vivo gene transfer with retroviral vector producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science 256, 1550-1552. Deglon, N. , Zurn, A., Baetge, E., and Aebischer, P. (1995) Development of gene therapy for the treatment of neurodegenerative diseases; Parkinson disease, Alzheimer disease and amyotrophic lateral sclerosis therapy; polymer encapsulated neurotrophic-secreting cell intrathecal transplantation. Gene Ther. 2, 563. Fuji-Kuryama, Y. , Mizukami, Y., Kawajiri, K, Sogawa, K. and Muramutsu, M. : Primary structure of a cytochrome P-450: Coding nucleotides sequence of phenobarbital-inducible cytochrome P-450 cDNA from rat liver, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982 May; 79: 2793-97.
![](https://img.poleznayamodel.ru/img_pat/48/486911.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/img_pat/48/486912.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/img_pat/48/486913.gif)
Формула изобретения
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9