Способ диагностики лимфоцитарного хориоменингита

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (б1) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 060978 (2() 2665343/28-13 (51)pA Kmз с присоединением заявки Ио

A 61 В 10/00

Государственный комитет

СССР по делан изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 30.10,80,Бюллетень ) )о 40 (53) УДК а616-07 (088. 8) Дата опубликования описания 30,1080 (72) Авторы изобретения

Л. Е. Подоплекина, Т,А. Менявцева, !0 В. Фед и О,А, Васильева

Qñ). ) "6Р glfggp -É 7

Томский ордена Трудового Красного Знамени научноисследовательский институт вакцин и сывороток (71) Заявитель (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛИМФОЦИТАРНОГО

X0PH0NEHHHFHTA

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для ранней аллергодиагностики инфекционного заболевания лимфоцитарного хориоменингита.

Известен способ диагностики лимфоцитарногб хориоменингита путем постановки реакции взаимодействия антигеьа и ан гитела (11 .

Однако известный способ не обеспечивает ранней диагностики заболевания.

Целью изобретения является ранняя диагностика заболевания, Эта цель достигается тем,,что в качестве актигена используют аллергек, полученный из мозга зараженных мышей-сосунков, исследуют кровь с помощью аллергических тестов in

vitro и по повышенной чувствительности организма к вирусу лимфоцитарного хориоменикгита диагностируют наличие заболевания, Кроме того, в качестве аллергических тестов используют показатель повреждения нейтрофилов крови, коэффициент ливиса лейкоцитов и непрямую дегрануляцию тучных клеток, 30. Способ осуществляется следующим образом, Приготовление аллергенов,Для постановки указанных реакций-используют 2 вида аллергенов. Первый готовят из мозга новорожденных лышей, инфицированных вирусом лимфоцитарного хориоменингита ЛХМ, путем. борат ко-солевой экстракции актигека вируса который затем освобождают от балластных белков фреоном 113, инактивируют и лиофилиэируют. без каполнителя, Для этого 2 - 3 дневных мышей-сосунков, вскармпиваемых матками, заражают интрацеребрально по

0,02 мм 1%-ной вируссодержащей суспензией мозга мыпей и несколько штук (5 — 10) взрослых белых мьхпей (при лимфоцитарном хориоменингите новорожденные мыши не болеют, но вирус хорошо размножается в их мозге, поэтому параллелько для контроля заражают взрослых мьхаей, которые болеют с явными клиническими проявлениями). На 6 — 7 день после заражения при появлении признаков заболевания у взрослых мышей всю партию новорожденных мыпей забивают и забирают мозг. Из последнего готовят

20%-кую суспензню (1 мп на 1 мозг) 774-,<4

t:An = — ь: — Q —, H -Н

"к бО на боратно-солевом растворе NaCf c рН 9,0, К приготовленной суспенэии добавляют фреон 113 в объеме 1:1, смесь тщательно переьюшивают и помещают в бытовой холодильник на 4 суток постоянна взбалтывая. Далее производят центрифугирование при

6000 об/мин в течение 20 мин при температуре от 0 до +4 . После центрифугирования антиген для полной инактивации вир са выдерживают в холодильнике при 4 С в течение двух недель, затем подвергают лиофилиэации на вакуум-сушильной установке в течение 36 ч, Ампулы с высушенным препаратом герматизируют под вакуумом, Характеристикой, аллергена служат его антигенная активность в РСК и содержание в нем белка, Антигенная активность этого аллергена э РСК

1:128, количество белка — 650 мг В.

Контрольный аллерген готовят тем же способом иэ Йоз-а незараженных вирусом ЛХМ новорожденных животных, содержание белка в нем составляет

728 мг Ъ, Культурный аллерген представляет собой вируссодержащую жидкость клеток эмбриона человека (КЭЧ) на уровне 2-го пассажа вируса ЛХМ в этой клеточной культуре. Клетки до инфицирования (2-4 суток) выращивают в 100 мл (матрасах) на среде 199 с 10%-ной бычьей сывороткой до образования монослоя, затем заражают вирусом в виде 10%-ной суспенэии инфицированного мозга мышей в дозе 10 — 10 ЛДЭО . После

40 минутной адсорбции вируса при

22 С клетки трехкратно отмывают раствором Хэнкса и заливают средой 199 без сыворотки, Через 3 суток инкубации при 37ОС матрасы с инфицированными клетками и жидкостью эамораживают, затем оттаивают, ценгрифугируют при 3000 об/мин 20 мин и используют для 1-го пассажа. В качестве ачлергена применяют 2-й пассаж вируса на указанной клеточной культуре .

