Способ определения алкилрезорцинолов в зерне злаковых культур

 

Союз Советскмк.

Соцмалистн ческий

Реслублии

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН Ия

К АВТОРСКОМУ СВИДЮТВЛЬСТВУ (6l) ДОполнительиое к аат. свил-ву{22} Заявлено 22.02.77 (21) 2457794/30 15 с присоединением заявки № (23) Приоритет—

Опубликовано 05.04. 79.Бюллетен ь № 13

Дата опубликования описания 08.04.79

55967 и . Кл.

01 М 33/02

Гввударвтвввнвй «вивтвт

СССР вв двлам взвбрвтвавв в вткрипе

ДК 543.41 (088.8 ) (72) Автор изобретения

А. Ф. Сысоев

Всесоюзный ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени селекционнс -генетический институт (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛКИЛРЕЗОРЦИНОЛОВ

В ЗЕРНЕ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР

Изобретение относится к селекции на улучшение химического состава злаковых культур, s частности селекции ржи и тритикале, на пониженное содержание 5-алкилрезорцинолов, — антиметаболитов, понижающих кормовые достоинства зерна этих культур.

Известен флуорометрический способ определения алкилрезорцинолов, основанный на обработке 5-алкилрезорцинолов хлоро-, формом и 75%ной щелочью. Метод оказался

10 очень громоздким и вскоре был заменен автором на колориметрический способ, основанный на реакции азосочетания диазотированного п-нитроанилина (QHA) с фенольными гидроксилами резорцинового кольца алкилрезорцинолов (1).

Дальнейшее усовершенствование этот способ получил в работе Стучинского и сотрудников (21 °

Однако при этом способе необходимо тщательно измельчать зерно, а поскольку алкилрезорцинолы локализованы в наружных оболочках зерен, обладаю|пих большой эластичностью, достигнуть их тонкого измельчения очень трудно. Для этой цели служит специальный металлический стакан с металлическим шаром, в котором проводится экстрагирование алкилрезорцинолов при встряхивании на вибраторе, что усложняет их определение.

С целью предотвращения сравнителт но быстрой преципитации желтого диазо соединения (после добавления диазотированного п-нитроани лина), экстракт дополнительно разбавляют этанолом. В результате на один анализ расходуется

28 мл ацетона и 20 мл этанола.

Кроме того, для определения алкилрезорцинолов берется навеска муки, равная

500 мг. Между тем, для проведения отборов на ранних этапах селекции желатель но проводить определение в одной половинке зерна, оставляя вторую для посева.

11елью изобретения является повышение точности и упрощение анализа.

Для достижения указанной цели алкипрезорцинолы экстрагируют этанолом яз

655967 пия образующегося диаэосоединения, что приводит к падению цветности растворов.

В целях предупреждения образования . преципитатов реакцию диазосочетания рекомендуется вести в сильно разведе ных спиртовых растворах или при замене части спирта ацетоном.

Таблица1

Влияние и-бутанола на повышение стабильности окраски растворов азосоединения (экдтинкция в 4 мл раствора) Резорцинолы в 4мл, мкг

1:1

0,285

0,22 0,265

0,40 0,67

0,45 0,78

0,74

1,20

0,97 слабая преципитация; +сильная преципитация.

Способ определения алкилрезорцинолов (макромодификация} заключается в следующем.

0,5 r зерна переносят в сухую пробир» ку, добавляют 10 мл 95%-ного этанола (гидролизный высокой .чистоты), закрывают резиновой пробкой, обернутой. алюминиевой фольгой, отмечают уровень жидкос ти в пробирке восковым карандашом и погружают в водяную баню, нагревание о при 70 С ведут в течение ночи (15-18ч), Утром охлаждают до комнатной темпера-туры и доводят уровень жидкости до метки этанолом и тщательно встряхивают.

