Иммуносенсор для определения симазина

Полезная модель относится к биотехнологии и охране окружающей среды, а именно к устройствам для определения химических веществ, в частности - для определения пестицида - симазина (2-хлор-4,6-бис(этиламино)-симм-триазин).

Предложен иммуносенсор, включающий рН-чувствительный полевой транзистор, сопряженный с предварительно сформированным биорецептором, выполненным в виде мембраны, содержащей иммунные комплексы, образовавшиеся в ходе аналитической реакции между нативным и меченным пероксидазой хрена симазаном и связанными с полианионом антителами к симазину. Иммунные комплексы отделены от непрореагировавших реагентов путем добавления поликатионов за счет электростатического взаимодействия полиэлектролитов. Биорецептор укреплен на транзисторе с помощью пружинного держателя. 3 ил.

Полезная модель относится к биотехнологии и охране окружающей среды, а именно к устройствам для определения химических веществ, в частности пестицида - симазина (2-хлор-4,6-бис(этиламино)-симм-триазин).

Симазин применяется для опрыскивания почвы на посевах кукурузы; в садах, ягодниках, чайных плантациях и виноградниках до всходов сорняков; для ранневесеннего опрыскивания плантаций земляники; опрыскивания посевов озимой пшеницы и ржи до появления всходов в центральных районах нечерноземной зоны. Может сохранять токсичность в почве до двух лет и проникать в грунтовые воды (Медведь, 1974).

Для определения пестицидов триазинового ряда используются такие хроматографические методы, как газовая хроматография (Navarro et al., 2000), жидкостная хроматография (Melo et al., 2005), масс-спектрометрия (Petrovic et al., 2002) и другие. Эти методы позволяют проводить качественную и количественную оценку веществ в сложных многокомпонентных матрицах при очень низких концентрациях.

К недостаткам этих методов следует отнести высокую стоимость оборудования, необходимость тщательной очистки содержащих пестицид

экстрактов, длительность анализа, зачастую недостаточную его избирательность.

Кроме того, эти методы не подходят для измерений непосредственно на месте отбора проб.

Известен иммунологический метод для определения триазинов (патент США 5573922, 1996) с помощью конкурентного иммуноанализа, в котором к пробе пестицида из образца добавляют меченный пестицид и поликлональные антитела, при этом меченный пестицид и нативный пестицид конкурируют за связывание с поликлональными антителами, которые связываются перед, во время или после иммунологической реакции

с твердой фазой (микротитрационный планшет). Твердая фаза и не связавшиеся меченные молекулы пестицида разделяют и определяют количество метки на твердой фазе. Количество метки отражает содержание пестицида в образце. Нижний предел детекции при использовании этого метода составляет 4,1 нг/л, однако время анализа - более 3-х часов.

Применение таких иммунных методов анализа позволяет проводить чувствительное и селективное определение пестицидов, но эти анализы длительны (занимают несколько часов).

Известен способ определения симазина (Yazynina et al., 1999) с использованием конкурентного иммуноанализа, в котором к пробе пестицида из образца добавляют реакционную смесь, содержащую меченный симазин, специфические антитела к нему и конъюгат стафилококкового белка А с полианионом (полиметакрилат). После инкубации эту смесь добавляют к иммобилизованному поликатиону (поли-N-этил-4-винилпиридиниум). Поликатион иммобилизован либо на поверхности микротитрационной платы, либо на мембране. После промывки в ячейки микротитрационной платы приливают субстрат фермента и с помощью денситометра определяют оптическую плотность продуктов ферментативной реакции. Если поликатион иммобилизован на мембране, после фильтрации реакционной смеси, мембрану также промывают буфером и помещают в раствор субстрата фермента для образования цветных продуктов реакции на мембране. Интенсивность окраски мембраны определяют визуально.

