Способ очистки протеолитических ферментов

 

liCnOCOB ОЧИСТКИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ путем биоспецифической сорбции ферментсодержащих растворов при рН, большем или равном 1,8, на нерастворимом носителе, который предварительно вводят во взаимодействие с раствором к нденсируюсцего агента и лигандом, с последующей десорбцией сорбированных ферментов солевыми буферами или солевыми растворами органических растворителей, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности процесса за счет увеличения выхода ферментов высокой степени чистоты и активности, а также удешевления и упрощения процесса, в качестве носителя используют аминопроизводное кремнеземсодержащего материала, а процесс ведут при рН 1,8-9,5 в зависимости от рН-оптимума фермента, 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве носителя используют аминосилохром. 3.Способ по п. 1, отлича ющ и и с я тем, что в качестве кон{денсирующего агента используют (зохинон, или карбодиимид, или гексаметилендиизоцианат . 4.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве лиганда используют п-(со-аминометил) производное фенилборной кислоты или антибиоэик-полйпептид. 5.Способ по п. 4, отличающийся тем, что, в качестве антибиотика используют бацитрацин, или бациллихин, или грамицидин С. 6.Способ по пп. 1-5, отличающийся тем, что при очистке карбоксильных протеиназ в качестS ве лиганда используют антибиотик Л полипептид, а процесс ведут при рН 1,8-5,0. 7.Способ по пп. 1-5, отличающийся тем, что при очистке сериновых протеиназ в качестве лиганда используют антибиотик - поли| пептид, а процесс ведут при рН 6,0|8 ,5. 8.Способ по пп. 1-4, о т л ичающийс я тем, что при очистке сериновых протеиназ в качестве лиганда используют п- (со-аминометил) фенилборную кислоту, а процесс ведут при рН 6,0-9,5. 9.Способ по п. 8, отличающийся тем, что процесс осуществляют при рН 7-8. 10.Способ по пп. 1-4 и 7-9, отличающийся тем, что сорбцию сериновых протеиназ ведут в присутствии глицерина, а десорбцию - в присутствии растворов многоатомных спиртов, например пентаэритрита .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И) 1(5)) С 12 N 9/50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ .Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ L

1 () ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2649412/23-04 (22) 25.07.78 (46) 07.01.84. Бюл. Р 1 (72) В.М. Степанов, Г.Н. Руденская, В.Х. Акпаров и A.Â. Гайда (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов и Московский ордена Ленина, ордена

Трудового Красного Знамени и ордена

Октябрьской Революции государственный университет им. М.В. Ломоносова (53) 577 . 15 .04 . 66 ° 07 (088 .8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР го заявке )) 2370306/04, кл. С 07 G 7/02, 1976, непубликуемое . (прототип). (54) (57) 1,СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ путем биоспецифической сорбции ферментсодержащих растворов при рН, большем или равном

1,8, на нерастворимом носителе, который предварительно вводят во взаимодействие с раствором конденсирующе"

ro агента и лигандом, с последующей десорбцией сорбированных ферментов солевыми буферами или солевыми растворами органических растворителей, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности процесса эа счет увеличения выхода ферментов высокой степени чистоты и активности, а также удешевления и упрощения процесса, в качестве носителя используют аминопроизводное кремнеземсодержащего материала, а процесс ведут при рН 1,8-9,5 в зависимости от рН-оптимума фермента, 2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве носителя используют аминосилохром.

3. Способ поп. 1, о тл ич аюшийся тем, что в качестве кон;денсирующего агента используют п=бен(зохинон, или карбодиимид, или гексаметилендиизоцианат.

4. Способ по г.. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве лиганда используют п-((.)-аминометил) производное фенилборной кислоты или антибиоэик-полипептид.

5 ° Способ по и. 4, о т л и ч а юшийся тем, что, в качестве антибиотика используют бацитрацин, или бациллихин, или грамицидин С.

6. Способ по пп. 1-5, о т л ич а ю шийся тем, что при очистке карбоксильных протеиназ в качест- Q ве лиганда используют антибиотикполипептид, а процесс ведут при рН 1,8-5,0.

