@ -нитроанилиды пироглутамилсодержащих пептидов в качестве субстратов сериновых протеиназ

 

п-Нитроанилиды пироглутамилсодержащий пептидов формулы L--pQla-A-A-B-iiH- NOt ;где А - остаток глицина или L-сшани на; В - остаток Ь-лейцина или L-фенилаланина , в качестве субстратов сериновых протеиназ .

09) П1) СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

4ч .) ДМ4

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (2i) 3222293/23-04 (22) 24 ° 12.80 (46) 23.02.84. Бюл.9 7 (72) В.М.Степанов, Хайду Иштван (ВНР), Г.Н.Баландина и Л.А.Люблинская (71) МГУ Им. М.В.Ломоносова и Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (53) 547.964.4(088.8) (56) 1. Розsgay N., Gaspar 8., Е1оИ P. Investigations on nev tri,peptidyl p-nitro-anilide substrates

for subtilisins.-РЕВЯ Lett., 1977р ч.744р 9 1, р.67-70.

2. Люблинская Л.A. Якушева Л.Д., Степанов В.М. (1977), Виоорган.химия, 3, В 2, 273-279. "Синтез пептидных, субстратов субтилизина и их аналогов".

ЗЮ1) С 07 С 103/52, С 12 Н 9/50;

С 12 1/00 (54 ) n-НИТРОАНИЛИДЫ ПИРОГЛУТАМИЛСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ В КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТ0В СЕРИНОВЬМ ПРОТЕИНАЗ . (57) п-Нитроанилиды пироглутамилсодер кащий пептидов формулы

Ь-pC tu-А-А- — ЮН ЮО где А - остаток глицина или L-аланина,"

В - остаток Ь-лейцина или L-фенилаланина, в качестве субстратов сериновых протеиназ. р:р

102509ф

65

Предлагаются новые хромогенные производные пептидов, которые могут использоваться в качестве субстра,тов при определении активности протеолитических ферментов, относящихся к сериновым протеиназам. Они могут 5 найти применение в медицине, пищевой промышленности, микробиологии.

Для определения активности ферментов удобно использовать производные пептидов, содержащие хромофорную 10 группу, что позволяет следить за ходом расщепления субстрата.по изменению окраски раствора спектрофотометрически. В качестве таких хромофорных субстратов описано использование и-нитроанилидов Г 1 )

Z-Gly Pro, Z-А1а-Pro-Leu, Z-AlaLeu, Z-Gly-Pro-Leu, Z-Азр-Pro-Leu, Z-Ala-Ual-Arg, Z-Lys-Leu-Arg.

Известно использование в качестве субстратов для субтилиэина ВРИ-произ-20 водных пептидов общей формулы где Z — бензилоксикарбонильная группа;

A и В- остатки глицина или L-аланина;

С вЂ” остатки. L-лейцина или

L-фенилаланина. 30

Разница в положении максимума поглощения этих производных (315 нм) и максимума поглощения п-нитроаналина, отщепляющегося в процессе ферментативного гидролиза (375 нм), по- З5 зволяет следить за ходом гидролиза спектрофотометрически (2j.

Однако наличие гидрофобных групп приводит к плохой растворимости этих соединений в воде..Поэтому их приме- 40

I нение возможно только в водно-oprанических растворах,а присутствие органического растворителя (в данном случае диметилформамида) неблагоприятно влияет на каталити- 45 ческую активность ферментов, оказывая ингибирующее действие. Таким образом, область применения описанных субстратов достаточно ограничена, и их использование не дает истинных значений удельной активности ферментов.

Целью изобретения является повышение эффективности субстратов, расширение области их применения.

Поставленная цель достигается описываемыми и-нитроанилидами пироглутамилсодержащих пептидов общей формулы

1;рб1и-А — А — 3 — NH g / >08 60 где A -- остаток глицина или (,-ала- нина;

В « остаток L -лейцина или L-фенилаланина, которые обладают более высокой растворимостью в воде по сравнению с известными соединениями. Это позволяет снизить концентрацию диметилформамида при проведении ферментативной реакции с этими производными от 20% (в случае бензилоксикарбонильных производных) до 4% (для глицинсОдержащих пироглутамилпроизводных) и до 0,2% (в случае аланинсодержащих пироглутамилпроизводных). Такое содержание органического растворителя не оказывает заметного ингибирующего действия на протеолитические ферменты. и-Нитроанилиды пироглутамилпептндов укаэанной:общей формулы получают конденсацией в присутствии дициклогексилкарбодиимида пироглутамилпептида pGlu-А-А и и-нитроанилида L-лейцина или и-нитроаналида L-фенилаланина. Если А — остаток L-аланина, в реакционную смесь добавляют

Б-оксисукцинимид.

Пример ° и-Нитроанилия l -пиРоглУтамил-Ь-аланил-L-àëàíèë-L-лейцина. ю г (0,74 ммоль) L р мил-L=BJiaHH -L-аланина и 0,018 г (О 74 ммоль) и нитроанилида L лей цина растворяют в 10 мл абсолютного диметилформамида. К раствору при

0 С и при перемешивании добавляют

0,08 r (0,74 ммоль) N-оксисукцинимида и раствор 0,2 г (0,9 ммоль)Н,N(дициклогексакарбодимида в 5 мп абсолютного диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают 3 ч при о

0 С, затем 20 ч при комнатной температуре. Отделяют осадок фильтрованием, фильтрат упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют при слабом нагревании в 5 мл и --бутилового спирта, затем прибавляют 10 мл этил-. ацетата и смесь оставляют на холоду на 24 ч. Отфильтровывают N,N-дициклогексиломочевину, объем раствора доводят до 20 мл, добавляя 5 мл пбутилового спирта, и раствор промывают 1%-ным раствором бикарбоната натрия (2 5 мл) и водой (2 ° 5 мл).

