Тест-система для полуколичественного иммуноферментного определения аллергенспецифических ige-антител к лекарственным средствам в сыворотке крови человека (ige-ат-ифа-лекарственная)

Полезная модель относится к медицине, а именно, к лабораторной диагностике. Поставленная задача осуществляется посредством предлагаемой тест-системы IgE-AT-ИФА. Полезная модель представляет собой комплект, в состав которого входят набор реагентов, включающий твердофазный носитель в виде стрипированного полистиролового планшета с референс-реагентами и стрипами, иммобилизованными лекарственными аллергенами; калибраторы, готовые к применению, позитивный и негативный контроли, промывочный раствор, конъюгат aHTH-IgE-пероксидаза хрена, субстрат-хромогенную смесь (ТМБ), стоп-реагент и инструкцию по применению, упакованные в одной коробке.

Полезная модель относится к медицине, а именно, к лабораторной диагностике.

На фоне резкого ухудшения экологии, стремительного темпа жизни и постоянных стрессов увеличился удельный вес хронических соматических и аллергических заболеваний. Особое место в структуре аллергий занимают побочные эффекты фармакотерапии, в том числе и лекарственная аллергия. Это связано как с успехами фармакологии и созданием большого количества новых лекарственных средств, так и с расширением ассортимента поддельных и некачественных препаратов, самолечением и злоупотреблением медикаментами. Увеличение аллергопатологии среди населения, связанное с изменением реактивности организма, также ведет к росту осложнений лекарственной терапии, в том числе и аллергических реакций на медикаменты (Хаитов P.M. Клиническая аллергология. Руководство для практических врачей, МЕДпресс-информ, М., 2002). Доктрина полихимиотерапии, которая является доминирующей в современной медицине, кроме известных преимуществ, несет в себе и немало опасностей. Главная из них - это многообразные побочные действия лекарственных препаратов. Поскольку в лечении лекарственными препаратами практически всегда используются химиопрепараты, совершенно естественно ожидать от них многообразного действия на живой организм. Специалистами описаны разнообразные побочные действия лекарственных препаратов, среди которых ведущими являются токсические, аллергические реакции, дисбактериозы, воздействие на эмбрион, хромосомный аппарат человека и

другие.

Как известно, подавляющее большинство лекарственных препаратов представляют собой неполноценные антигены-гаптены. Только соединяясь в организме с белками сыворотки крови, они приобретают свойства полноценного аллергена. Против такого конъюгированного антигена в организме накапливаются антитела - происходит сенсибилизация так же, как и в отношении прочих антигенов. При повторном поступлении лекарства в организм происходит известный каскадный процесс: взаимодействие антигена с антителами - выделение медиаторов - патофизиологическая реакция - клинические проявления. Вероятность аллергической реакции на лекарственное средство повышается пропорционально частоте использования лекарства в общей популяции. Эти реакции происходят после периода сенсибилизации либо активным веществом, либо «инертной» субстанцией (наполнителем), применяемой в технологии приготовления лекарств. Сенсибилизация может произойти при любом способе применения препарата: пероральном, парентеральном или местном. Выраженными антигенными свойствами обладают гормоны, ферменты, гетерологичные сыворотки, белковые препараты крови человека. Большинство же лекарств являются низкомолекулярными соединениями, т.е. неполными антигенами (гаптенами). Для образования полноценного антигена они должны связаться с транспортным белком организма, образовать комплекс белок - лекарство. Именно этот комплекс и стимулирует развитие иммунной реакции. (Лопатин-Бремзен А.С., Лекарственный шок, - Москва, - 2001, - 201 с.).

Нозологическая и этиологическая диагностика лекарственной аллергии в наиболее типичных случаях, когда больной принимает ряд препаратов, представляет значительные трудности. Частота диагностических ошибок достигает 30%, что связано с полиморфизмом клинической картины лекарственной аллергии, неправильной оценкой анамнеза, ошибками в интерпретации клинических и лабораторных данных, трудностями в идентификации лекарственного антигена.

