Монаколин к, обладающий гипохолестеримическим действием

Авторы патента:

АКИРА ЭНДО

C07D309/30 - атомы кислорода, например дельта-лактоны

A61P7 - лекарственные средства для лечения нарушений состояния крови или внеклеточной жидкости

A61P3 - Лекарственные средства для лечения нарушения обмена веществ (крови или внеклеточной жидкости A61P 7/00)

A61K31/366 - содержащие шестичленные кольца, например, дельта-лактоны

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических республик ни969702 (61) Дополнительное к авт. сеид-ву-. (22) Заявлено 12.,09. 80 (21) 2887300/

/2977031/23-04 (23) Приоритет 20..02.80 (32) 20.02. 79

{И1М. Кл.з

07 0 309/30

A 61 К 31/35

Государственный комитет

СССР ао делам изобретений и открытий (31) 17856/79 (33) Япония

Онубликоваио 30.10.82.Бюллетень М40 (53) УДК 547 ° 812. 5. .03(088.8) Дата опубликования описания 30. 10, 82

Иностранец

Акира Эндо (Япония) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Санкно Компани Лимитед" (Япония ) (71) Заявитель (54 ) МОНАКОЛИН К, ОБЛАДИ00(ИИ

ГИПОХОЛЕСТЕРИМИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ

НО

Изобретение относится к новому биологически активному соединению, а именно Моиаколину К формулы проявляющему гопохолестеримическую активность.

Указанное свойство позволяет предполагать возможность применения этого соединения в медицине.

Известен лактон (ML-236B) формулы обладающий гнпохолестеримическим действием 1).

Цель изобретения вЂ” расширение арсенала средств воздействия на живой организм.

Поставленная цель достигается новым соединением формулы (1) в качестве вещества, обладающего гипохолестеримическим действием.

Монаколин К получают культивацией в аэробных условиях микроорганизмов вида Monascus, преимущественно

Monascus ruber штамм 1005 (FE RM 4822) прн 20-350С.

Рост микроор; анизмов

Рост на картофельно-глюкозно-агаровой среде при 25 С протекает быстро: диаметр колонии достигает

6-6,5 см спустя 10 сут после инокуляции. Колония плоская и развивает относительно тонкий базальный слой гиф. Развитие воздушных гиф слабое воздушные гифы белые и большинство иэ них спущены. На базальном слое

25 гнф образует множество клейстотеций и по мере созревания становится ,красновато-коричневым. Поверхность н нижняя сторона колонии по цвету могут быть от коричневой до краснова30 то-коричневой.

969702

Рост на агаровой среде Сабуро

;(Sabourand) при 25 С очень быстрый:, диаметр колонии достигает 6-6,5 см спустя 10 сут после инокуляции, IIoверхность колонии очень плоская и базальные и воздушные гифы развиваются лучше,у чем на кар офельноглюкозйо-агаровой среде. Число клейстотеций весьма немногочисленно. Поверхность колонии IIo цвету может быть от красновато-желтой до красно- (О вато-коричневой, а обратная сторона от красновато-коричневой до темнокоричневой °

Рост на агаре, на отваре из овся ной муки при 25"С протекает медлен- 1$ но: диаметр колонии достигает 1,52 см спустя 10 сут после инокуляции

Колония плоская. -::азвитне воздушных гиф и образование клайстотеций весьма слабое. Поверхность и обратная20 сторона колонии по цвету могут быть темно-красной до красновато-корич,невой.

Рост на агаровой среде Чапека прн

25 С очень медленный: диаметр колонии достигает 1,6-1,8 см спустя

10 сут после инокуляции.

Скорости роста на каждой из приведенных сред при 37ОС по су ществу равны скоростям при 25ОC. 30

Морфологические признаки.