7. Способ по пп. 1-5, о т л ич а ю шийся тем, что при очистке сериновых протеиназ в качестве лиганда используют антибиотик — поли пептид, а процесс ведут при рН 6,018i5.

8. Способ по пп. 1-4, о т л ич а ю шийся тем, что при,очистке сериновых протеинаэ в качестве лиганда используют п-((,)-аминометил) фенилборную кислоту, а процесс ведут при рН 6,0-9,5.

9. Способ по п. 8, о т л и ч а юшийся тем, что процесс осуществляют при рН 7-8.

10. Способ по пп ° 1-4 и 7-9, отличающийся тем, что сорбцию сериновых протеиназ ведут в присутствии глицерина, а десорбцию — в присутствии растворов многоатомных спиртов, например пентаэритрита.

942427 йа основе сефарозы, содержат от 0,8 до 8 мкмоль лиганда на 1 мл влажного сорбента. Такая концентрация лиганда не позволяет добиться максимальной сорбции фермента на единицу объема колонки. Для обеспечения более эффективного процесса очистки в ряде случаев полезно увеличить концентрацию лиганда, что позволяет увеличить выход ферментов по активности и чистоте.

Целью изобретения является повышение эффективности процесса за счет

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к области получения высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов, которые могут быть использованы в медицине, биохимии и пищевой промышленности, в производстве моющих средств, а также для исследовательских целей.

Наиболее перспективным для избирательной очистки ферментов является метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, что позволяет разделять ферменты на основе их биологической специфичности, а потому достигать более высокой степени очистки по сравнению с другими видами хроматографической техники.

Наиболее широко выделение Ферментов биоспецифической хроматографией ведут с помощью биоспецифических сорбентов, представляющих собой нерастворимые носители — производные агарозы, активированные бромцианом и ковалентно связанные с лигандами — веществами специфическими для данного класса Ферментов.

Известен способ очистки протеолитических ферментов путем биоспецифической сорбции ферментных растворов на нерастворимом носителе,, представляющем собой производное агарозы сефарозу 4В который ковалентно связан с лигандом посредством конденсирующего агента (бромциана) с последующей десорбцией сорбированных ферментов, причем в качестве лиганда используют антибиотик-полипептидбацитрацин, являющийся неконкурентным ингибитором ряда протеиназ.

Очистку проводят при рН 1,8-8,0.

Десорбцию осуществляют солевыми буферами или буферами с добавлением

I органических растворителей (1) .

Выход ферментов по активности достигает 86%, степень очистки 295 раз в зависимости от чистоты исходного препарата.

Данный способ обладает рядом ненестатков.

Применяемая сефароза 4В является

t импортным дорогостоящим продуктом.

Кроме того, недостаточная механическая прочность производных агарозы и способность их разрушаться под воздействием некоторых ферментов, сопут" ствующих очищаемым протеиназам, огра ничивает воэможности применения сефарозы. Недостатком данного способа является также применение высокотоксичного бромциана. увеличения выхода ферментов высокой степени чистоты и активности, а также удешевление и упрощение процесса.

Указанная цель достигается предлагаемым способом очистки протеолитических ферментов путем сорбции ферментсодержащих растворов при рН, большем или равном 1,8, на нераство-. римом носителе, который предваритель20 но вводят во взаимодействие с раствором конденсирующего агента и лигандом, и десорбции, сорбированных ферментов солевыми буферами или солевыми растворами органических растворителей, причем в качестве носителя используют аминопроизводное кремнеэемсодеряащего материала, а процесс ведут при рН 1,8-9,5 в зависимости от рН-оптимума фермента.

Кроме того, в качестве носителя используют аминопроиэводный кремнеэемсодержащий материал. Процесс ведут при рН 1,8-9,5. В качестве носителя предпочтительно используют аминопроизводные макропористого микросферического кремнезема типа Поросил или Силохром (обычно. — аминосилохром), Силохромы выпускаются в больших количествах отечественной промышленностью и являются значительно более дешевым продуктом чем сефароэа.

