Способ получения иммобилизованного в геле цитохрома @
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО В ГЕЛЕ ЦИТОХРОМА В вКлючаювщй полимеризацию геля из альбумина в присутствии глутарового альдегида , цитохрома 2 молочной кислоты , отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности целевого продукта, при полимеризации геля дополнительно вводят декстраны с мол. мае. от 40 ОрО до 60 000 дальтон.
СОКИ СОВЕТСНИХ
СИЗ
РЕСПУБЛИК ае св
3(5é) С 12 Н 11 04
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
re @ЕЛА@ И СВРЕТЕНИЙ е О 1 РЫТИй (21) 3555820/28-13 (22) 24. 12. 82 (46) 30.04.84, Бюл. В 16 (72) В-С.А.Лауринавичюе, Ю.Ю.Кулис, В.В.Гурявичене, P.К.Вайткевичюс и В.С.Аитаиавичюс (71) Институт биохиьши АН ЛитССР (53) 577.15 (088.8) (56) 1. ТозИо Shiabo, Masaaki Sugiura, Nazi Каша. Poteatiometri
Rnsyee Е1е1сйтойе fox Lactate, Aeal, СЬеа, 1979, Ч. 51, 100-104.
2.швирмицкас Г.-Ю.С. Структурнофункциональные свойства цитохрома
В как переносчика злектронов.
Диссертация на соискание ученой стенеИи кандидата биологических наук. Институт биохимии АН Литовской
ССР, Вильнюс, 1980, с. 45, 60. 93. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО В ГЕЛЕ ЦИТОХРОИА В, включающий полнмеризацию геля из альбумина в присутствии глутарового альдегида, цитохрома В и молочной кис2 лоты, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности целевого продукта, при полимеризации геля дополнительно вводят декстраны с мол. мас. от 40 000 до 60 000 дальтон.
1089120
Изобретение относится к получению иммобилизованных ферментных препаратов, а именно к получению иммобилизованного цитохрома В, который используется для определения молочной кислоты.
Известен способ иммобилизации е цитохрома В, заключающийся в включении фермента в гелевую структуру
5Х-ного желатинового геля (1) .
Недостатками данного способа являются низкий выход активности фермента при иммобилизации (10,4Х) а также низкая стабильность — 50Хная инактивация за 3,83 ч.
Наиболее близким к предлагаемому является способ получения иммобилизованного в геле цитохрома В2, включающий полимеризацию геля .из альбумина в присутствии глутарового альдегида, цитохрома В> и молочной кислоты )2j .
Недостатком иммобилизации цитохрома В в альбуминовом геле в присутствии молочной кислоты является низкая стабильность получаемого фермента, так как последний инактивируется на 50Х в течение 9,2—
14,1 ч.
Цель изобретения — повышение стабильности целевого продукта.
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованного в геле цитохрома В2, включающему полимеризацию геля из альбумина в присутствии глутарового альдегида, цитохрома В2 и молочной кислоты, при полимеризации геля дополнительно вводят декстраны с мол. мас. от
40 000 до 60 000 дальтон.
Использование. высоких концентраций глутарового альдегида и получение прочного жесткого геля, в котором, благодаря добавлению высокомолекулярного декстрана, цитохром
В2 обеспечивает высокую стабильность (табл. 1).
Пример 1. 75 ед. цитохрома В, 20 мг декстрана (мол. мас.
40000) и 20 мг бычьего сывороточного альбумина растворяют в 0,2 мл
5 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2 содержащем 0,1 М КС0 и 10 мкм молочной кислоты. В раствор добавляют
0,05 мл 25-ного,глутарового альдегида и на целлофановую мембрану
10 толщиной 35 мкм и площадью 30 см.
Мембрану накрывают второй такой же диализной мембраной и выдерживают в холодильнике при +3-5 в течео ние 6 ч. Полученный иммобилизо- ванный фермент разрезают на кусочки (2>2 см ), Пример 2. Иммобилизацию проводят аналогично примеру 1, но вместо декстрана с мол. мас. 40000 используют декстран с мол.мас.
20000 дальтон.
Пример 3. Иммобилизацию проводят аналогично примеру 1, только вместо декстрана с мол. мас. 40000 используют декстран с мол. мас. 60000 дальтон.
Иммобилизованный в присутствии декстранов цитохром В в течение
6 сут теряет только УОХ своей
З0 активности (фиг. 2). Наилучшие результаты получают, применяя декстран с мол. мас ° 40000 — 60000 дальтон.
Предлагаемый способ позволяет
З5 получить иммобилизованный цитохром
В, который инактивируется íà 50Х только в течение 66,7-79,6 ч. По сравнению с известным способом стабильность возрастает 4,7-8,7 раза, 40 т.е. иммобилизованный согласно предлагаемому способу фермент способен превратить в 5 — 8 раз больше количество субстрата до полной инактивации цитохрома, количество превраща45 eMoro субстрата равно Ао/К, где А©начальная активность, К вЂ” констан та инактивации, k = 0,69 (Т 50).
В табл. 1 дан выход по активности и стабильность цитохрома В при разных способах иммобилизации.
1089120
Таблица 1
Выход по активь50 ч ности, Х
Способ иммобилизации
5Х хелатина, рН 8 (аналог) j1) 3,8
6,7Х альбумина, О,!2% глутарового альдегида, 10 мм молочной кислоты рН 7,2 (прототип) P) 9,2-14,1
Предлагаемый
96 пример 1
73,9
66,7
79,6
90
Таблица 2 (I 1
Выход по активности, Х за время работы фермента, сут
ИммобилизованньФ фермент
1 . 2 3 4 5 6
100
33
80
100
29
52
100
52
100
100
Составитель В.Муронец
Техред А.Ач Корректор С.йекмар
Редактор Н.Ковалева
Заказ 2871/23 Тирах 522 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", r. Ухгород, ул. Проектная, 4
П р. и м е ч а н и е: ферментативную активность определяют в присутствии 10 мм молочной кислоты, 1 мМ феррицианида калия, О, 1 мм фосфатный буфер, рН 7,2; 25 С. о рН 8,0 25 С (Т) рН 7,2; 25 С (2-3), I
В табл. 2 дана стабильность иммо- в растворах молочной кислоты конценбилизованного цитохрома В2 при рабо- трации от 1 до 10 мМ. (Остальное время те в сут по-8 ч в комнатных условиях, сут фермент хранится в холодильнике) .