Благодаря высокой кооперативности электростатического взаимодействия заряженных звеньев полимеров (полианиона и поликатиона) и комплементарному их расположению процесс связывания противоионов идет с крайне высокой скоростью и в широком диапазоне условий - практически необратимо (Блинцов и др., 1995). Поэтому при добавлении реакционной смеси к иммобилизованному поликатиону происходит быстрая иммобилизация иммунных комплексов на твердой фазе, а

непрореагировавшие молекулы остаются в растворе и быстро отделяются промывкой буфером.

При этом все иммунохимические стадии анализа идут в растворе, где уровень диффузионных ограничений существенно ниже, а затем проводится быстрая стадия разделения реагентов. Тем самым значительно сокращается продолжительность анализа (с 100-120 до 20-25 мин). Высокая аффинность взаимодействия между полимерами обеспечивает вытеснение не специфически связавшихся молекул, благодаря чему снижается фоновый сигнал и уменьшается вероятность ошибочной диагностики.

Чувствительность такого анализа составляет 1 нг/мл для денситометрических измерений и 10 нг/мл для визуальных измерений.

К недостаткам этого метода стоит отнести невысокую точность анализа в случае визуальных измерений.

Известен иммуносенсор на основе ион-селективного транзистора для определения симазина (Starodub et al., 2000). В указанном устройстве поликлональные антитела к симазину прикреплены непосредственно к затвору транзистора через стрептококковый белок А. Используют 2 метода определения симазина - (1) конкурентный иммуноанализ, когда молекулы нативного (определяемого) и меченного пероксидазой симазина конкурируют за связывание с антителами на поверхности полевого транзистора, и (2) последовательное насыщение, когда антитела взаимодействуют сначала с нативным симазином в исследуемом образце, а затем с меченным ферментом - пероксидазой хрена - симазином. Концентрация связавшегося с антителами конъюгата пропорциональна начальной концентрации антигена и служит характеристикой его содержания в исследуемом образце.

Каталитическую активность связанной с симазином пероксидазы (конъюгат симазин-пероксидаза) измеряют в присутствии аскорбиновой кислоты и пероксида водорода. Предел определения симазина конкурентным иммуноанализом составляет 1,25 нг/мл, линейный диапазон 5-175 нг/мл.

Последовательное насыщение антител приводит к росту чувствительности анализа до 0,65 нг/мл. Анализ занимает около 50 мин.

Однако подготовительные процедуры (очистка поверхности транзистора, иммобилизация антител на поверхности транзистора с использованием бычьего сывороточного альбумина, глутарового альдегида, белка А и глицина) очень длительны и занимают больше 15 часов.

Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель, - создание устройства для быстрого и чувствительного определения симазина, простого по конструкции и эксплуатации.

Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемой полезной модели, заключается в том, что иммуносенсор обеспечивает быстрое определение содержания симазина без использования сложного дорогостоящего оборудования.

Сущность полезной модели.

Предложен иммуносенсор для определения пестицида симазина, включающий рН-чувствительный полевой транзистор, сопряженный с предварительно сформированным биорецептором, выполненным в виде мембраны, содержащей иммунные комплексы, образовавшиеся в ходе аналитической реакции между нативным и меченным пероксидазой хрена симазином и антителами к симазину. Биорецептор укреплен на транзисторе с помощью пружинного держателя.

При этом рН-чувствительный полевой транзистор (1) укреплен на основании (2) и подключен в измерительную цепь через разъем (3). На затворной области транзистора находится биорецептор (4), прижатый к поверхности транзистора с помощью пружинного держателя (5). Транзистор погружен в измерительную ячейку (6) с буферным раствором (Фиг.1).

Формирование биорецептора осуществляют отдельно от транзистора по следующей схеме (Фиг.2):

1. В ячейки иммунологического планшета последовательно добавляют следующие растворы иммунореагентов в 50 мМ К-фосфатном буфере рН 7,4, содержащем 0,1 М Nad (ФБ1) и 0,05% детергента Tween-20 (ФТБ):

а) 25 мкл образца, содержащего антиген - симазин;

б) 25 мкл конъюгата симазин-пероксидаза (концентрация конъюгата 4 мкг/мл по пероксидазе), полученного, как описано в работе Yazynina et al., 1999;

в) 50 мкл специфической антисыворотки (разведение 1:500);

г) 50 мкл конъюгата белок А - полиметакрилат (20 мкг/мл), полученного, как описано в работе Yazynina et al., 1999.

Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут при постоянном встряхивании.

2. В специальное микрофильтрационное устройство помещают нитроцеллюлозную мембрану. В каждую ячейку устройства вносят по 50 мкл раствора поликатиона - поли-N-этил-4-винилпиридиния (40 мкг/мл, в ФБ1). После полной фильтрации раствора через мембрану добавляют по 50 мкл ФБТ для ее промывки. Затем вносят по 50 мкл реакционной смеси, которая получена в ходе выполнения пункта 1. После полной фильтрации растворов реакционной смеси мембрану промывают, добавляя в каждую ячейку 100 мкл ФБТ.

Затем устройство разбирают, извлекают мембрану с иммобилизованными на ней комплексами "поликатион - полианион - белок А - антитело -антиген", а именно - " поли-N-этил-4-винилпиридиний - полиметакрилат - стафилококковый белок А - антитело к симазину - симазин", и "поликатион - полианион - белок А - антитело - антиген - фермент", а именно - "поли-N-этил-4-винилпиридиний - полиметакрилат - стафилококковый белок А - антитело к симазину - симазин-пероксидаза хрена".

Эта мембрана и является биорецептором иммуносенсора.

Иммуносенсор работает следующим образом.

Сформированный биорецептор (4) помещают на затворную область транзистора (1), прижимают с помощью пружинного держателя (5) и погружают в измерительную ячейку (6) объемом 2 мл с буферным раствором ФБ2 (1 мМ К-фосфатный буфер, содержащий 0,015 М NaCl, pH 6,4). Затем добавляют 10 мкл аскорбиновой кислоты и 10 мкл о-фенилендиамина, регистрируют базовый уровень электрического сигнала. Реакцию фермента, размещенного в биорецепторе, инициируют добавлением 10 мкл пероксида водорода. Регистрируют максимальную скорость изменения сигнала транзистора в ходе каталитической реакции.

После анализа использованный биорецептор убирают и на затвор транзистора помещают новый биорецептор для следующего анализа.

На основании полученных данных строят калибровочную кривую (Фиг.3).

Для определения неизвестной концентрации пестицида во время проведения анализа в п.1 (а) протокола иммуноанализа добавляют 25 мкл образца с неизвестным количеством симазина, далее действуют по описанному выше протоколу. Затем по калибровочной кривой (Фиг.3), отражающей зависимость сигнала сенсора от концентрации симазина, определяют концентрацию симазина в анализируемом образце.

Принципиальными особенностями, отличающими предлагаемый иммуносенсор от известных устройств для определения симазина и позволяющими повысить чувствительность и сократить время анализа, являются:

1) Использование сменных носителей - мембран для иммобилизации иммунореагента и детектируемых иммунных комплексов - в отличие от традиционно применяемой иммобилизации непосредственно на поверхность электрода, занимающей несколько часов (Starodub et al., 2000).

Данный подход существенно повышает производительность анализа, особенно при необходимости одновременного тестирования значительного

количества образцов, так как позволяет избегать регенерации поверхности транзистора.

2) Быстрое отделение сформировавшихся в ходе аналитической реакции иммунных комплексов от непрореагировавших молекул, основанное на электростатическом взаимодействии между растворимыми линейными полиэлектролитами - носителями иммунореагентов.

Этот подход, - благодаря высокой кооперативности поливалентного электростатического взаимодействия, - значительно снижает уровень неспецифических взаимодействий и тем самым вероятность ошибочной диагностики, а также в несколько раз сокращает продолжительность анализа при использовании тех же иммунокомпонентов.