Используемый в способе аминосило хром характеризуется высоким. содержанием реакционноспособных аминогрупп, что дает возможность повысить содержание лигандов от б до 100 мк60.моль на 1 мл влажного сорбента, а также обладает лучшими по сравнению с сефарозой гидродинамическими свойствами, что позволяет увеличить скорость и производительность процесса

Указанный способ не обеспечивает достаточной эффективности процесса очистки, так как сорбенты,, полученны очистки, имеющие внутри зерен крупные поры

40 более или менее однородного размера.

Они отличаются высокой механической и термической стабильностью. Кроме того, важным преимуществом макропористых кремнеземов по сравнению с

45 другими материалами того же назначения, например сефарозой, является высокая химическая чистота, строго контролируемый размер пор, возможность достижения больших скоростей

50 фильтрации и легкость стерилизации.

942427

Обгнб

О билохрпи

I I

О-Й-(."Н,-CH (."Н,-ЖНр+ I 1+ОН,-(dN-ОО _#_H) 0

Обгн5

Х НАО-h< -Об Я

А нтиоиоп икН С-б=О пол ипепжио (g)> (бн )

2 ,о

NH н, - =о но- )- он

+ КН

NH2 OH Б(ОН)2 г

R-áí

+ +г I

К=1=я-сН -сН -СН -ж О г

d=G

ОН б,н, NH

l

0-$i — OH — 4Hs-1Н, -3Н d — 1H,- ОН,-" -_#_H -gH 3 «3(QHj

)) tl

0Н О О

В качестве конденсирующих агентов для связи носителя с лигандом обычно используют п-бензохинон, или карбодиимид, или гексаметилендиизоцианат.

В качестве лиганда используют обычно п-(4)-аминометил)-фенилборную

Антибиотики-полипептиды, используемые в качестве лигандов, являются ингибиторами карбоксильных протеиназ. Этим обусловлено специфическое взаимодействие сорбента с протеолитическими ферментами различных классов. Присутствие в молекулах антибиотиков D-аминокислот и характерные для циклопептидов особенности пространственной структуры препятствуют их расщеплению ферментами.

Бацитрацин представляет собой природный циклододекапептид, содержащий три D-аминокислоты. Бациллихин - отечественный препарат, аналогичный бацитрацину, выпускается в больших количествах промышленностью для использования в животноводстве.

В молекуле другого природного циклододекапептида, грамицидина С, преобладают гидрофобные аминокислоты. В отличие от бацитрацина, в составе которого имеются дикарбоновые аминокислоты, а грамицидине С содержится больше нейтральных аминокислот, а также диаминокислота — орнитин. Тонкие различия в строении молекул лигандов усиливают специфичность сорбентон к различным протеиназам. В ряде случаев грамицидин-С-силохром и бацитрацин-силохром являются взаимодополняющими сорбентами: фермент, который не сорбируется на одном иэ них, можно успешно хроматографировать на другом. Эти свойства можно кислоту или антибиотик-полипептид: бацитрацин, бациллихин, грамицидин С.

Конденсация носителя с лигандом с помощью конденсирующего агента иллюстрируется следующей схемой

1 использовать для разделения смеси, содержащей два протеолитических фермента.

Используемая в качестве лиганда и-(CJ-аминометил) фенилборная кислота обладает групповой специфичностью по отношению к классу сериновых про теиназ, образуя лабильные комплексы

40 с функциональными группами активного центра фермента.

При очистке карбоксильных протеийаз обычно .используют носители, содержащие в качестве лиганда антибиотик-полипептид, а процесс ведут при.

- pH 1с8-5,0.

При очистке сериновых протеинаэ обычно в одном случае используют носители, содержащие в качестве лиганда антибиотик-полипептид, и процесс ведут при рИ 6,0-8,5, в другом случае используют носители, содержащие в качестве лиганда п-(63-аминометил) фенилборную кислоту, и процесс ведут при рН 6-9,5, предпочтительно 7-8.

Сорбцию сериновых протеиназ предпочтительно ведут при дополнительном присутствии глицерина, а десорбцию— в присутствии раствора многоатомных

60 спиртов, например пентаэритрита.