Клейстотации сферические диаметром 30-60 мкм, стенки кле1 .стотеций тонкие и пленчатые, их но.кки имеют чашелистиковые стенки и каждая сос- 35 тоит иэ гифы диаметром 3 5-4,5 мкм и длиной 15-70 мкм. Сумка состоит нз

8 спор, и она приблизитсл; но сферическая и быстро исчезающая. Аскоспоры бесцветны и имеют яйцеобразную 40 или овальную форму, размер 4-5 4-7мкм поверхности гладкие. Конидии бесцветные, по форме сферические или грушеобразные, размер 6-9 6-11 мкм, их основания плоские, стенки отно- 45 сительно толстые и гладкие. Конидии связаны вместе своими основаниями °

Конидиеносцы подобны вегетативным гифам и являются разветвленными или нераэветвленными, причем конидии" образованы на вершине. Мицелий бесцветный и разветвленный, имеет чашелистиковые стенки, большинство из которых диаметром 3-5 мкм.

На основании изученных характеристик все рассмотренные микроорганизмы идентифицированы как штаммы

Honascus ruber

Получение Монаколина К.

:Honascus ruber штамм 1005 инокулирует на жидкую культуральную среду, 60 содержащую, об.%s глюкоза 6, пептон 2,5, жидкость после эамачивания кукурузы 0,5 и хлорид аммония. Культивацию продолжают в аэробных условиях при 28 С в течение 10 сут. 65

Результирующий фильтрат ;5 л) культураиьного бульона доводят до рН

3 до;:-.-авлением 6 н. хлористоводородной кислоты, а затем экстрагируют равны;4 объемом этилацетата. Растворитель из экстракта отгоняют при пониженном давлении и остаток растворяют в F00 мл бензола. Нерастворимое вещество отфильтровывают.

Фильтрат дважды промывают, каждый раэ 100 мл 5 вес/об.Ъ водным раствором бикарбоната натрия. Затем к промытому фильтрату добавляют

1ОО мл, 0,2 н. водного раствора гидроокиси натрия и смесь перемешивают при комнатной температуре. После подтверждения исчезновения Монаколина К из бензольного слоя данными ТСХ отделяют водный слой, затем рН водного слоя доводят до 3 добавлением 6 н. хлористоводородной кислоты и результирующий раствор дважды экстрагируют каждый раз 100 мл этилацетата. Экстракт упаривают до сухого остатка при пониженном давлении, получая 260 мг масла.

Масло растворяют в бензоле, дают ему возможность кристаллизоваться, а затем перекристаллизовывают из водного раствора ацетона с получением 87 кг бесцветных игл Монаколина К.

Монаколин К характеризуется сле дующими свойствами:

Цвет и форма вЂ” бесцветные кристаллы.

Т..пл. 157,-159 С (с разложением).

Элементарный анализ, Ъ: С 71,56;

Н 8,85;.О 19,59.

Молекулярная масса 404 (по данным масс-спектрометрии).

Молекулярная формула С,Р, О, .

Уф-спектр поглощения (метанол), нм: максимум на 232, 238 и 246.

Растворимость. Растворим в низших спиртах (например метаноле, этаноле и пропаноле), ацетоне хлороформе, этилацетате и бензоле. Нерастворим в петролейном эфире и гексане .

Удельное вращение (с = .+307,6 (с = 1, метанол).

Тонкослойная хроматография:

Rg- =О, 47 Р 5715 Киэельгель 60 F ó силикагель (фирма "Мерк энд Ко" ), проявление смесью 4:1 метиленхлоридацетон, детектирование в виде Уф поглощающей массы, 50% (об./об. ) серная кислота (цвет от бледно-красного до красновато-коричневого проявляется при нагревании ) или йодом.

Соединение является нейтральным и нерастворимо в нейтральной или кислотной водной среде. Оно переводится в кислотное соединение в результате обработки щелочью и может быть затем растворено в воде. Это кислотное соединение может быть экстрагировано этнлацетатом или хлоро969702

Используют подопытных кроликов, имеющих вес тела 2,7-2,9 кг. Каждому кролику перорально вводят

1 мг/кг Монаколина К дважды в сутки (утром и вечером) непрерывно в течение 5 сут. Перед введением и на третий и пятый день после введения собирают кровь иэ ушной вены и определяют содержание холестерина в сыворотке. крови.