Высушивают раствор над N S04 и упарйвают в вакууме досуха. Остаток кристаллизуют под эфиром и пере= кристаллизовывают из спирта, выход

0,22 r (60%), т.пл.261-264ОС

tcQ -16 (с 0,5, диметилформамид).

Найдено,% : С 54,18; 54,22, Н 6,25;:

6,.45; И 16,23 . 16,30.

С2 Н 2_#_ 0

Вычислено. %: С 54, 75; Н 6, 39;

N 16,16.

Аналогично получают и-нитроанилид

L-пироглутамил-L-аланил-L-фенилаланина, выход 503, т.пл.213-217 С, (о(2о -16о(c 0,5, диметилформамид) 1025091

Таблица 1

Удельная активность субтилизина ВРИ по пептидным микромоль мии.опт.ед.фермента

Лиметил4оюмамид.Ъ

20 10 4 1

Субстрат

Z-L-Qta-L 0ta-Ь-Leu-МН / БОе . 1,3 х)

l

Ь-p6tu — а — Qta-L- 0ta-L — L eu-ИН / МО 0,38

6-РИи-Ь-01а-L-Ota-L-РПЕ-ЗН 3 МОе 0,03 !

)+)

2-Sty-Þtó-L-РЬе-NH/ NOg

L -рЫи-В1у-В(у-Ь-Рйе-РН N0g

1 4

3,0

0,26

0,09

0,06

0,01 - 0 03 0,05

Таблица 2

Удельная активность е(-химотрипсина по пептидньэь субстратам, микромоль

MHH.îïò.åä..фермента диметилформамид, В

Субстрат

» » »» °

10 4 1

»»»»»» »»

20 х)

Z-L-0ta-6-Ota-L-Leu-УИ ЖОе 0,008

Li-pGtu-L Ota-L-Gta-L-Ьеи-У МОе 0,03

0,34

0,20

Найдено,%: С 58,20; 58,12; Н 5,65;:

5,65 N 15,12, 15,07, ЪьНяо" ь О1

Вычислено, Ъ: С 59,97; Н 5,62, 15,61.

Также получают п-нитроанилид ь-пи- 5 роглутамилглицилглицил-L-фенилаланина, выход 59%, т.пл.165-170 С, faL3g+16 (c 0,5 диметилформамид) .

Найдено,%: С 56,61; 56,70; Н 5,21;

5,23;N 16,08. 10

Ъ+" ь" à ot

Вычислено.е: С 56,45; Н 5,15;.

N 16,46.

Синтезированные и-нитроанилиды пироглутамилпептидов испольэовали в ка- )5 честве субстратов при определении протеолитической активности субтилизииа ВРИ,о -химотрипсина,эластазы,про= теиназы из Termoactinomyces Vulgaris.

Значения удельной активности этих. ферментов, определенной по полученным2О субстратам и по субстратам, описан ным ранее, приведены в табл.1, 2, 3 и 4.

Иэ таблиц видно, что изменение концентрации органического растворителя существенно влияет на скорость ферментативного гидролиэа. Так,для субтилизина BPN при уменьшении концентрации диметилформамида в 20 раз удельная активность фермента,.определяемая по синтезированным субстратам, возрастает в 8 раз, удельная активность зластаэы при снижении кон" центрации диметилфорамида от 20 до

1% возрастает в 9 раз.

Хорошая растворимость синтезированных и-нитроанилидов пироглутамилпептидов в воде открывает широкие воэможности использования их в знзимологии в качестве реагентов, а также в промышленности и медицине при îïðåделении содержания ферментов.

1025091

Продолжение табл. 2

Диметилформамид, Ъ

10 4

Субстрат

20 l 1!

Ь-рЫи-L-аИ-L- Qta-L-РЬв-ЮН МО Z- Qty-et g-L — Рве- НН МО

: L-pGtu Юу-Oty-а-Им-ЯН HOg

3,3

3,6

1,5

0,01

0,06 0;08

0,008

Т а б л и ц а 3

Удельная активность эластазы, микромоль мин.опт.ед.фермента

Диметилформамид,%

Субстрат х)

Z-,— 0ta -L- 0(о-L-L eu — _#_K МОе

0,04

h-Ржи — а — Ota-L-Ota-а — аец-ЯН N0g 0,04

0,12

0,36

Т а б л и ц а 4

Удельная активность сериновой протеиназы из

Termoactinomyces Vu1gari>s, мик омоль мин.опт.ед.фермента

Диметилформамид,%

Субстрат

-Т- I М Z-L-Qta-L -Rta-L-Lea-ИН NOg

Г

Ь-рОЕц-L-Qta-1.— Qta — 6.— Lеи — ИН . H0g 3,9

/.-рИи -L-Qta-L — Qta-1 Phe-ФН МО 6,0

3,0

23,6

108,7

76,7

29,7

ВНИИПИ Заказ 1141/5 Тираж 410 Подписное вмюю юмам Ю Ю ЮВ Ю юаВ е юмюююаэевавЮЮ ае Юю филиал ШШ "Патент, г. ужгород, ул. Провткиая,4

М

Субстраты с бензилоксикарбонильной защитной группсй, описанные ранее (2 .