8-(6-аминогексил)-аминоциклоаденозинмонофосфат- хлортриазинилцеллюлоза в качестве аффинного сорбента циклоаденозинмонофосфатзависимых белков
ОПИСАНИЕ 886473
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
Союз Советских
Социалистических
Республик
К АВТОРСКОМУ СВКДЕТЕДЬСТВУ (6! ) Дополнительное к авт. свид-ву (51)М. Кл.
Ъ
С 07 Н 19/20
С 12 М 11/00
6 01 и 33/50 (22) Заявлено 06.12. 79 (21) 2890604/23-04 с присоединением заявки Рй (23) П фкудерсткнны6 кемнтет
СССР не аенеи нэобретеннй и открытий риоритет
Опубликовано 15. 12. 82. Бюллетень Р6 46 (53) УД 577. 15 (088. 8) Дата опубликования описания 17 . 12 .82
Ф.Ф. шаги-йукаметова;. Б.н. ууриненк1нт 0 саввам а к....,.,;.;,б (22) Авторы изобретения
Казанский ордена Трудового Красного ЗнаМЖМ" "-ЕЬ; :. " государственный университет им. В.И УлЯЦЩщцуфщ ина (21) Заявитель
1 (54) 8-(6-АМИНОГЕКСИЛ)-АМИНОЦИКЛОАДЕНОЗИНМОНОФОСФАТ-.ХЛОРТРИАЗИНИЛЦЕЛЛЮЛОЗА В КАЧЕСТВЕ АФФИННОГО СОРБЕНТА
ЦИКЛОАДЕНОЗИНМОНОФОСФАТЗАВИСИМЫХ БЕЛКОВ
Ж, 4к(сн,) О no — P Изобретение относится к области .биохимии, в частности к новому химическому соединейию -8- (6-аминогексил)аминоциклоаденозинмонофосфат-хлортриазинилцеллюлозе МН2 11 () ()Е, 0 где Й - остаток целлюлозы, которое является продуктом иммобилизации 8" (6-аминогексил) -аминоциклоаденозинмонофосфата на целлюлозе с помощью 2,4,6-трихлор-,5-триазина. Данное соединение в силу своей то химической структуры обладает сродст вом к цикло-АМФ-зависимым белкам (на пример ферментам) и может .быть использовано в качестве- аффинного сорбента для выделения или очистки этих бел.ков путем аффинной хроматографии. Известен-иммобилизованный íà сеферозе 8-(6-аминогексил)-аминоциклоаденозинмонофосфат, обладающий аналогичными свойствами и используемый в качестве аффинного сорбента при хроматографической очистке цикло-АМФ-зависимой протеинкиназы из семенников лосося (l) . Синтез указанного аффинного сорбента основан на известной методике (2), и заключается в иммобилизации лиганда -8" (6-аминогексил) аминоциклоаденозинмонофосфата на матрице - активированной бромцианом сефарозе. Содержание иммобилизованного аналога цикло-АМФ-60 м нуклеотида íà 1"г сухой сефарозы. Для хрЬматографии на данном сорбенте достигается 10-крат-, ная степень очистки фермента. Однако данный аффинный .сорбент обладает рядом недостатков. ° 886473 Вчастности,,был установлен факт относительно быстрого отщепления лиганда от матрицы (3). Скорость отщепления при рН 5 0, т.е. условиях, при которых преимущественно проводИт- s ся аффинная хроМатография цикло-АИФзависимых ферментов, составляет -0,5 нм/ч. Недостатком известного сорбента является также его низкая устойчивость, механическая прочность и невысокая степень очистки. Целью изобретения является новый более стабильный и устойчивый аффинный сорбент, позволяющий достичь бо- 1 лее высокой кратности степени очистки. Цель достигается свойствами нового соединения -8- (6-аминогексил)-аминоциклоаденозинмонофосфат-хлортриази- 20 нилцеллюлозы, используемого в качестве аффинного сорбента цикло-АИФ-зависимых белков. Соединение получают по известному -.пособу (4) - иммобилизацией 8-(6-ами- и ногексил)-аминоцикло-АМФ на целлюлозе с помощью 2, 4,6-трихлор-Б-триазина. Пример 1. Получение сорбента. К i,5 г целлюлозы (Chemapol, ЧССР} Зо приливают 2 мл триэтиламина в 4 мп ацетона, через 10 мин к смеси добавляют 1 г 2,4,6-трихлор-g-триазина в . 