3) Применение оригинальных систем усиления каталитической активности для детекции пероксидазы, основанных на использовании специальной субстратной смеси, включающей о-фенилендиамин, аскорбиновую кислоту и пероксид водорода.

В этой смеси о-фенилендиамин играет роль электронного медиатора при трансформации аскорбиновой кислоты в гидроаскорбиновую, при этом изменяется рН раствора, что регистрируется транзистором. Это обеспечивает высокую амплитуду детектируемого сигнала, тем самым снижая порог детекции формирующихся иммунных комплексов и улучшая чувствительность иммуносенсора.

Диапазон количественного определения симазина составляет 2,6 - 333 нг/мл. Аналитическая процедура занимает 20-25 минут, а непосредственно электрохимические измерения одного образца - не более 1-2 минут. Коэффициент вариации (отношение среднеквадратичного отклонения к среднему арифметическому значению сигнала) составляет 5-11%.

На фиг.1 представлена схема иммуносенсора на основе рН-чувствительного полевого транзистора для определения симазина, а - вид сбоку, 6 - вид спереди.

На фиг.2 показана схема формирования биорецептора иммуносенсора для определения симазина.

На фиг.3 приведена калибровочная кривая иммуносенсора для определения симазина.

Таким образом, разработан иммуносенсор для определения симазина, который обеспечивает быстрое определение содержания симазина в образце без использования сложного дорогостоящего оборудования. Применение полиэлектролитов при подготовке биорецептора позволяет сократить время анализа в 4 раза по сравнению с традиционными иммуноферментными методами, а формирование биорецептора отдельно от транзистора позволяет избежать процедуры регенерации поверхности транзистора и также сокращает время анализа.

Список цитируемых источников:

1. Melo L.F., Collins C.H., Jardim I.C. High-performance liquid chromatographic determination of pesticides in tomatoes using laboratory-made NH2 and С 18 solid-phase extraction materials. // J. Chromatogr A. - 2005. V.1073, №1-2. - P. 75-81.

2. Navarro S., Oliva J., Barba A., Garcia C. Determination of simazine, terbuthylazine, and their dealkylated chlorotriazine metabolites in soil using sonication microextraction and gas chromatography. // J AOAC Int. - 2000. V.83, №5. - P. 1239-1243.

3. Petrovic M., Eljarrat E., Lopez de Alda M.J., Barcelo D. Recent advances in the mass spectrometric analysis related to endocrine disrupting compounds in aquatic environmental samples. // J. Chromatogr. A. - 2002. V.974. - P. 23-/51.

4. Starodub N.F., Dzantiev B.B., Starodub V.M., Zherdev A.V. Immunosensor for the determination of the herbicide simazine based on an ion-selective field-effect transistor. // Analytica Chimica Acta. - 2000. V.424, №1. - P. 37-43.

5. Yazynina E.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Izumrudov V.A., Gee S.J., Hanimock B.D. Immunoassay techniques for detection of the herbicide simazine based on use of oppositely charged water-soluble polyelectrolytes. // Anal. Chem. - 1999. V.71. - P. 3538-3543.

6. Блинцов А.Н., Дзантиев Б.Б., Бобкова А.Ф., Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Атабеков И.Г. Новый метод иммуноанализа растительных вирусов, основанный на использовании интерполиэлектролитных реакций. // Доклады РАН. - 1995. Т. 345, N 2. - С.263-267.

7. Медведь Л.И. Справочник по пестицидам. // Киев: Урожай. - 1974. - 448 с.

8. Патент США №5573922, G01N 33/53, 12.11.1996.

Иммуносенсор для определения симазина, включающий рН-чувствительный полевой транзистор, с укрепленным на нем с помощью пружинного держателя предварительно сформированным биорецептором, выполненным в виде мембраны, содержащей иммунные комплексы, образовавшиеся в ходе аналитической реакции между нативным и меченным пероксидазой хрена симазаном и связанными с полианионом антителами к симазину, и отделенные от непрореагировавших реагентов путем добавления поликатионов за счет электростатического взаимодействия полиэлектролитов.