Известно, что лекарственная аллергия - это вторичная повышенная специфическая иммунная реакция на лекарственные препараты и медикаменты, сопровождающаяся общими или местными клиническими проявлениями. Она развивается только на повторное введение (контакт) препаратов или средств со сходной химической структурой.

Существуют две категории больных с данной патологией. У одних лекарственная аллергия возникает как осложнение при лечении какого-то заболевания, нередко аллергического по природе, существенно отягощает его течение, а нередко становится основной причиной инвалидности и смертности. У других - это профессиональное заболевание, являющееся основной, а нередко и единственной причиной временной или постоянной нетрудоспособности. Как профессиональное заболевание лекарственная аллергия возникает у практически здоровых лиц в связи с их длительным контактом с лекарствами и медикаментами (врачи, медицинские сестры, фармацевты, работники заводов медицинских препаратов) [П.Д.Новиков, Д.К.Новиков, Ю.В.Сергеев - Диагностика лекарственной аллергии - Витебск, 2003].

Таким образом, проблема аллергических болезней и, в частности, лекарственной аллергии, является важной медико-социальной проблемой современности, значение которой будет возрастать в последующие годы. Следовательно, решение практических медицинских вопросов этой проблемы в значительной степени зависит от качества специфической аллергодиагностики.

В связи с изложенным, возникла необходимость применения комплекса лабораторных методов для достоверной диагностики лекарственной аллергии, включающий обязательное определение специфических IgE-антител, что используется в практике клинико-диагностических лабораторий для диагностики реагинового и смешанного типов аллергических реакций, вызванных различными видами аллергенов. Пути решения

указанных проблем нашли свое отражение в Приказе Минздравсоцразвития России №342 от 16 мая 2005 г, где в приложении №1 «ПОЛОЖЕНИЕ ОБ ОРГАНИЗАЦИИ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ВРАЧА АЛЛЕРГОЛОГА- ИММУНОЛОГА» в разделе «Диагностика» обязательным пунктом вошло определение специфических IgE-антител к различным видам аллергенов.

Среди лабораторных методов в специфической диагностике аллергий наиболее информативными являются иммунологические: радиоаллергосорбентный тест (PACT) и метод иммуноферментного анализа (ИФА), выявляющие с большой достоверностью специфические IgE и IgG-антитела к различным аллергенам. Диагностическая ценность данных методов весьма высока и составляет 87-93%. Информативность кожного тестирования - лишь 49% (Аллергические болезни. Диагностика и лечение. Под ред. Р.Паттерсона. М., Гэотар Мед., 2000, с.733.).

Вместе с тем, отечественных тест-систем для диагностики реагинового типа лекарственной аллергии нет. Определение специфических IgE-антител к лекарственным средствам в клинико-диагностических лабораториях России проводится с использованием наборов реагентов зарубежной компании Dr.Fooke Laboratorien GmbH [дистрибьютор фирмы Dr.Fooke Laboratorien GmbH (Германия) - ЗАО "БиоХимМак Диагностика", г.Москва.], которая является наиболее близкой по техническому решению.

Тест-система включает:

1. Конъюгат анти-IgE-щелочная фосфатаза, субстрат PNPP (пара-нитрофенил-фосфат) в таблетках, субстратный буфер, буфер для промывки, стоп-раствор. Регистрация оптической плотности осуществляется при 405 нм.

2. Набор калибраторов для построения калибровочной кривой (диапазон стандартов 4 шт), включая референсные аллергодиски и калибраторы.

3. Контрольные сыворотки (позитивный и негативный контроли по специфическим IgE к аллергену d1).

4. Аллергодиски (заказываются отдельно). Температура инкубации 37°С-18-25°С; время анализа - 5 часов/22 часа.

