Способ получения алкалоидов спорыньи

 

ОПИСАНИЕ

ЙЗОБРЕТЕНИЯ

< >73Я54

Союз Соаетскик

Сециапиетичжиих

Ресну6пик

К ПАТЕНТУ (6I ) Дополнительный к патенту— (5!) М. Кл.

A 61 К 31/48

С 12 Ь 13/00 (22) Заявлено 180478 (21) 2606999/28-13 (23) Приоритет — (32) 19.04. 77 (3! ) 16096/77 . (8д) Великобритании

Государствеииый комитет

СССР ио делам изооретеиий и открытий (53) УДК 678.044.29. (088. 8) Опубликовано 150580. Бюллетень 3h 18

Дата опублиКоваиия описания 20.04.80

Иностранцы

Энцо Бикко, Мария Луиза Бьянчи, и Челестино Спалла (Италия) (72) Авторы изобретения

Анаклето Мингетти

Иностранная фирма Сочиета Фармасьютичи Италиа С.п.а (Италия) (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОИИДОВ СПОРЬИЬИ

2 .незамещенная линейная Сз-С -алкильная группа, галогензамещенная линейная

С>-С -алкильная группа, галогенэамещенная бутильная группа, R — С -с -алкил, Сс-С -алкокси, галоген и 9,10-дигидропроиэводных.:

Эта цель достигается тем, что штамм CE.aviceps purpurea ATCC 15383, CRaviceps purpurea ATCC 20103 или

C()aviceps purpurea ARTCC 20019, зависимые от негидроксилированных аминокислот, выращивают на питательной среде, содержащей в качестве предшественника негидроксилированную аминокислоту

5 с последующим выделением целевого продукта.

Кроме того, в качестве негидроксилированной аминокислоты используют лейцин, фенилаланин; фенилаланин, за20 мещенный галогеном, алкилом, радикалом алкокси, тиенилом; б -пираэолил-, фурил-, пиридилаланинт линейные С C - -амийокислоты или галогензамещенные натуральные аминокислоты.!

Изобретение относится, к химико-фармацевтической промпапенности, к получению алкалоидов спорыньи. . Предложенные алкалоиды новые и способ их получения в патентной и на- о учно-технической литературе не описан.

Целью изобретенйя является получе- . ние алкалоидов спорыньи общей формулы I

Ri

NH ——

О

С0 о

В бн, н, R> P . ф > 25 нг() — бн, j

>-N 0

Н

Зо

Новые алкалоиды спорыньи проявляЮт фармакологические свойства (см. данные в табл. 1) . Фармакологические свойства зависят от типа радикалов

В и Ва, и активность этих . алкалоигде R — метил, зтил, иэопропил, «А««« - " * °:« ° С«« "-" у«М- -«Я«Ф, Õ «.;-«М — Ь«;-«: . ° « (Щф

735154

Т а блица 1

Соединение

Fn

JCfo мк

0,07 0,2

Эр гот ами н

5 -Дибензил-5 -и-хлорбензилэрготамин

100

0,03

0,02

0,1

0,08

118

Дигидроэрготамин

0,05 150

0,02

0 05

Дигидроэргокристин

0,03 174

5 - Дибензил-5 -и-хлорбензилдигидроэргокристин

0,03 0,02 190 торой они были мутагенно зависимыми, или ее аналогов.

Становится возможным получить значительно более высокие выходы алкалоида, содержащего аналог аминокислоты, в результате добавления небольших количеств аминокислоты, требуемой штамму, на первой стадии ферментации, называемой .трофофазой, и последующего добавления значительных количеств аналога на второй стадии ферментации, называемой идиофазой.

Алкалоиды спорыньи получают следующим образом.