Затем из каждой пробирки берут по 0,5 мл экстракта и переносят в сухую пробирку, добавляют по 3 мл смеси этанол-бутанол о целого зерна при 70-72 С в течение

15-18 ч при соотношении масса зернамасса растворителя 1:20, затем .к 0,5 мл этанольного экстракта добавляют 3 мл смеси этаноп-бутанол, взятых в эквива лентном соотношении.

Повышение точности определения невозможно без предотвращения преципитации диазосоединения.

Реакция азосочетания диазотированногс и-нитроанилина с резорцинолами имеет свои особенности. В среде этанола при малых концентрациях резорцинолов реакция идет медленнее, чем при повышенных. В последнем случае уже через

15-20 мин после добавления ДНЛ цветность раствора достигает максимума в то время, как при малых концентрациях для этого требуется 60 мин и более.

Кроме того, при концентрациях алкилре20 зорцинолов, превышающих 100 мкг %, в среде этанола развивается преципитаПриведенная проверка антикоагуляционных особенностей ацетона показала, что он мало отличается по этим свойствам от этанола, Более подходящим оказалось добавление н-бутанола.

Смесь этанол-бутанол в соотношении 1:1 предотвращает образование преципитатов азосоединения при концентрации алкилрезорцинолов, превышающей

300 мкг % (табл. 1). При расчете на сухой вес зерна это составляет 500 мг/кг, что превосходит максимальное содержание алкилрезорцинолов у наиболее богатой ими культуре - ржи. в соотношении 1 .1 и цо 0,5 мл раствора диазотированного п-нитроанилина, перемешивают и оставляют при комнатной температуре, Колориметрирование желтого раствора проводят через 1,5-2 ч при

435 нм.

В ряде работ по ржи, а также по тритикале была установлена обратная корреляция между массой зерновок и содержанием в них алкилрезорцинолов. При рекомендуемой малой навеске зерна (0,5 г) это может сказываться на точности анализов. Для снижения величины погрешности следует из каждого образца брать по две параллельных навески, либо среднюю пробу составлять из разло655967

6 же пых в ряд (по убываюшей величине) зерен.

Приготовление раствора диазотированного и-нитроанилина. Отвешивают на аналитических весах 60 мг п-нитроанилина и переносят в пробирку, добавщпот 0,75 мл концентрированной ПС8, смесь подогре» вают до полного растворения п-нитроанилкна. После остывания добавляют 7,25 мл воды.

IO

В конической колбе па 200 мл раство ряют 100 мг азотистокислого натрия (Йа М 0 } в 10 мл воды.

К охлажденному на льду раствору

NaNO в 200 мл колбе лобавлжлт по квп

15 лвм в течение 20 мии) также охлажо джшый до +3.-3 С раствор п-нитроанилина в HCS. Bo время этой операции колба с раствором Йс(ЙС все время держится

20 на льду и встряхивается. После окончания прибавления колбу с диазотированным и-нитроанилинсм оставляютнальду 30 мин,, после чего к содержимому. добавляют.

182 мп охлажденной воды. Раствор хранят в холодильнике.

Пересчет показаний экстинкции (в мкг) алкилрезорцинолов производят по калибровочной кривой, построенной по орцину (метилрезорцин). Растворяют

100 мкг орцина в 10 мл спирта. В пробирки берут 0,1:, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 мл раствора орцина доводят до 0,5 мл сгпртом, прибавляют по 3 мл смеси этанопбутапол (1:1) и 0,5 мл диазотиро-. ванного и-нитроани лина. Колориметрируют через 1,5-2 ч при 435 нм.

Микроспособ определения алкилрезорПИНОЛОВ. ДЛЯ ОЦЕНКИ СЕЛЕКШЮПНОГО Материала на ранних этапах селекций на 40 содержание алкилрезорцинолов, желательно определять их количество в половинке зерна, оставляя другую половинку для посева

Важным является вопрос О том, рав- 4 номерно ли распределение алкилрезорпинолов в разных частях зерна. Для этого каждое зерно было рассечено на две поЛОВИНКИ И ЗатЕМ В ПИХ ОПРЕДЕЛЯЛОСЬ СО держание резорпинолов. И

Полученные данные (среднее из 10 зерен) приведены в табл. 2.

