Способ определения активности биопрепаратов

 

т .3

О Й И- С Л--Н И E

ИЗОБРЕТЕНИЯ (щ 675649

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 020276 (21) 2318963/28-13 (53) M. КЛ.

2 с присоединением заявки ¹

A 61 К 31/00 G N 33/16

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (23) Приоритет(53) УДК 615.5 (088. 8) Опубликовано 280280 Бюллетень № 8

Дата опубликования описания 280280 (72) Авторы изобретения

Б.С. Касавина и Т.В. Ухина

Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ .ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

БИОПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к области медицинской биохимии и предназначено для исследования действия биологически активных веществ на мембраны лизосом тканей.

Известен способ определения активности биопрепаратов при действии на лиэосомальную мембрану путем испытания их invivo u in vitro (ljОднако известный способ не обеспечивает высокой точности;

Целью изобретения является повышение точности способа.

Эта цвль достигается тем, что испытуемый препарат вводят с де- . 15 эоксикортикостероном, определяют активность лиэосомальных ферментов различных тканей и по изменению уровней этих ферментов определяют активность биопрепаратов; дезоксикор-20 тикостерон берут в концентрации

5-15 мг/кг.

Способ определения активности биопрепаратов осуществляют следующим образом. 25

Проводят исследование действия семнкарбозида и мезатона на склеру, роговицу и цилиарное тело.

В опытах in v(vO испытуемый препарат вводят кроликам-внутрнбрюшин- 30 но в дозе 15 мг/кг веса. Через lчас после введения препарата кролика забивают, выделяют склеру, роговицу, цилиарное тело и тщательно их очищают от подлежащих тканей. Измельченные ножницами ткани гомьгениэируют в сахароэной среде (0,25 М сахароза, приготовленная на трисНС1 буфере, рН 7,4, с добавлением

Ь,001 М ЭДТА). Гомогенизацию проводят в гомогенизаторе типа Поттера с тофлоновым пестиком при помощи микроиэйельчителя тканей PT-2 (склеf. ру гомогенизируют 6 мин, роговицу

15 мин, цилиарное тело 1 мин).

В опытах in чего выделенные ткани помещают на 1 ч в термостат (при

37 С) в сахарозной среде с добавлением испытуемого препарата в дозе 1 мг/мл.

Для получения субклеточных фракций гомогенаты центрифугируют при

900+ в течение 20 мин в центрифуге

К-24. Полученный недостаток центрифугируют при 6000ф в течение

30 мин. Осадок (фракция метохондрий) промывают и центрифугируют при

6000 q в течение 10 мин. Осадок регомогенизируют в сахарозной среде (первоначальном объеме). Объеди675649!

Фракция фермент (рМ/мин/г) Р-Глюкозидаза общая

О, 53+0, 01

0,16+0,01

0,15+0,04/16,7%

О, 154 0,01

0,90+0,03

0,30+0,01 свободная

%свободная общая

Р-Гелактоэидаэа свободная

100

30,2

33,3

0,15+0,03/6,2%

1,55+0,09/13,3%

1,30+0,01

6,85+0,08

2,4+0,03

11,7+0,1

Гиалуронидаза р -Глюкозидаэа общая

1,90+0,06

0,26+0,03

0,15+0,03/7,9%

0,14+0,01

О, 50+0, 02

0,12+0,01 свободная

24,0

13,7

%свобод на я общая

93,3

Pj Галактозидаза свободная

1,25+0, 03

5,80+0, 04

0,20+0,07/10,5%

0,80+0,05/8,4%

1,95+0,05

9,50+0,08

Гиалуронидаза

0,11+0,01

0,10+0,04 р-Глюкоэидаза общая

0,6+0,01

0,25+0,09

О, 34+0, 03

0,16+0,04 свободная

41,7

47, 04

0,58+0,02

6,9+1,7

%свободная общая

90,9

0,27+0,02

2,80+0,6 - Галактозидаэа

1,2+0,01

Гиалуронидаза — .,-3...

