Конвекционный днк термоциклер

Конвекционный ДНК термоциклер относится к физико-химической биологии, биотехнологии и медицине и связан с анализом молекул нуклеиновых кислот путем амплификации их специфичных фрагментов. Термоциклер может быть использован при проведении ДНК-диагностики, в том числе в полевых условиях, медицине, ветеринарии, санитарно-эпидемиологических исследованиях для обнаружения возбудителей опасных инфекций, включая возможные биотеррористические атаки, в криминалистике для идентификации преступников, в пищевой промышленности при выявлении продуктов питания из генетически модифицированных организмов, определении качества сырья и т.д.

Сущность полезной модели конвекционного ДНК термоциклера с наклонным градиентом температур заключается в том, что быстрая амплификация целевых продуктов ПЦР ведется в приборе специальной конструкции, оснащенном блоком электронного управления и особым реакционным термоблоком, обеспечивающем в реакционных сосудах, которыми служат стандартные пробирки, наклонный градиент температуры, ориентированный под углом к направлению действия силы тяжести.

Полезная модель относится к физико-химической биологии, биотехнологии и медицине и связана с анализом молекул нуклеиновых кислот путем амплификации их специфичных фрагментов. Она может быть использована при проведении ДНК-диагностики, в том числе в полевых условиях, медицине, ветеринарии, санитарно-эпидемиологических исследованиях для обнаружения возбудителей опасных инфекций, включая возможные биотеррористические атаки, в криминалистике для идентификации преступников, в пищевой промышленности при выявлении продуктов питания из генетически модифицированных организмов, определении качества сырья и т.д.

Современная ДНК-диагностика основана преимущественно на амплификации специфичных фрагментов ДНК или РНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ее модификаций. При этом ПЦР требует циклического изменения температур, поскольку для того, чтобы начался новый цикл, должна произойти денатурация ДНК (обычно при температуре около 95°С) после чего следует отжиг праймеров (чаще всего при температурах от 50 до 60°С) и их удлинение (наиболее часто используются

температуры 72-75°С). В настоящее время большинство ДНК термоциклеров имеют нагреваемый и охлаждаемый элементами Пельтье довольно массивный реакционный блок, изготовленный из металла, обладающего хорошей теплопроводностью. Скорость смены температур в таких приборах, как правило, варьирует в диапазоне от 2 до 6°С в секунду. Менее распространены устройства, в которых вместо реакционного блока имеется полая воздушная камера с расположенными в ней реакционными сосудами, нагрев и охлаждение воздушного пространства которой осуществляется соответственно инфракрасной лампой и вентилятором или попеременной подачей под давлением горячего и холодного газов и в этих случаях смена температур в реакционной смеси происходит со скоростью до 12-17°С/сек. Средняя продолжительность реакции в разных приборах этих типов составляет от 2 часов до 15 минут. При этом более удобные по ряду параметров приборы, основанные на элементах Пельтье, заметно уступают по скорости амплификации, являющейся одним из важных показателей. В то же время у приборов с полой воздушной камерой имеются свои недостатки. Так, ПЦР в них, как правило, ведется в специальных капиллярах, а не в стандартных полипропиленовых пробирках, которые заметно дешевле и удобнее в работе, тем более, что стеклянные капилляры не требуются при проведении большинства диагностических экспериментов, где не предполагается дальнейший анализ продуктов ПЦР с помощью высокоточного плавления ДНК.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является конвекционный ДНК термоциклер (Hwang H.J., Kim J.H., Jeong K. Method and apparatus for amplification of nucleic acid sequences by using thermal convection // US Patent Application Publication No 2004/0152122 A1. Aug. 5, 2004), представляющий собой аппарат с реакционным термоблоком, изготовленным из двух разделенных термоизолятором основных половинок, для которых поддерживается разная температура - для верхней части - температура отжига и для нижней части - температура денатурации. Реакционными сосудами служат открытые с верхней стороны толстостенные стеклянные трубки. Их высота составляет 55-60 мм, внутренний диаметр - 2 мм, внешний диаметр - 8 мм, запаянный нижний конец имеет толщину стенок также 3 мм. Открытое состояние пробирок необходимо для обеспечения внутри них повышенного давления азота (1,2 атм) для предотвращения начала процесса кипения и не нарушения, таким образом, возникающей температурной конвекции жидкости, происходящей по типу ячеек Бенара-Рэлея. Открытое состояние пробирок потенциально чревато перекрестным загрязнением их содержимого, что может приводить к ложно-позитивным результатам, но повышенное по сравнению с атмосферным давление, может до некоторой степени воспрепятствовать