Важным преимуществом описываемого способа является возможность его применения для очистки препаратов ферментов, содержащих в качестве при 5 месей большое количество целлюлаэ, 942427

Для десорбция используют растворы солей различной концентрации. B 60 тех случаях, когда фермент связывается с сорбентом настолько прочно, что его не удается элюировать, применяют растворы солей, к последним добавляют органи еские растворителя, декстраназ и Ферментов, способных гидролизовать агарозу. Неорганические носители на основе макропористого кремнезема устойчивы к действию

Ферментов и бактерий. Описываемый способ позволяет исключить применение высокотоксичного бромциана, заменить дорогостоящий импортный продукт сефарозу отечественными но< ителями, повысить эффективность процесса очистки.

Описываемый способ позволяет очи.— щать с выходом 75-100-. различные протеолитические ферменты с увеличением активности в 1,5-100 раз в зависимости от чистоты исходного препарата.

Способ особенно эффективен при извлечении ферментов непосредственно из культуральной жидкости, содержащей окрашенные примеси. В таких случаях выделяются практически чистые ферменты, причем вследcòâèå высокой избирательности сорбентов значительный эффект достигается в одностадийном процессе очистки. г5

Кроме того, описываемые биоспецифические сорбенты могут быть применены для работы с растворами в широком диапазоне рН (1,8-9,5) . Это дает возможность использовать их для выделения протеолятических ферментов различных классоь, включая карбоксильные, сериновые, тиоловые, металлопротеяназы и экзопептидазы.

Способ осуществляют следующим образом. 35

Для синтеза носителей, необходимых для очистки требуемого фермента, используют производные макропористых кремнеземов например аминосилохром который обрабатывают смесью конденсирующях агентов и лягандов в сооТaezczsymziax буферных системах. Например, для очистки карбоксильных протеиназ — смесью, содержащей бензохянон и антибиотики-полипептиды, для сериновых протеиназ — смесью, содержащей янтарный ангидрид, и-(й—

-аминометил)фенялборную кислоту и водорастворимый карбодяямид.

Сорбцию ферментов проводят в динамическом или статическом режиме. При этом происходит избирательное связывание протеиназ с нерастворимым носителем. Затем носитель со связанным белком промывают соответствующим буферным рас". âîðîì. .При этбм происходит отделение примесей, в том числе и окрашенных. способствующие более эффективной десорбции.

Очищенный фермент используют в виде раствора или высушивают лиофяльно после обессоливания гельфильтрацией или диализа.

В приведенных примерах по очистке ряда протеиназ на колонке с биоспецифическими сорбентами количество нанесенного и элюированного белка измерено в мг, а также в условных оптических единицах, т.е. в единицах оптической плотности при 280 нм.

Активность ферментов измерена по скорости гидролиза гемоглобина (пример 1, 2); по,скорости створаживания молока (примеры 3 — 6), по скорости расщепления синтетических субстраToB: g -карбоксипропионилфенилаланина (пример 7) и п-нитроанилида карбобензокси-L-аланил-L-аланял-;лейцина (пример 8).

Пример 1. Очистка промышленного препарата пепсина свиньи на бацитрацин-силохроме.

Для синтеза бацитрацин-силохрома используют 1 г аминосилохрома (340 мкмоль аминогрупп на 1 r) в

О,, М NaiiCO, рН 10,0, 34 мг п-бензохинона в 2 мл абсолютного диметилформамида и 220 мг бацитрацина.

Смесь осторожно перемешивают 4 ч и оставляют на ночь при 5 C. Затем сорбент тщательно промывают 0,1 М

YaliCO- с рН 10, водой, спиртом, а

> перед опытом всеми элюирующими растворами. Полученный темноокрашенный сорбент по данным аминокислотного анализа содержит 46 мкмоль бацитрацина на 1 r сухого сорбента. Для очистки пенсина 0,1 N ацетатный буферный раствор с рН 5,0, содержащий неочищенную протеиназу с удельной активностью 23 е,а./о.е., пропускают через хроматографическую колонку

,5x0,5 см), заполненную бацитрацинсялохромом. Затем сорбент промывают исходным буфером. Активный фермент элюируют 25Ъ-ным изопропиловым спиртом в 1 М NaCp с рН 5,0. Удельная активность пепсина свиньи в элюате

34 е.а./мг. Выход по активности 100%, очистка в 1,5 раза.

Пример 2. Очистка промышленного препарата пепсина свиньи на бациллихин- силохроме.

