Способ получения комплекса протеолитических ферментов

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ из отхопов производства стрептоми ,цина, вк-точающий очистку исходного сырья от балластных белков, стрептомицина и солей,выделение целевого продукта и его сушку, отличающийся тем, что, с целью удешевления способа и повышения протеолитической активности ферментного комплекса, в качестве источника сьфья используют сточные воды производства стрептомицина , которые упаривают в трех-пятикратном объеме, а очистку осушествляют путем введения хлористой соли кальция или магния в количестве 5О55 г на 1 л упаренных сточных вод, 2„ Способ по п. Ij о т л и ч а ю ш и и с я тем, что перед упариванием проводят дополнительную стабилизацию фар -ментного комплекса путем введеш1Я хлористой соли кальция или магния в количестве 0,2-4 г на 1 л сточных вод.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН д11 С 12 и 9/50

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬТИЙ (21) 3359810/28-13 (22) 23.1 1,81 (46) 07.07.83 ° Бюл. ¹ 25 (72) И. Ф. Мишунин, В. А. Богуславский, С. И. Трофимова, И. H. Баширова, И. А. Вина и А. Я. Кестере (71) Институт биохимии им. А. В. Пелладина (53) 577,15(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР № 412248, кл, С 12 hl 9/48, 1972 °

2. А вт орск ое с вид ет ельство CC CP № 301351, кл, С 12 H 1/20, 1970.

3, Авторское свидетельство СССР № 204485, кл. С 14 С 1/06, 1965. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ из отходов производства стрептоми„„SU„„10 72О6,цина, включающий очистку исходного сырья от балластных белков, стрептомицина и солей, выделение целевого продукта и его сушку, отличающийся тем, что, с цепью удешевления способа и повышения протеолитической активности ферментного комплекса, в качестве источника сырья используют сточные воды производства стрептомицина, которые упаривают в трех-пятикратном объеме, а очистку осушествляют путем введения хлористой соли кальция или магния в количестве 5055 г на 1 л уперенных сточных вод, 2. Способ по и, 1 о т л и ч а ю— ш и и с я тем, что перед упариванием проводят дополнительную стабилизацию фер = ментного комплекса путем введения хлористой соли кальция или магния в количестве 0,2-4 г на 1 л сточных вод.

1027206

Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к способам получения протволитических ферментов из микробиологического сырья, в частности из культуры 5%eeptovnqreq .

Известен способ получения протеолитичвских ферментов из отходов производства итаконовой кислоты, а именно из мицелия плесневого гриба Aepeegi_#_ug ГГЕ0 t Ц

Недостатком етого способа является низкая активность получаемого препарата (6-9 вд/г).

Известен способ получения комплекса протеолитических ферментов, продуцируемых 5tYCotor3C,е рчьЕМ, включающий получение культуральной жидкости, очистку ве от стрептомицина изопропиловым спитром, выделение целевого продукта и его сушку $2).

Недостатками данного способа являют-

20 ся относительно низкая протеолитическая активность перепарата (700 вд/г препарата по Кунитцу) и недостаточная очистка от стрептомицина (его содержание впрвпарате составляет 3,5%).

Известен также способ получения комплекса протеолитических ферментов (протеолитичвского препарата протелина) из отходов производства стрептомицина, включающий очистку исходного сырья от балластнь;х белков, стрептомицина и солей, выделение целевого продукта и его сушку, согласно которому в качестве исход", ого сырья используют не непосредственно сточные воды, а отделенный от 35 них мицелий, очистка от стрептомицина тримесей осуществляется сорбцией на катионите с последующей хроматографией и депигментацией (3 j.

Недостатками способа являются трудо- 40 емкость его осуществления, сложность технологии, недостаточная активность протеолитического комплекса.