Для этого 3-4 дневный клеточный монослой, выращенный в матрасах

100 мл, заражают вирусом 1-го пассажа на данной ткани. Ростовую среду

199 с 10%-ной бычьей сыворотки сливают и заменяют средой 199 беэ сыворотки в количестве 12 мл с содержанием вируса 1000 ЛД и . Матрасы с инфицированными клетками инкубируют в термостате в течение 3 суток при температуре 37 С, после чего их помещают в замораживающий холодильник, затем оттаивают и используют в качестве аллергена, Для изготовления контрольного культурального аллергена проделывают те же манипуляции, только при первом этапе в клетки вносят 10%-ную мозговую суспензию нормальных

tQ

26

4О

45 (неинфицированны:< вирусом ЛХМ) мы-, шей, Актив ность с пе цифичес кого (опытного) аллергена в PCK составляет

1:16 — 1:32, количество белка до

200 мг Ъ, в контрольном аллергене белка содержится 1 34 мг Ъ, Все контрольные аллергены проверяют в РСК с иммунной ЛХМ сывороткой, реакция во всех случаях должна быть отрицательной.

Для каждого пробирочного теста подбирают свою дозу опытного и состветствующего контрольного аллергена.

Так, для НДТК аллерген берут в цельном виде, для ППН и КЛЛ вЂ” в разведении 1:4 — 1:8, Для определения коэффициента лизиса лейкоцитов в опытную пробирку стерильной микропипеткой вносят

0,025 мл рабочего раствора опытного аллергена, в контрольную — 0,025 мл рабочего раствора контрольного аллергена на дистиллированной воде.

Если аллергены жидкие, то для приготовления рабочего раствора соединяют 1 часть 50%-ного раствора цитрата натрия с 8 частями аллергена, Сухие аллергены для приготовления . рабочего раствора растворяют в 5Вном растворе цитрата натрия. В обе пробирки в околодонную часть вносят по 0,1 мл крови. Для получения антикоагулирующего эффекта содержимое пробирок слегка встряхивают.

Пробирки помещают в термостат при

37бС, Через 2 ч содержимое пробирок вчоэь встряхивают в целях равномерного распределения лейкоцитов во всем объеме смеси.

Иэ каждой пробирки содержимое набирают э меланжер, для белой крови до метки 0 5 и до метки 11 осторожно насасывают 5%-ный раствор уксусной кислоты. Меланжеры тщательно встряхивают, первые три капли выпускают на вату, затем заполняют камеру Горяева, Под микроскопом с увеличением 8х10 считают лейкоциты в 100 больших квадратах, Результаты обрабатывают по формуле: где КЛЛ - индекс коэффициента лизиса лейкоцитов;

Ho — число лейкоцитов, насчитанное в 100 больших квадратах опытного препарата;

H - число лейкоцитов, насчитанное в 100 больших квадратах контрольного препарата.

Результат считают положительным при значении КЛЯ 0,10 и более.

Для определения показателя повреждения нейтрофилов из содержимого пробирок сразу после взятия иэ

774: 44

t0

25

О-к ппн=

1ОО

35 них крови меланжером гol онят мазки средне и толщи ны. Для этого используют химически чистые, обе эжиренные предметные стекла, Подсушенные на воздухе мазки маркируют и фиксируют 40 мин в спиртовом растворе нитрата меди и нитрата кальция с добанле нием к нему не посредстне н но перед фиксацией формалина (на 100 мл