Р -Глюк о энда з а общая

20,1+10,5

0,92+0,03

0,30+0,01

0,1+0,01

0,1+0,01

О, 56 :О, 03

0,19+0,01 свободная

32,6

%свободная общая

34,9

100 р -Галактозидаза

" 2,3+0,04

1,3+0,02

0,3+0,02

1,2+0,45

12,1+0,08

7,7+0,1 -Гиалуронидаза

3 ненные недостаточные фракции центрифугйруют в течение 1 ч при 105000 в центрифуге AC-601. Супернатаит осторожно отбирают пастеровской пипеткой(фракция цитозоля) . Все описанные операции проводят на холоду (не выше 4ОС) . 5

В гомогенатах и субклеточных фракциях определяют свободную и об" щую активности гликозидаэ. Общую активность ферментов исследуют после полного разрушения субклеточных структур путем добавления в инкубационную среду доторгента-тритон-х-100.

Принцип метода определения активности лиэосомальных гликоэидаз основан на спектрофотометрическом исследова" нии количества образовавшегося продукта ферментативной реакции.

Активность )-галактозидаэы и

Р-глюкозидазы определяют по методу in ч1чо и in чМro В качестве субстрата для определения -галактозидазы используют р-нитрофенил-Д-галактопиранозид, а для Р-глюкозидазы — (-нитрофенил-Д-глюкопиранозид. Активность гиалуренидаэы дпРеделяют по методу 131э е . В качестве субстрата используют калиевую соль гиалуреновой кислоты. Активность ферментов выражают в микромблях расщепленного субстрата за

1 мин на 1 r белка. Количество белка определяют по методу 1,p rq.

В таблице приведены результаты определения активности гликоэидаэ в гомогенатах и субклеточных фракциях в норме и при воздействии на ткани глаза семикаобоэипом.

675649

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

-.Редактор Н; Белявская Техред Э.Чужик Корректор М, лароши

Заказ 10010/9 Тираж 673 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Y-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, Для оценки результатов исследования, например в цилиарном теле, подсчитывают процент отношения свободной активности р -глюкозида» эы к общей в митохондриальной фракции, содержащей большую часть лиэосом (по данным проведенной нами электронной микроскопии для.контроля эа чистотой фракции); также подсчитывают процент активности фермента в цитазоле от активности в гомогенате. В норме отношение свободной активности к общей составило 40,6%, а после. действия семикарбозида - -66,7%; процент выхода фермента в цитозель составлял в норме

6,7%, а после действия препарата увеличился до 9% (статистически достоверно) .

Следовательно, семикарбозид вызывает увеличение процента свободной активности от общей мембраносвяэанной Р-глюкозиданы в митохондриальной фракции и повышение выхода лизосомальных ферментов в цитозоль.

Эти данные свидетельствуют о. том, что семикарбозид уменьшает прочность связи fb-глюкозидаэы с мембраной, т. е. лабилйзирует мембраны лизосом цилиарного тела. Лабилизация лизосомальных мембран способствует выходу ферментов иэ лизосом и увеличению фермент-субстратного взаимодействия, что может привести к усилению распада мукополисахаридов ткани.

Однозначность результатов опытов с семикарбозидом in ЧИЧЧО и 1п QhtlO свидетельствует о том, что этот препарат действует непосредственно на мембраны лизосом, без промежуточ5

Предлагаемый способ обеспечивает возможность получения сведений о механизме действия веществ на мембра-, ны лизосом, высокую точность определения, а также позволяет подбор оптимальной дозировки и обоснования применения того или иного пре-парата.

1 ° Способ определения активности биопрепаратов при действии на лизосомальную мембрану путем испытания их in чиччо и iv ч го, о т—

20 л и ч а ю шийся тем, что, с целЬю повышения точности способа, испытуемый препарат вводят с дезоксикортикостероном, определяют активность лизосомальных ферментов различных тканей и по изменению уровней этих ферментов определяют активность биопрепаратов.

2. Способ по и. 1, о т л и,ч а юшийся тем, что дезоксикортикостерон берут в концентрации 530 15 мг/кг.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Вопросы медицинской химии., т. Хх1, вып. 3, с. 307, 1975.