Принцип метода: аллергены иммобилизованы на нитроцеллюлозных дисках диаметра лунки микропланшета. Аллергодиски поставляются с дополнительными HSA-дисками для контроля неспецифического связывания. При определении уровня специфических IgE-антител к лекарственным аллергенам сыворотка пациента должна быть параллельно проанализирована с контрольным HSA-диском. Калибраторы (по 4 точкам) предварительно разводят титрованием. Аллергены связываются со специфическими антителами, присутствующими в сыворотке крови пациента. Избыток антител удаляется на стадии промывки. На следующем этапе фермент-меченые антитела связываются с аллерген-антительным комплексом. После промывки и удаления несвязавшихся компонентов добавляется субстратный раствор, взаимодействующий с ферментом, в результате образуется цветной комплекс. Оптическая плотность полученного раствора прямо пропорциональна концентрации специфических IgE-антител в образце сыворотки.

Однако, указанная тест-система для определения специфических иммуноглобулинов класса Е, имеет ряд существенных недостатков:

- дополнительные затраты времени и реактивов на предварительное разведение сыворотки пациентов, титрование калибраторов и приготовление субстратного раствора (PNPP);

- дорогостоящее оборудование и реагенты (стоимость 1 набора реагентов, без дисков, которые заказываются отдельно, составляет 220 EUR);

- неудобства в постановке реакции, связанные с размещением аллергодисков в лунки планшета и последующих стадий отмывки, требующей наличия автоматического вошера;

- длительность постановки реакции.

Выше перечисленное не позволяет широко использовать тест- систему в практическом здравоохранении.

Поставлена задача разработки тест-системы для полуколичественного иммуноферментного определения специфических IgE-антител к лекарственным препаратам в сыворотке крови пациентов (IgE-AT-ИФА).

Поставленная задача осуществляется посредством предлагаемой тест-системы IgE-AT-ИФА-лекарственная.

Тест-система представляет собой полный набор необходимых реагентов и предназначена для полуколичественного определения содержания специфических IgE к лекарственным средствам в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа.

Набор рассчитан на обследование 16-ти пациентов к 11 лекарственным средствам.

В наборе использованы моноклональные анти-IgE-антитела, входящие в пероксидазный конъюгат, способные методом неконкурентного непрямого твердофазного иммуноферментного анализа выявлять в сыворотке крови человека антитела класса иммуноглобулина Е, аффинно взаимодействующие с лекарственными средствами, нанесенными на поверхность полистиролового планшета. Активность пероксидазы на твердой фазе определяют по разложению субстрата - перекиси водорода. Продукт реакции разложения превращает молекулы хромогена (тетраметилбензидина) в окрашенное производное, количество которого пропорционально ферментативной активности. Система ТМБ-субстрат обеспечивает примерно в 10 раз более высокую чувствительность выявления пероксидазы, чем другие системы и, кроме того, менее токсична.

Результаты анализа регистрируют с помощью фотометра вертикального сканирования при длине волны 450 нм.

Состав набора:

1. Два полистироловых 96-луночных наборных планшета, включающих стрипы, покрытые анти-IgE-AT (референс-стрипы) и стрипы, покрытые антигенами лекарственных препаратов (11 наименований);

2. Калибровочные пробы по 6 точкам (0,0 - 200 МЕ/мл) - готовые к употреблению;

3. Позитивный и негативный контроли - готовые к употреблению;

4. Конъюгат МКАТ анти-IgE с пероксидазой хрена (100-кратный концентрат);

5. Промывающий раствор, 10-кратный концентрат: трис-буфер (трис, натрия хлорид, твин-20);

6. Субстрат-хромогенная смесь (ТМБ) - готова к употреблению;

7. Стоп-реагент (IN H2SO4) - готов к употреблению.

Исследуемые пробы для получения сыворотки собирают в сухие пробирки. Если тестирование проводится не сразу, то пробы можно хранить при температуре - 20°С в течение 3 месяцев.

Во все лунки стрипов вносят по 90 мкл промывающего раствора. В лунки A-F первого ряда вносят по 10 мкл калибраторов. В лунку G вносят 10 мкл позитивного контроля. В лунку В вносят 10 мкл негативного контроля. В остальные лунки вносят по 10 мкл исследуемых сывороток. Планшет помещают на 3-5 мин на шейкер для перемешивания, затем инкубируют в термостате в течение 1 часа при температуре +37 С.