Мицелиальную пленку скоса со штаммов продуцентов эрготамина или эргокристина или эргокриптина суспендируют в стерильной воде и раздрабливают путем встряхивания в смесителе, после чего фильтруют через шелковую ткань, Фильтрат, содержащий в основНоМ одноклеточные фрагменты, облучают

УФ-светом, чтобы добиться 90 †9 смертности. Суспензию разбавляют стерильной водой и помещают в чашку Петри на твердую среду, в которую допол- нительно добавляют аминокислоту, для которой отыскивают требуемые мутанты (т. е. лейцин или фенилаланин)..ПосЩ ле инкубирования в течение необходимого времени разросшиеся колонии переносят по хорошо известной методике в среду,, не содержащую аминокислоты, для которой отыскивают требуемые мутанты. дов может изменяться в зависимости от того, присутствует ли двойная связь в положении 9-10 или ее удаляют гидрированием.

Так, например, новые алкалоиды спорыньи общей формулы I, в которой Rq—

:C8>, à R — незамещенный бензил, об ладают сосудосуживающей активностью

5 -Дибензил-5 - и-хлор- бензилдигидроэрготамин.. Bce три новых производных проявляют по сравнению с родственными соединениями повышенную -адренолитическую активность, как при применении in

vitro, так и in vivo С другой стороны, в некоторой степени понижается острая токсичность, Предлагаемые алкалоиды спорыньи представляют собой амиды лизергиновой кислоты, содержащие циклонпептидный фрагмент, получаемый биосинтетически в результате конденсации З-аминокислот, одна из которых, т. е. пролин, присутствует во всех веществах. Циклольный фрагмент состоит, соответственно, в случае эрготамина (к =СН, R =CH С6Н5) из одной молекулы фенилаланина и одной молекулы .-гидроксиаланина; в ..случае эргокристина (Rg = СН(СН ) ;

В =СН„С Н<) из одной молекулы фенилаланина и одной молекулы -гидроксивалинар в случае эргокриптина (Rq,«

«CH (CH gg; Н,«СН,СН (СН ) ) — и з молекулы лейцина и одной молекулы к -гидроксивалина.

Штаммы С. purpurea, ïðåäâàðèòåëüíä обработанные мутагенным агентом и потерявшие спосо бность к росту в отсутствии негидроксилированных аминокислот (т. е. фенилаланин или лейцин), приобретают Способность образовывать алкалоиды, которые содержат в качестве конечной аминокислоты аналог, присутствующий в среде, при росте в присутствии аминокислоты, к действию ко1 и поэтому их можно использовать при мигрени..- Производныв, в которых R изопропил, а R — замещенный бензил или алифатическая цепочка, имеющая гидрированную двойную связь в,положении 9-10, обладают адренолитйческой активностью и воздействуют на центральную нервную систему, их можно испольэовать для лечения гипертонии.

Адренергическая блокада

735154

Штаммы, способные расти в первой среде и не способные расти во второй среде, являются зависимыми от аминокислоты. Их сохраняют последовательными переносами в среду, сбдержащую аминокислоту.

Для получения алкалоидов требуемые

5 мутанты выращивают в жидхой среде, содержащей источник углерода, источник азота, источник фосфора, источник серы и несколько минеральных солей, а также аминокислоту, которая требуется штамму. Количество аминокислоты может изменяться в пределах 0,5-2 г/л. I

После инкубирования в течение 3-5 дней в культуры добавляют аминокйсло ту, требуемую штамму, в количестве

3 — 6 г/л и затем инкубируют еще в течение 9 — 11 дней так, чтобы общее время инкубации было 14 дней. Культивирование (ферментацию) можно проводить во встряхиваемых колбах либо в фермен- 26 торах различных размеров.

К концу ферментации бульоны культур содержат аналог алкалоида и небольшие количества обычного алкалоида. Аналог алкалоида экстрагируют следующим об- 75 разом.

Бульон фильтруют и мицелий нескольКо раз экстрагируют 4%-ным водным раствором винной кислоты. После фильтра- ЗО ции водную фазу подщелачивают до рН .

9 гидроокисью натрия и экстрагируют хлористым метиленом.

Органическую фазу концентрируют, осаждают и перекристаллизовывают в виде соли фосфорной кислоты. Из фосфора получают свободное основание и егО дополнительно обогацают природными алкалоидами путем хроматографи рования на колонке с силикагелем.