Промышленный препарат бациллихина содержит нерастворимый наполнитель. Для извлечения бациллихина препарат трижды экстрагируют кипящим метанолом иля этанолом. Экстракты упаривают в вакууме до небольшого объема. Осадок бациллихина, выпавший при охлаждении, отфильтровывают и высушивают.

Для синтеза бацяллихин-силохрома используют 100 г аминосилохрома

942427 (120 мкмоль аминогрупп на 1 г) в

0,1М ИаНС03, рН 10, 864 мг и"бензохинона в 50 мл абсолютного диметил.формамида и 12,8 г бациллихина.

Смесь осторожно перемешивают 4 ч и оставляют на ночь при 5 С. Затем сорбент тщательно промывают 0,1М

NaHCO рН 10, водой, спиртом, а перед опытом всеми элюирующими растворами. Полученный темноокрашенный сербент по данным аминокислотного анализа содержит 1b мкмоль бациллихина на 1 г сухого сорбента. 1(ля очистки пепсина 0,1М ацетатный буферной раствор м рН 5,0, содержащий неочищенную протеиназу с удельной активностью 22 е.а./о.е., пропускают через хроматографическую колонку (5x0,5 см), заполненную бациллихинсилохромом. Затем сорбент промывают исходным буфером. Активный фермент элюируют 2ЬЪ-ным изопропиловым спиртом в 1М NaCg pH 5,0. Удельная активность пепсина свиньи в элюате

34 е.а./мг. Выход по активности составляет 100Ъ, очистка в 1,5 раза.

Пример 3. Очистка протеиназы из Trichoderma I!ignorum на бацитрацин-силохроме.

Синтез бацитрацин-силохрома осуществляют по примеру 1. 0,1М ацетатный буферный раствор с рН 5,0, содержащий 4 г. белка (неочищенную смесь протеиназ и целлюлаз) с удельной активностью 13,0 е.а./o.е,, пропускают через хроматаграфическую колонку (бх1,5 см), заполненную бацитрацин-силохромом. Затем сорбент промывают исходным буфером и элюируют послЕдовательно 1М NaCE в том же буфере и 25Ъ-ным изопропанолом в 1M NaC(I, рН 5,0. Собирают солевую (1) и изопропанольную (11) фракции элюата, содержащие активный белок.

Удельная активность фракции 1

216 е.а./о.е. Очистка в 16,6 раза.

Удельная активность фракции 11

58,6 е.а./о.е. Очистка в 4,4 раза.

Выход активного белка 97Ъ.

Пример 4. Очистка ультрафильтрата культуральнай жидкости базидального гриба RussuIa decdorans

Fr †04 на бацитрацин-силахроме.

Синтез бацитрацин-силохрома осуществляют по примеру 1. Ультрафильтрат культуральной жидкости с удельной активностью 13 е.а./о,е. по створаживанию молока пропускают через хроматаграфическую колонку (6x1,5 см), заполненную бацитрацинсилохромом и уравновешенную 0,1М ацетатным буфером, рН 4,5. Затем сорбент промывают исходным буфером и последовательно элюируют 1M NaCI, рН 4,5 в том же буфере (фракция 1) и 25Ъ-ным изопропанолом в 1M NaCI рН 5,0 (фракция 11) . Удельная активность фракции 1 - 664 е.а./о.e., очистка в 51 раз, Фракции 11

260 е.а./о.е., очистка в 20 раз.

Выход. активного белка 100Ъ.

Пример 5. Очистка ультрафильтрата культуральной жидкости базидального гриба Вцззп?а бесйогапз

Fr-0456 на бациллихин-силахроме.

Синтез бациллихин-силохроме. осуществляют по примеру 2. Ультрафильтрат культуральной жидкости, с удельной активностью 3,3 е,а./о.е. пропускают через хроматографическую колонку (5x0,5 см), заполненную бациллихин-силохромом, уравновешенную

0,1М ацетатным буфером, рН 4,5. За15 тем промывают сорбент тем же буфером. Активный фермент элюируют 20Ъ изапропанолом в 1М NaCI рН 4 5.

Удельная активность фермента B элюате 120 е.а./о.е., очистка в 36 раз.

20 ВыхОд ПО активности 90ъ.