20 мл холодного ацетона. Активирован-. ный таким образом носитель через з 30 мин промывают смесью ацетона и дис-. тилг ированной воды (1 :1), затем приливают 10 мл раствора 8-(6-аминогексил)-аминоцикло-АИФ (3500. спектрофотометрических единиц). Суспензию остав- щ ляют при перемешивании при,комнатной температуре на 16 ч, по истечении этого времени полученный препарат промывают 2 л смеси ацетона и дистиллированнои воды (1:1) и 0,5 л 0,1 И боратного буфера. Количество иммобилизованного лиганда в полученных аффинных сорбентах определяют по содержанию Фосфора, что в пересчете составляет 3,2 моль нуклеотида на 1 r сорбента. Пример. 2. Изучение взаимодействия.иммобилизованного на целлюлозе 8-(6-аминогексил)-аминоциклоАИФ с цикло-АИФ-.зависимым белком. Для проверки взаимодействия с цикло-АИФ-зависимым белком к 0,5 r полученного аффинного сорбента приливают 1 мл исследуемого белка в концентрации от 1 до 10 оптических единиц (1-10 мг/мл по А о). В качестве белкового препарата используют фракцию после очистки на гидроксилапатите при выделении протеинкиназы из мозга свиньи (5 . В за- висимости от исходной концентрации исследуемого блока с полученным сорбентом взаимодействует 71-923 белка соответственно. Содержание иммобилизованного лиганда в полученном сорбенте остается постоянным как в процессе. хроматографии, так и при длительном хранении. Хранение возможно в высушенном состоянии при комнатной температуре или при 4 С в виде суспензий, Сорбент обладает значительной механической прочностью, хорошей Фильтруемостью, что позволяет проводить многократную хроматографию под давлением без нарушений структуры препарата и использовать его в препаративных целях. Достигаемая 15-кратная степень очистки. Формула изобретения 8- (6-Аминогексил } аминоци клоаденозинмонофосфат-хлортриазинилцеллюлоза Формулы Н2 ГС .0 в в 11 ООК О где Я - остаток целлюлозы. в качестве аффинного сорбента циклоаденозинмонофосфатзависимых белков. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Jergil S., Guilford Н., Hosbach К. "Biospecific Affinity Chromatography of an Adenosine 3:5 - Cyciiс Monophosphate - Stimulated Protein Kinase (Protamine Kinase from Trout Testis) by цз1п0 1плоЬ|lized Adenine Йис1еойides", Biochem. J v. 139, ; 2, 1974, 441-448. 2. Ахеп Р., Porath 3., Ernback S. "Chemical Coupling of Peptides and 5 886473 б Proteins to Polysaccarides by Means "FEBS Letters>, 1972, ч. 23, it.1, of Cyanogen Halides", "йайнге", 1967, 56-58. v. 214, 1302-1304.. 4. "Иммобилизованные ферменты", под ред. Березина И.В., Антонова В,К,, 3. Tesser G.i. Fisch H.-И., Иартинека К.,И.,1976,èçä-воИГу,т.1,83 ° Schwyzer R. "Linitation of Affini ty 5. Nestегоva И., ЬазсЬепйо 1., Chronatography: Sepharose - Bound, Vasil iev V., Severin E. "Biochirn. Сус1!с 3,5 -Адепоз1ne Honophosphate", Вiophys Acta", 1975, 377, 271-281. 1 I Корректор Е. Роако Подписное Составитель О. Скородумова РевактоЕ П. Гооькова Техред Т.Иаточка «ЪГЩФЮЮВ ФЮЪ ю ю ю ЪВЮЪФ4ЮЭфюююю» Заказ 9532/31 Тираж 355 - ВНИИПИ Государственного комитета СССР по Делам изобретений и открытий 113035 Иосква Х-.35 Рачшская наб. а. 4/5 — -И вЂ”Эилиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4