Бель изобретения — удешевление спосооа и повышение протеолитичвской актив- 45 ности ферментного комплекса, Поставленная цель достигается твм, что согласно способу получения комплекса протеолитических ферментов из отходов производства стрептомицина, вклю50 чающему очистку исходного сырья от балластных белков, стрептомицина и солей, выделение целевого продукта и его сушку, в качестве источника сырья используют сточные воды производства стрептомицина, которые упаривают в трех-пятикратном объеме, а очистку осуществляют путем введения хлористой соли кальция или магния в количестве 50-55 г на 1 л упаренных сточных вод.

При атом перед упариванием проводят дополнительную стабилизацию фврментного комплекса путем введения хлористой соли кальция или магния в количестве

0,2-4 г на 1 л сточных вод..

Пример 1.K 5 лсточныхвод, имеющих следующую характеристику: содержание белка 4,3-5,5 мг/мл; содержание стрептомицина 0,1-6,0 ед/мл; исходная протеолитическ ая активность (по

Кунитцу) О>5-11,5 ед/мл; рН 4,5-6,0 полученных после отделения стрептомицина, непосредственно перед упариванием вводят СаС1 6Н О в количестве 0,001Ì.

Затем раствор концентрируют на циркуляционном испарителе, который обеспечивает мягкое упариванив раствора до 1/5 объема при остаточком да влении 1 020 мм рт. ст. и температуре не выше

40 о С в течение 2 ч. Концентрированный раствор охлаждают до 4 С, а затем вводят СаС в концентрации 0,23 М до насыщения. Суспензию выдерживают

10 ч. При 4 С, Осадок отделяют полчаса центрифугированием при 8 тыс. об./мин.

Надосадочную жидкость диализируют

1-1,5 суток при температуре не выше

10 С, а затем лиофильно сушат.

Выход препарата — 0,05% (по расчету на 100 л сырья).

Активность фврментного комплекса

2420 ед/г препарата при определении протеолитической активности по методу

Хунитца, Получаемый комплекс содержит трипсин- и хнмотрипсинподобные протеиназы, а также амино- и карбоксипептидазы.

Состав сточных вод непостоянен, rromo- o му предварительная стабилизация не является обязательной операцией.

Пример 2. Последовательность операций осуществляют в соответствии с методикой, описанной в примере 1, Варьируют количество вводимой в сточные воды хлористой соли кальция: до управления для стабилизации в количестве 0,01 М, после упаривания для очистки - 0,24 М, Упаривание осуществляют в трехкратном объеме.

Выход препарата составляет 0,1%, Активность препарата по Кунитцу

6220 ед/г, Пример 3, Способ получения комп лекса протволитических ферментов осуществляют в соответствии со схемой, 1027206

Составитель Е. Воробьева

Редактор О, Половка Техред Т.Маточка Корректор Г. ОгаР

Заказ 4672/28 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 описанной в примере L, однако в качестве хлористой сопи берут М С8 в коли честве: до упаривания 0,02 М, после упаривания — 0,25 М.

Выход препарата составляет 0 1%.

Активность препарата по Кунитцу

7000 ед/г.

Уменьшение количества (менее 0,001М) хлористой соли приводит к снижению активности препарата до 42% при упаривании, а повышение концентрации более

0,02 М вЂ” к увеличению времени упаривания раствора и инактивации ферментно— го комплекса; снижение концентраций (менее 0,23 М) СаС9 или М Щ приводит к недостаточной очистке раствора от балластных белков, а увеличение концентрации соли (более 0,25 M) — к потерям активности за счет осаждения части 20 ферм ентного комплекса.

По своему составу препарат представляет собой комплекс эндо- и экэопептигидролаз включакецих химотрипсин, трипсин, нейтральные прсхгеинаэы, карбо,ксипептидаэы, амннопептидаэы.

Использование предлагаемого способа обеспечивает по сравнению с известными следующие преимущества: получение фер,ментного протеолитического комплекса с высокой активность (до 7000 ед/г препарата по Кунитцу); достижение хорошей очистки препарата; удешевление способа эа счет утилизации сточных вод производства стрептомицина; стоимость которых 2 руб. за 1 м, простоту и доступ-, ность средств для осуществления предлагаемого способа.

Таким образом, изобретение позволяет удешевить способ и повысить активность протеолитического комплекса.