этому, однако его создание заметно усложняет всю конструкцию и делает ее менее безопасной. Недостатком данной модели является использование пробирок особого типа, не относящихся к стандартным и массово применяемым в большинстве ДНК термоциклеров. Другим недостатком этой модели конвекционнного ДНК амплификатора можно считать довольно продолжительное время реакции, поскольку требуется около полутора часов, чтобы благодаря термоконвекции жидкости произошло должное количество циклов денатурации/отжига/элонгации и целевой продукт ПЦР стал виден после его разделения гель-электрофорезом.

Сущность полезной модели конвекционного ДНК термоциклера с наклонным градиентом температур заключается в том, что быстрая амплификация целевых продуктов ПЦР ведется в приборе специальной конструкции, оснащенном особым реакционным термоблоком, обеспечивающем в реакционных сосудах, которыми служат стандартные пробирки, наклонный градиент температуры, ориентированный под углом к направлению действия силы тяжести. Так, температура денатурации создается в определенной части реакционной смеси около дна пробирки после подведения к внешней поверхности последней сбоку внизу соответствующей температуры с использованием в качестве проводника тепла металлической пластины, в свою очередь нагреваемой элементом Пельтье. Вторая температура (температура отжига) создается в верхней части реакционной смеси после подведения с противоположного (по отношению к месту подвода температуры денатурации) бока пробирки на уровне границы жидкости (ниже мениска) другой металлической пластины, термостатированной при требуемой температуре, которая при амплификации различных образцов зависит от конкретных нуклеотидных последовательностей праймеров, характеризующихся присущими им температурами отжига. После приложения заданных температур к реакционным пробиркам в указанных местах внутри них в реакционной смеси очень быстро создается наклонный градиент температур, запускающий механизм конвекции, основанный на силе плавучести. Причем, благодаря наклонному градиенту температур возникает направленное движение слоев жидкости по эллипсоподобному пути, в массе своей не разбивающееся на многочисленные ячейки Бенара-Рэлея как это обычно происходит в случае приложения вертикального или горизонтального градиентов температур. В результате такой термоконвекции жидкость (водный раствор), проходя зону с высокой температурой (зона денатурации), затем зону средней температуры (нерабочая зона), попадая в зону низкой температуры (зона отжига), вновь оказываясь в зоне средней температуры (зона элонгации) и затем возвращаясь в зону высокой температуры,

совершает таким образом один полный оборот, которые повторяются до тех пор пока к пробирке (к ее внешней стороне) приложены в определенных местах соответствующие температуры. Таким образом, один цикл в конвекционной ПЦР в данной полезной модели занимает около 2-3-х секунд и за 1-2 минуты таких циклов происходит от 20 до 60. Ввиду короткого времени протекания реакции не требуется предотвращения испарения жидкости ни с помощью горячей крышки, ни наслаиванием минерального масла. Поскольку жидкость в средней части пробирки описывает несколько меньший эллипс, то молекулы ДНК, находящиеся в этом месте реакционной смеси, не оказываются в зоне высокой температуры, где могла бы произойти денатурация ампликонов и соответственно затем отжиг праймеров, сопровождающийся их удлинением. Однако, благодаря имеющей место диффузии и возникающим флуктуациям потоков, слои жидкости из центральной части смещаются в стороны и оказываются также вовлеченными в данный температурный круговорот. Аналогичные процессы происходят со слоями жидкости, прилегающими к стенкам пробирок и из-за трения имеющими меньшую скорость движения. При этом не имеет никакого значения, что не все ампликоны амплифицируются одновременно так как самое главное в подобной ПЦР, это чтобы успело размножиться столько молекул ДНК, сколько требуется для их регистрации по конечной точке электрофорезом или каким-то иным способом, либо в реальном времени по свечению соответствующего красителя(ей).