Процедуру отмывки проводят трижды, внося в лунки по 150 мкл промывающего раствора.

Во все лунки вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата анти-IgE, планшет помещают на 3-5 мин на шейкер для перемешивания и инкубируют в течение 1 часа при температуре +37°С.

Повторяют процедуру отмывки.

Вносят субстрат-хромогенную смесь по 100 мкл в каждую лунку планшета.

Инкубируют в защищенном от света месте при комнатной температуре в течение 10-20 минут, до появления ферментативной реакции, которая дает голубое окрашивание.

Вносят стоп-реагент по 50 мкл в каждую лунку планшета. Содержимое лунок окрашивается в ярко-желтый цвет.

Измерение оптической плотности (ОП) проводят при длине волны 450 нм сразу после остановки реакции. Общее время постановки реакции составляет 3-3,5 часа

Учет результатов

Анализ считается действительным, если ОП раствора А превышает 1,5.

Предлагается построение калибровочной кривой на линейной миллиметровой бумаге, откладывая на оси Y значения оптических плотностей, а на оси Х - концентрации калибраторов.

Результаты тестирования представляются как точное содержание специфических антител в 1 мл сыворотки, выраженное в МЕ/мл. Возможно также использование общепринятой системы классов значений RAST.

Чувствительность полуколичественного метода анализа оценивается минимальным уровнем IgE-антител (1 класс).

Точность определяется способностью тест-системы давать одинаковые результаты при тестировании одной и той же сыворотки на одном стрипе. Выражается коэффициентом вариации различных специфичностей в 8 репликантах каждого образца сыворотки.

Сравнительный анализ исследований сыворотки пациентов в предлагаемой полезной модели проводили с исследованиями этих же образцов сывороток с использованием диагностического набора по определению специфических IgE-антител к лекарственным антитенам фирмы Dr.Fooke Laboratorien GmbH (Германия).

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что иммуноферментое определение специфических IgE-антител предлагаемой тест-системой IgE-AT-ИФА-лекарственная не уступает, а в некоторых случаях даже превосходит показатели тест-системы Dr.Fooke Laboratorien GmbH.

Полученные результаты сравнения позволяют сделать вывод о том, что предлагаемая полезная модель в виде тест-системы для полуколичественного иммуноферментного определения специфических IgE-антител в сыворотке крови человека (IgE-AT-ИФА-лекарственная) может конкурировать с зарубежными аналогами. Минимальное количество сыворотки, расходуемой на 1 аллерген (10 мкл) позволяет рекомендовать использование тест-системы как в практическом здравоохранении вообще, так и в педиатрии, в частности.

Предлагаемая полезная модель:

1. Позволяет определять специфические IgE-антитела к широкому спектру лекарственных аллергенов;

2. Доступна по цене, и может быть использована в скрининговых исследованиях во всех клинико-диагностических лабораториях, имеющих планшетный или стриповый спектрофотометр;

3. Безопасна в работе;

4. Высокочувствительна и характеризуется хорошей воспроизводимостью результатов;

5. Тест-система оптимальна по соотношению специфичность - чувствительность - цена - удобство использования.

Тест-система для полуколичественного иммуноферментного определения аллергенспецифических IgE-антител к лекарственным средствам в сыворотке крови человека представляет собой набор реагентов, включающий носитель с иммобилизованными аллергенами, калибраторы, промывочный раствор, конъюгат, субстрат, хромоген, стоп-реагент, отличающаяся твердофазным носителем, представляющим собой стрипы полистиролового планшета, наличием референс-стрипов с иммобилизованными на твердофазном носителе МКАТ анти-IgE, диапазоном концентраций калибровочных проб, готовых к употреблению, конъюгатом анти-IgE-пероксидаза хрена, ТМБ-субстратом, обеспечивающим высокую чувствительность выявления пероксидазы, отсутствием технологии предварительного разведения калибраторов и сывороток пациентов, сокращением времени постановки реакции.