Затем проводят отделение новых про- 40 дуктов от природных продуктов путем фракционной кристаллизации .

Концентрацию алкалоида определяют спектрофотометрически после подкрашивания реагентом Ван Урка, причем 45 расчет ведут при 550 нм.

Соотношение между природными и замещенными аминокислотами, присутствующими в пептидном фрагменте, определяют с помощью кислотного гидролиза алкалоида и количественным определением моноаминокислот.

Для идентификации конечных продуктов применяют обычные методы физикохимического анализа (ЯМР, ИК- и УФспектроскопия, масс-спектроМетрия и т. п.) .

Фенилаланинпотребляющие мутанты штаммов-продуцентов зргокристина или зрготамина могут производить алкалоиды, которые внедряются в фенилалани- 60 новый фрагмент молекулы фенилаланина, замещенной в бензольном кольце галогена, алкилами или алкоксилами. Они также могут производить алкалоиды, внедряясь в фенилаланиновый фрагмент Я его изоэфиров, таких как тиенилаланин, с . — и -пиразолилаланин, фурилаланин, пиридилаланин.

Лейцинпотребляющие мутанты штаммов-продуцентов эргокриптина могут . вырабатывать алкалоиды, которые внедряются в лейциновый фрагмент молекулы линейной А-аминокислоты, имеющей

2-7 атомов С. Они также могут производить алкалоиды, внедряясь "в фрагменты лейцина природных аминокислот, замещенных атомами галогена, например таких как 5,5,5-трифторлейцин.

Пример 1. 5 -Дибензил-5

-1-хлорбензилэргокристин.

Мицелиальную пленку 12-дневного скоса на твердой среде Ьер 3 (см. прилагаемую табл. 2) штамма ATCC 20103

С. purpurea продуцента эргокристина в погруженной культуре переносят в

50 мл дистиллированной стерильной воды и фрагментируют в смесителе Варинга в течение 20 с. Суспензию фильтруют через шелковую ткань и 5 мл фильтрата выдерживают на свету (520 мкВт/см )

УФ-лампы в течение 45 с. Обработанную суспензию после разбавления помещают на твердую среду ТМ (см. табл. 2), в которую дополнительно добавляют 1% фенилаланина, в чашки Петри. Чашки инкубируют при 28 С 10-12 дней. Раз— росшиеся колонии переносят xopoltlo известным способом посева на чашки ме тодом отпечатков на твердую среду ТМ в чашки Петри, и эти чашки инкубируют при 28 С в течение 10-12 дней.

В ходе сортировки 3000 колоний было обнаружено, что четыре штамма не способны расти на минимальнбм количестве среды ТМ. Эти штаммы подтверждают выделением в среде ТМ, а также в среде ТМ, в которую добавляют фенилаланин и два из них представляют собой мутанты, зависимые от фенилаланина.

Десять колб на 300 мл, каждая из которых содержит 50 мл среды TG (см. табл. 2), в которую добавляют 1 г/л фенилаланина, стерилизуют при 100 С в течение 30 мин и каждую из колб инокулируют мицелиальной пленкой, соответствующей прйблизительно 1 см среза твердой среды рер 3 штамма мутанта. Эти колбы инкубируют при 23 С

4 дня во врацающейся качалке, при скорости вращения 225 об/мин. Эти колбы соответствуют фазе вегетации.

Пятьдесят колб на 300 мл, каждая из которых содержит 40 мл среды Т25 (см. табл. 2), в которую добавляют

1 г/л 1-фенилаланина, стерилизуют при

105СС 25 мин,,инокулируют 5 мл вегетативной культуры и инкубируют при о

23 С в той же качалке, что использовали для фазы вегетации. Через 4 дня в колбы добавляют 4 г/л и-хлорфенилаланина.