Касательно малого времени пребывания молекул ДНК в каждой из температурных зон, следует заметить, что скорость работы многих термостабильных ДНК полимераз весьма высока и за те мгновения (менее секунды), что ампликон с отожженым праймером находится в зоне, оптимальной для элонгации цепи ДНК, фермент вполне успевает построить 20 и более нуклеотидов. Время отжига праймеров и денатурации ДНК, выражающихся в образовании и разрушении водородных связей, по разным оценкам измеряемое от Милли - до пикосекунд, также не является лимитирующим. При этом главное предназначение подобной конвекционной ПЦР это не наработка протяженных фрагментов ДНК для их последующего клонирования или секвенирования, а она рассчитана на проведение массовых анализов, где размер ампликонов обычно не бывает большим, а нужна лишь большая пропускная способность метода при проведении диагностических тестов. Так, специфичность ПЦР вполне обеспечивается амплификацией фрагмента размером около 40 пар нуклеотидов с помощью праймеров, отжигающихся встык (на разных цепях) или даже с перекрытием в 1 нуклеотид, поскольку случайное нахождение таких участков нуклеотидной последовательности где-то еще в геноме или транскриптоме помимо детектируемых возможно с ничтожной вероятностью - 8×10 ^-25.

Так как геномов и тем более транскриптомов с подобными размерами или набором молекул РНК не существует то, следовательно, такое событие можно считать практически невероятным.

Таким образом, решаемая задача и ожидаемый результат заключается в ускоренном за несколько минут проведении ПЦР с помощью термоконвекции в приборе особой конструкции, иллюстрируемой фигурами 1-3.

На фиг.1 изображено устройство, состоящее из блока электронного управления (1) и реакционного блока (2-10). Реакционный блок имеет две теплоизолированные прокладкой (3) (например, из фторопласта) нагревательных пластины - нижней (2) и верхней (4), изготовленных из материала с высокой теплопроводностью (например меди, алюминия), с установленными на них элементами Пельтье (6, 7). Нижняя нагревательная пластина (2) более детально показана на фиг.2 и представляет собой диск с радиально расположенными на ней лепестками, имеющий углубления, служащие для позиционирования пробирок (5) и обеспечивающие локальный нагрев боковых стенок пробирок около ее дна для осуществления в этой зоне денатурации ДНК. Верхняя нагревательная пластина (4), более детально представленная на фиг.3, имеет форму диска с радиально расположенными на ней лепестками, повторяющими конусную форму пробирок с целью обеспечения плотного контакта, и подведения нужной температуры к внешним стенкам пробирок с противоположной стороны от места подвода температуры денатурации для обеспечения внутри пробирок в верхней зоне реакционной смеси температуры отжига, характерного для тех или иных праймеров. Радиаторы (8, 9) осуществляют отвод тепла от элементов Пельтье (6, 7) соответственно. Прижимная крышка (10) является одновременно средством для прижима пробирок к нагревательным пластинам (2, 4) и дополнительным радиатором для верхнего элемента Пельтье. Блок электронного управления (1) осуществляет управление элементами Пельтье (6, 7) и контроль температур в реакционном блоке.

При приложении соответствующих температур внутри пробирки возникает наклонный по отношению к направлению действия силы тяжести градиент температуры, запускающий эллипсоподобный конвекционный поток жидкости. Этот поток влечет молекулы ДНК и остальные составляющие реакции через зону с высокой температурой (зона денатурации), через зону средней температуры (нерабочая зона), через зону низкой температуры (зона отжига), вновь через зону средней температуры (зона элонгации) и снова в зону высокой температуры. Таким образом, за несколько секунд совершается один полный цикл вращения конвекционного потока жидкости.

Устройство для проведения полимеразной цепной реакции, характеризующееся тем, что включает блок электронного управления, реакционный блок, состоящий из нижней пластины, изготовленной из материала с высокой теплопроводностью и представляющей собой диск с радиально расположенными лепестками, имеющими углубления для позиционирования пробирок и обеспечивающими локальный нагрев боковых стенок пробирок около дна для денатурации ДНК, верхней пластины, изготовленной из материала с высокой теплопроводностью и представляющей собой диск с радиально расположенными лепестками, повторяющими конусную форму пробирок для обеспечения плотного контакта и подведения нужной температуры к внешним стенкам пробирок с противоположной стороны от места подвода температуры денатурации для обеспечения в верхней зоне реакционной смеси в пробирках температуры отжига, характерной для праймеров, верхнего и нижнего элементов Пельтье, прокладки, обеспечивающей теплоизоляцию верхней и нижней пластин и фиксацию пробирок, расположенной между этими пластинами, верхнего и нижнего радиаторов и прижимной крышки, являющейся одновременно дополнительным радиатором для верхнего элемента Пельтье.