Пример б. Выделение двух протеиназ из высушенного экстракта культуральной жидкости базидальнаго гриба RussuIa decdorans Fr-0456 с помощью бациллихин-силохрома и грамицидин-С-силохрома.

Экстракт, содержащий фсрмент с удельной активностью 180 е.а./о.е., пропускают через хроматографическую колонку (25х1,5 см) с бациллихинсилохромом, уравновешенную 0,1М ацетатным буфером, рН 4,5, Собирают прошедший через сорбент раствор,который содержит протеиназу 1. Удельная активность раствора 2,6 е.а./о.е.

Колонку промывают исходным буфером.

Протеиназу 11, сорбированную на колонкер элюируют 20 - -ным изопропанолом в 1M NaCI, рН 4,5. Удельная активность фермента " элюате 380 е.а./о.е.

40 Выход по активноеTH 88Ъ, Очистка в

2, 4 раза.

Раствор, содержащий протеиназу 1, Не сорбировавшуюся на бациллихинсилохроме, пропускают через хроматографическую колонку (18=1 см} с грамицидин-С-силохромом.

Для получения сорбента используют

50 г аминосилохрома (50 мкмоль аминогрупп на 1 г} в 0,1M NaHCOg, рН 10, 162 мг и-бензохинона в 30 мл абсолютнага диметилформамида и 2,.1 r грамицидина С,,условия синтеза те же, что в примерах 1,2.

Колонку с сарбираванной протеиназой 1 промывают 0,1М ацетатным бу фером, рН 4,5, активный фермент элюируют 20Ъ-ным изопропанолам в

1 М NàC(!, рН 4,5. Удельная активность фермента в злюате 370 e,a./o.e., --очистка в 3,7 раза, выход )Io активности 60Ъ.

П р и м e p 7. Очистками -химатрипсина на фенилборонат-силохроме.

Для синтеза сорбента испольэовали аминосилохром (415 мкмоль амино942427

10 групп на 1 г), янтарный ангидрид и хлоргидрат п-(Q-аминометил)фенилборной кислоты.

3 r аминосилохрома обрабатывают в течение 20 мин при 20 С раство0 ром 1 r янтарного ангидрида в 9 мл диметилформамида. Избыток ангидрида удаляют промывкой 50 мл диметилформамида и водой. К 3 r полученного сукцинилсилохрома прибавляют 333 мг хлоргидрата п-(Ы-аминометил)фенил- 10 борной кислоты в 15 мл воды. Затем . при рН 5 добавляют 3 г водорастворимого карбодиимида. Смесь выдерживают 1 ч при 20 С при осторожном периодическом перемешивании. Сорбент отфильтровывают и промывают большим количеством воды, а перед опытом всеми элюирующими растворами. Полученный фенилборонат-.силохром содержит 215 мкмолей лиганда на 1 г сухого сорбента (или 100 мкмолей на

1 мл влажного сорбента} . На колонку с 2 мл фенилборонат-силохрома наносят раствор 10 мг (6 -химотрипсина в 10 мл 0,05 M фосфатного буфера, рН 7,5. Удельная активность раствора

0,025 е.а,/мг. Затем сорбент промывают 50 мл исходного буфера, 1М NaCI в том же буфере, 0,5 М глицерином в том же буфере, Фосфатным буфером, рН 9, и элюируют белок 0,5 М пентаэритритом в 0,05 М фосфатном буфере, рН 9. Получают 5,9 мг белка с удельной активностью 0,053 е.а./мг. Выход по активности 100Ъ, очистка в

1,7 раза. 35

П. р и м е р 8. Очистка субтилизина А-50 на фенилборонат-силохроме.

На колонку с 4 мл фенилборонатсилохрома, полученного по методу, 4() приведенному в примере 7, и уравновешенного 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5, наносят 40 мл культуральной жидкости Bac SubtiIis А-50 с рН 7,5, с удельной активностью 0,08 е,а./мг по гидролизу Š— AIa-AIa-Leu — рКА. Колонку последовательно промывают

0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5, 1N NaCI в том же буфере, 0,5М глицерином в том же буфере, 0,05М фосФатиым буфером, рН 9. Активный белок элюируют 0,5М пентаэритритом в

0,05М Фосфатном буфере, рН 9. После обессоливания и лиофилизации получают 2,26 мг белка с удельной активностью 1,08 е.а./мг, выход 80%, 55 очистка в 13,7 раз.