96 этилового спирта берут 1,8 r

Cu (NOg)>, 0,9 г Са (NO )< и 10 мл

40%-ного формалина) ° После фиксации мазки отмывают от формалина в трех порциях 96оспирта (по 10 мин в каждой) и красят на выявление гликогена по методу Шабадаша: 40 мин выдерживают н растворе периодата при комнатной температуре, промывают 2 мин в дистиллированной воде, погружают на 30 — 40 мин в реактив Шиффа, обрабатывают в 2 порциях (по 3 мин в каждой) сернистой воды, промывают 30 мин н дистиллированной воде, ядра клеток докрашивают 5 — 8 мин (в зависимости от качества красителя) - 0,1%-ным раствором Аэура П, Мазки просматривают под микроскопом с иммерсионной системой, увеличение 90xlO, В каждом препарате исследуют 100 нейтрофилов и определяют количество поврежденных, т . е. с проявлением амебоидной активности, Расчет реэультатон: где ППН вЂ” го каз атель повреждения нейтрофилов;

Π— число поврежденных нейтрофилов в опыте; число поврежденных нейтрофилов в контроле;

100 — количество просмотренных н мазке клеток, Результат считают положительным при значении ППН больше 0,10, для постановки непрямой реакции дегрануляции тучных клеток кровь набирают н сухую пробирку в коли.честве 1,0 мл, помещают в бытовой холодильник, через 18 — 20 ч отсасывают сыворотку для реакции. Тучные клетки получают из перитонеального эксудата интактной крысй. Для этого крысе под глубоким эфирным наркозом вводят ннутрибрюшинно

5 — 8 мп подогретого до 37 С раствора р роде без глюкозы, После 1,5 минутного легкого массажа брюшка делают послойный разрез длиной 15 мм через все слои передней брюшной стенки, Крысу быстро поворачивают брюшком вниз и собирают стекающий из разреза по кишечным петлям эксудат с раствором Тироде.Взвесь кл ет ок цин три фу гируют 2 ми н при

1 тыс, об/мин, 4/5 объема декантата удаляют,. осадок ресусгендируют в оставшемся объеме надосадочной жидкости, На предметное стекло, заранее окрашенное 0,3%-ным спиртовым раствором нейтрального красного, наносят по капле исследуемой сыворотки, аллергена и взвеси туч-. ных клеток, тичтельно смешивают стеклянной палочкой и закрывают обезжиренным покровным стеклом. На отдельных стеклах проверяют пригодность (отсутствие спонтанной дегрануляции), токсичность

=ыворотки (тучные клетки + сыворотка), аллергена (тучные клетки +

+ аллерген) и специфичность реакции (тучные клетки + сыворотка + контрольный аллерген) . Bce препараты помещают но влажные камеры и термостатируют 10 37 С. Препараты просматривают при увеличении 40х10, Определяют процент разрушенных тучных клеток, Результат считают положительным при разрушении более

10% тучных клеток в опытном препарате при отрицательном контроле (меньше 10 разрушенных тучных клеток и 100 просмотренных), Опыты, проведенные на 10 группах экспериментальных животных (236 морских свинок) позволяют сделать вывод, что аллергическими методами

in vitro возможно выявить сенсибилиэацию инфицированного организма вирусом ЛХМ, начиная С 3 дня инфекции, в то время, как внутрикожные аллергические пробы были положительными только с 14 дня заболевания. С этого же срока стала возможна и серодиагностика.

Предлагаемый способ обеспечинает раннюю диагностику лимфицитарного хориоменингита. Любой из трех предлагаемых тестов обеспечивает раннее выявление заболевания. Все реакции просты, требуют минимального количества крови для исследования, воспроизводимы в практической лаборатории при наличии комерческих аллергенов.

Формула изобретения

1, Способ диагностики лимфоцитарного хориоменингита путем постановки реакции взаимодействия антигена и антитела, отличающийся тем, что, с целью ранней диагностики заболевания, в качестве антигена используют аллерген, полученный из мозга зараженных гаваней-сосунков, исследуют кровь с помощью.аллергических тестов in vitro и по повышенной чувствительности организма к вирусу лимфоцитарного хориоменингита диагностируют наличие заболевания, 2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве аллер774544

Составитель С. Малютина

Редактор Г. Прусова Техред X.Костелевич Корректор М.,цемЧик

Заказ 7579/3 Тираж 673 Подпи сн ое

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 гических тестов используют показатель повреждения нейтрофилов крови, коэффициент лизиса лейкоцитов и непрямую дегрануляцию тучных клеток.

Источники информации, принятые во внимание при зкспертизЪ

1. Леви М.И, Лимфоцитарный,хориоменингит, N., Медицина, 19б4, с, 124-125 (прототип),