735154

Через 10 дней йнкубирования культуры группируют, в результате чего получают около 2 л бульона, который содержит 700 мкг/мг"-пептидных алкалоидов. Их экстрагируют следующим об-. разом

Бульон культуры фильтруют, фильт рат отбрасывают, а мицелий. суспендируют в 5Ъ-ном водном растворе винной . кислоты. После тщательного встряхивания и фильтрации осадок экстрагируют еще два раза. Объединенные фильтраты .подщелачивают до рН 9 с помощью 20Ъ-, -ного раствора NaOH и экстрагируют несколько раз хлористым метиленом.

Органйческую фазу промывают водой, концентрируют и осаждают гексаном. Полученное такйм образом необработанное основание (0,9 г) обесцвечивают активированным углем, растворяют в

10 мл 95Ъ-ного этанола и добавляют .0,8 мл 75Ъ-ного раствора Н РО . Полу- 20 ченнйй раствор нагревают с обратным холодильником в темноте 30 мин и выдерживают при 3 С 5 дней.

В результате кристаллизуется фосфат (0,5 г), который содержит смесь 25 эргокристина (20Ъ) и 5 -дибензил.-5 -fl-хлорбензилэргокристина (80Ъ).. Иэ фосфата подцелачиванием получают необработанное -основание, экстрагйруют СН С0 и перекристаллизовыва1от" Иэ ацетона. Закристаллйэованный продукт

"хроматографируют йа колонке с силикагелем, используя в качестве элюанта смесь СНСРЗ и мЕтанола (исходное соотношение 99 : 1, конечное соотношение 90 : 10) ° После отбрасывания . фракций содержащих декстрозовращающие изомеры, выделяют фракцию, обо гащенную 5 -дибензил-5 -Л-хлорбензилэргокристином. Последовательной перекристаллизацией"из бензола, метанола„ 40 ацетона выделяют искбмый продукт (100.г). Кйслотный гидролиз пептидного фрагмента дает аминокислоты про.лин и п -хлорфенилаланин в соотношении 1 : 1. В результате щелочного . 45 гидролиза получают лизергиновую кислоту и 3,3-диметилпировиноградную кислоту.

Пример 2. ™ Мутанта,: полученный в результате обработки УФ- ,светом, согласно примеру 1 использу- . ют для Инокуляции 8 колб среды TG при тех же условиях, что описаны в примере 1. К концу фазы вегетации содержимое колб обЪединяют, в резуль-. тате чего получают 400 мл культурального бульона и его используют для ийокулирования 10-литрового- ферментера, — содержащего 6 л среды T25-, в которую добавляют 1Ъ фенилаланина. Щ

Ферментер снабжают мешалкой дискотурбинного типа, работающей при аэрации, соответствующей 0,5 л/мин и ско- . рости вращения 600 об/мин. 7еМПература инкубации, 23 С. Через четыре дня после начала Ферментации в культуру добавляют 4Ъ Ф-хлорфенилаланина, На 13-й день ферментации с бульона культуры снимают урожай.

Общее содержание пептидных алкалоидов соответствует 600 мкг/мл, 65Ъ из которых представляет собой 5 -дибензил-5 -H-хлорбензилэргокристин.

Экстракцию проводят по методике,:опи.санной в примере 1.

H p и м е р 3. Тот же штамм, что в примере 1, ферментируют в колбах при тех же условиях, что в примере 1, как на стадии вегетации, так и на стадии продуцирования, единственное отличие заключается в том, что на

° 4-й день ферментации добавляют п-фтор-. фенилаланин. На 14-й день ферментации экстракцией бульона получают

750 мкг/мг пептидных алкалоидов, причем 80Ъ из этого количества составляет 5 -дибензил-5 -0-фторбензилэргокристин.

Пример 4. Штамм ATCC 15383, продуцент эрготамина, обрабатывают

УФ-светом в условиях, описанных в примере 1. В результате обработки получают два фенилаланийзависимдх мутанта на 2000 подсчитанных колоний.

Одйн иэ этих штаммов используют в качестве прививочного материала, который добавляют в колбу ферментации при тех же"условиях, что описаны в прймере l, как во время вегетативной, .так и во время продуцентной фаз. На

4-й день продуктивной фазы добавляют

4Ъ п -хлорфенилаланина. На 14-й день из бульона получают. 900 мкг/мл пеп- тидных алкалоидов, причем 80% из этого количества составляет 5 -дибензил-5 -tl-.фторбензилэрготамин.