Пример 9. Синтез Фенилборо- . нат-силохрома с применением в качестве конденсирующего агента гекса)метилендиизоцианата, 60

К 1 г аминосилохрома (340 мкмоль

NHg-групп) приливают избыток гексаметилендиизоцианата и оставляют при комнатной температуре на 15 мин, затем промывают аминосилохромдиметилФормамидом и водой. Получают сорбент, содержащий 300 мкмоль изоцианатных групп на 1 г носителя. К 1 r такого сорбента приливают раствор 200 мг и-(GJ аминометил)фенилборной кислоты н 5 мл диметилформамида, оставляют на 20 мин при комнатной температуре, затем избыток реактивов отмывают диметилфррмамидом и водой. Получают

Фенилборонат-силохром с содержанием лиганда 150 мкмоль/г.

Пример. 10. Очистка пепсина на грамицидин-С-силохроме.

К раствору 25 мг препарата свиного пепсина (производства Московского мясокомбината) в 10 мл 0,05М универсального буфера, рН 1,8, добавляют

200 мг грамицидин-С-силохрома, перемешивают 20 мин, раствор декантируют, промывают сорбент пять раз по 5 мл универсального буфера, рН 1,8, и элюируют пепсин дважды по 5 мл 1М хлористого натрия в 0,05М универсальном буфере, рН 1,8, содержащем 25% изопропанола. Выход по активности ЗОВ, очистка в 10 раз.

Пример 11. Очистка-субтилиI зина ВРИ на бацитрацин-силохроме.

К раствору 25 мг субтилизина BPN (Серва ) в 10 мл универсального буфера, рН 6,0, прибавляют 200 мг бацитра 7ин-силохрома, перемешивают

20 мин, промывают сорбент пять раз по 5 мл 0,05М универсального буфера, рН 6,0, и элюируют субтилизин дважды по 5 мл 1N хлористого натрия в

0,05М универсальном буфере, рН 6,0, содержащем 25Ъ изопропанола. С выхо-! дом 45% получают субтилизин BPN, обладающий активностью по Е-AIa AIa-Leu — pNA, 1,5 е.а./мг, очистка в

1,5 раза.

Пример 12. Очистка субтилизина 72 на бацитрацин-силохроме.

На колонку с 10 мл бацитрацин-силохрома, уравновешенную 50 M трис-буфером, рН 8,5, наносят раствор 2 г промышленного препарата субтилизина

72 (Протосубтилин ГЗх) с удельной активностью 0,166 е.а./мг. Колонку промывают 50 мМ трис-буфером, рН 8,5, затем 1N хлористым натрием в том же буфере. Активный фермент элюируют

1N хлористым натрием в 50 мМ трисбуфере, рН 8,5, содержащем 20% изопропанола. В результате получают

56 мг препарата с удельной активностью 7,7 е.а./мг. Выход по активности 130%, очистка в 40 раз.

Пример 13. Очистка щелочной сериновой протеазы Вас. Licheniformis на фенилборонат-силохроме °

На колонку с 4 мл фенилборонатсилохрома (200 мкмоль лиганда на 1 г. сорбента), уравновешенную 0,5N глицерином в 0,05М фосфатном буфере, 942427

Составитель

Редактор О. Филиппова Техред А,вабинец КорректорА. Зимокосов

Эаказ 1009/1 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 рН 6,0, наносят раствор 10 мг промышленного препарата сериновой протеазы Вас. ?1cheniformis в 5 мл того же буфера. Колонку промывают тем же буфером, 1М хлористым натрием в

0,05М фосфатном буфере, рН 6,0, и

0,05М фосфатным буфером, рН 9,5.

Протеазу элюируют 0,5N пентаэритритом в 0,05М фосфатном буфере, рН 9.5.

Выход по активности 150%, очистка в 5,6 раз, полученный препарат имеет удельную активность. определяемую по

5 гидролизу Е-AIa-AIa-Üå÷-pNA, 18 е.а./мг.