В результате установлено, что содержание холестерина на третий и пятый день после введения Монаколина К на 15 и 29% соответственно ниже уровня до введения Ионаколи.на К.

В дополнение к значительному ингибирующему эффекту в отношении биосинтеза холестерина, Монаколин К характеризуется крайне низкой токсичностью. Так, пероральная токсичность (О« ) Монаколнна К для мышей составляет .1 г/кг веса тела или еще большую величину.

Сравнение гипохолестеримического действия Монаколина К и его аналога И -263 В при проявлении испытаний на крысах, после введения им

Тритона MR-1339, показало, что Монаколин K оказался в четыре-пять раз более активным (см. таблицу). наколина К и NL-236 В

Плазма липндов, мг/г

Доза, мг/кгХолестерин печени, мг/г

Препарат

Холестерин Триглицерид

631+19

Контроль

3,861+165

4,14+0,1

4 490+16 . 4,020+178 (-22,3% Р< 0,01) 3,40+0,11 (-17,5В. Р <0,01) Ионаколин К

422+18 (-ЗЗ,1а. Р.» 0,01) 640+24

51 2+18 (-18,9Ф.Р С 0,02) 3, 856+231

3,756+220

4,003+187

3,19+0,14 (-22, 8%. Р»0,01), 4,00+0,12

М .-236 В

3,43+0,01 (-16,72%.P 0,01) 20

3, 16+0, 29 (-23,3%. Р с0,01) 3,960+135

408+15 (-35,3%.Р<0,001) 100

Среднее значение + стандартная ошибка для пяти крыс

В скобках приведен процент уменьшения холестерина по сравнению с контролем и значением достоверности. формом при значениях рН, соответствующих кислой среде, и может быть превращено вновь в Монаколин К при .отгонке растворителя.

Изучение физиологической активности

Физиологическая активность Монаков лина К оценена и определена количественно с помощью следующих испытаний

in vivo u in vitro

Испытание tn vtvo на кроликах. 10

Измеряют способность Монаколина К снижать уровень содержания холестерина в крови кроликов. Вес используе-; мых животных 2,5-3,0 кг. Непосредственно перед началом эксперимента из 15 ушной вены каждого кролика берут кровь и измеряют уровень содержания холестерина s сыворотке крови общепринятым методом. Затем определенное количество Ионаколина K вводят перора-20 льно непрерывно в течение 1-5 сут и измеряют уровень содержания холес,терина в сыворотке крови. Активность

Монаколина К или содержащей Монако лин К культуральной среды опреде- 25 ляют количественно на основе данных ,по содержанию холестерина, полученных до и после введения Монаколи-. на К.

Снижение уровня содержания холес- ЗО терина в крови и печени крыс.

Используют - крыс породы ВистарИманити, каждую особь весом около 300 r. Йспытания проводят на группах крыс из 5 животных. Каждому животному внутривенно делают инъекцию 400 мг/кг Тритона MR-1339 (товарное наименование для материала, повышающего уровень содержания холестерина в крови) при одновременном введении 10 мг/кг Монаколина K. 4О

° внутрибрюшинно. Спустя 14 ч после

Гиполипидемический эффект Мо

Г внутрибрныинного введения крыс умерщвляют путем обескровливания, кровь собирают и определяют уровень содержания холестерина в ней.

Как показывают результаты испытаний, уровень содержания холестерина в крови снижается по сравнению с контрольной группой животных на

23,9Ф.

Снижение уровня содержания холестерина в крови у кроликов.

969702

8 ! обладаюар и гипохолестеримическим действием; формула изобретения

Монаколин К формулы

®© 0

Источники информации, 5 -принятые во внимание "ри экспертиза

1. Aklra Endo Honacol1Й К, а