Т аблица2

Т

С

Следовательно, по содержанию алкипрезорцинолов шитковая и хохолковая части зерна различаются мало и определение в хохолковой части может дать достоверные сведения по содержыппо их в целом зерне.

Каждое зерно рассекают ножом на две половинки. Хохолковую часть взвешивают на торсионных весах и переносят в пробирку, а шитковую наклеивают на лист бумаги при помощи бумажной пластинки и нумеруют. В пробирку добавляют

3,5 мл смеси этанол-бутанол (1 1) и закрывают резиновой пробкой, покрытой алюмщшевой фольгой, отмечают уровень жидкосги восковым карандашом и погружают в водную баню при температуре о

70 -72 С на 5 ч. Через каждый ч на; грева пробирки слегка взбалтывают. После этого приборки охлаждают до комнатной температуры, дОВОдят уровень жидкости до метки. К содержимому пробирок добавляют по 0,5 мл раствора диазотированного п-нитроанилина, взбалтывают и

Оставляют стоять на 1,5-2 ч, после чего колориметриру1от при 435 нм.

После перевода показаний экстинкдии в мкг алкилрезорпинолов с помощью калибровочной кривой (таблипы), рассчитывают их содержание в мг/кг зерна, пользуясь правилом пропорции.

Данные о содержании . 5-алкилрезорцинолов в зерне некоторых злаковых культур, полученные предлагаемым способом в сравнении с известным приведены в табл. 3. р « а р н,,Р 7

655967

Таблица3

Содержание 5- алкилрезорцинолов в зерне ржи, пшеницы и тритикале

5-алкилрезорцинолы, мг/кг (абс. сух. вещество) Известный способ колеба лебани

338 326-441 370

323-353

141-164

Рожь

Пшеница

134-1 94 1 77

152

TpBTHKBB -. октаплоидные гексаплоидные

190-309

1 11-373

248

239

192-288 229

Тритикале - микро метод

115-358

228

Сосгавитель В. Квашнин

Редактор Н. Тн!нонн!!а Текред К. Гаврон Корректор П. Веоеновокан

Закан 1807/84 Таран 1080 Подданное

UHHH ПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород» ул. Проектная, 4

TQKHM обцазом, при определении содержания алкилрезорцинолов в целых семенах, как макро- так- и микромодификаЗО цией получены данными, сходные с известными.

Формула изобретения

1. Способ определения алкилрезорцинолов в зерне знаковых культур, включающий экстракцию этанолом, азосочетайие с диазотированным и-нитроанилином и фотомвтрирование окрашенного раствора, о.т и и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения анализа, алкнлрезорцинолы экстрагиуют эта-. нолом из целогозерна при 70-72 С в тече ние 15-18 ч при соотношении масса зернамасса растворителя 1:20, затем к 0,5 мл ,этанольного экстракта добавляют 3 мл смеси этанол-бутанол, взятых в эквивао лентном соотношении.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юm и и с я тем, что алкилрезорцинолы экстрагируют из половины зерна при о

70-72 С в течение 5 ч 3,5 мл смеси этанол-бутанол, взятых в эквивалентном соотношении.

Источники информации„принятые во внимание при экспертизе

1мйег1пда G% .-on Ме оссцггепсе о gðо СИ inhibiting бобвСадсез югуе.

institute foI Storage and Ргссеь|1щ о1 адгисц И.цгаб ргоЗцсе, иауещп хеп, publication и (56,1967.

2. Gtuczsnski Е., Тассо Ьоч вМ s., Stuczsnska T.-ÝåÑåI-ãïinàtion pf ойсМгеьогс1поЮэ coIntent indexes 1И pwe р а а. НодожСа говГлп,а1сбтаС ыс а

naaennICtwO,1974, С.18, л 04,287-3О1.