Пример 5. Штамм ОТСС 20019, продуцент эргокриптина, обрабатывают

УФ-светом, как описано в примере 1.

В результате обработки получают три . лейцинзависиьнх мутанта из 4000 подсчитанных колоний.

Один из этих штаммов ферментируют при условиях,и в среде, описанной в примере 1, причем единственное отличие заключается в том, что на фазах вегетации и продуцирования добавляют

1 г/л и 2 г/л L-лейцина, соответственно, На 4-й день фазы прбдуцирования добавляют 6 г/л L-норвалина. К

14-му дню бульоны содержат 1000 мкг/мл пептидных алкалоидов, причем 80Ъ иэ этого количества составляет 5-диизо-, бутил-5 -й=пропилэргокриптин.

Пример 6. Лейцинзависимый

:штамм, используемый в примере 5, ферментируют в колбах при тех же услови; ях, как на фазе вегетации, так и на фазе продуцирования, затем добавляют

3 г/л 5,5,5-трифторлейцина, на 4-й день фазы продуцирования rIa 14-й День ферментации бульоны объединяют и экстрагируют согласно общей методи735154 ке, описанной ранее. Общий выход пептидных алкалоидов составляет

600 мкг/мл при 60%-ном внедрейиги трифторлейцина.

T a блица 2 еде

Компонент

Т 25

100

Глюкоза

Сахароза.300

100

300

Ь-аспарагин х Н О

Безводная лимонная кислота

l5 КН РО4

Ng SOq 7Н О

Дроюкевой экстракт

0,5

0,5

0,5

0,5

0,3

0,5

0,5

0,3

-0,1

0,1

0,12

0,007

0,006

Кса

0,007 0,007

0,007

0,006

FeSOq 7H20

ZnSO4 7Н О

Пептон

0,006

0,006

Arap

4 NaOH

18 до РН 5,2 до РН 5,2 до рН 5,2

Водопроводная вода, MJI

До 1000

До 1000

Дистиллированная вода, мл

До 1000 До 1000

ОоС х 110аС х 110 C х 105"C х х 20 мин х 20 мин х 30 мин х g5 мин

Стерилизация

Формула изобретения

1. Способ получения алкалоидов спорыньи общей формулы

О

С0

NH --—, »

R2 СН2 Н2 1

R3 $ — г»г- 3 -c» j

Н где R г — метил, этил, изопропил,Предлагаемый способ позволяет получить новые алкалоиды спорыньи, обладающие фармакологической активностью. незамещенная линейная С>-С -алкильная группа, галогенэамещенная линейная С -С -алкильная группа, галогензамещенная бутильная группа, R> — С -С4-алкил, С,-С4-алкокси, галоген, и 9, 10-дигидропроиэводных, о т л ич аюцги и с я тем, чтоштамм

50 C 8avi ceps purpure a ATCC 15 3 8 3, Cdavicepa purpurea ATCC 20103 нли

С Сач1серз purpurea ATCC 20019, зависимые от негидроксилированных аминокислот, выращивают на питатель55 ной среде, содержащей в качестве предшественника негидроксилированную ами- нокислоту с последующим, выделением целевого продукта. бО 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю шийся тем, что в качестве негидроксилированной аминокислоты используют лейцин, фенилаланин; фе735154

" «нюхании, замещенный галогеном, алкилом, радикалом алкокси," тиенилом;

g-ïìðàýолил-, файл-, пйридилаланин; Составитель С. Малютина

Техред A.ùåïàíñêàÿ Корректор

М. Пожо

Тираж 673 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Редактор Е. Корина

}}В}}}}}}}ЮЬ4Ф} }}} }ь }} — ",:}}} . Заказ 2 10 8/5 7 линейные С -C - -аминокислоты или галогензамещенные натуральные аминокислоты.