Способ определения активности транскетолазы

г

О Й- И-"-С А-Н И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Севетеких

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. сеид-ву— (22) Заявлено 27.01.77 (2!) 2447674/23-15 с присоединением заявки РЙ(23) Приорнтет— (43) Опубликовано 251078. Бюллетень РЙ 39 (45) Дата опубликования описания1909,78 (51) М. Кл.

G01 N 31/14

Государственный комитет

Совета Министров СССР

Ао делам и юбретений и открытий (5З) УДК543.866 (088.8) (72) Автор изобретения

Ю.Г.Курило

Полтавский научно-исследовательский институт свиноводства (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ТРАНСКЕТОЛАЗЫ

25

Изобретение относится к методам исследований, а именно к определению активности ферментов в билогических субстратах, в частности сперме хряков.

Известен способ определения активности транскетолазы в сыворотке крови по Ф.Брунса, основанный на образовании седогептулозо-7-фосфата (11 .

В инкубационной среде, состоящей из 0,5 мл 0,1 М трис. HCt буфера и

0,01 М раствора рибозо-5-фосфата (рН 7,6) добавляют 1 мл сыворотки крови и инкубируют при 37 С в течение 2-4 час. Конечный объем инкубационной смеси 1,5 мл. Прекращают реакцию добавлением 1,5 мл 10%-ной трихлоруксусной кислоты. В трихлоруксусном фильтрате определяют гептулозу, по количеству которой судят об активности транскетолазы, для чего к 1 мл фильтрата добавляют 0,2 мл концентрированной НС1 в пробирках с притертой пробкой, подогревают в кипящей водяной бане в течение 80 мин

После охлаждения к смеси добавляют

0,2 мл раствора рвах (13 мг Fece> в

100 мл 2 м HCt) и 0,075 мл 6%-ного раствора орцина в метиловом спирте.

Тщательно перемешивают и повторно подогревают в течение 3 мин в кипящей бане. После охлаждения добавляют

1,475 мл этилового спирта, образуется синее окрашиванне при максимальном поглощении 625 мкм.

Определение активности транскетолазы этим мотодом требует использования метилового спирта, который является особо токсичным, кроме того, для. приготовления стандарта гептулозы не всегда имеется в наличии этот сахар.

Этот метод недостаточно точный, так как часть гептулозо-7-фосфата под влиянием фермента трансальдолазы превращается в фруктозо-6-фосфат и зритрозо-4-фосфат, что ведет к потере гептулозофосфата.

Целью изобретения является повьые- ние точности анализа.

Это достигается тем, что перед добавлением исследуемого материала s реакционную смесь вносят гидразинсульфат для связывания фосфотрноз и ингибирования трансальдолазы и хлористый магния для активирования транскетолазы.

Способ осуществляют следующим образом.

629500

Формула изобретения

Составитель A.Ìàêàðîâ

Техред 3.Фанта Корректор Л. Веселовская

Редактор Д.Пинчук

Эакаэ 6062/40 Тираж 1112 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, г.Ужгород, ул. Проектная, 4

К инкубационной среде, состоящей иэ раствора трис. HCi буфера (рН-7,6)

0,1N — 0,5 мл,гидразинсульфата 0,16М0,25 мл, хлористого магния 0,1 M—

0,02 мл натриевой соли рибозо-5-фосфата 0,03 М вЂ” 0,25 мл добавляют исследуемый материал в количестве 1 мл; инкубируют в водяной бане при 37 С в течение 2 час. В контрольные пробы перед добавлением исследуемого материала вносят 2 мп 10%-ной трихлоруксусной кислоты, в опытные пробы кислоту вносят после инкубации. Через

30 мин пробы фильтруют.

При определении активности транскетолаэы.по образованию фосфотриоз к

1 мл фильтрата добавляют 1 мл 0,75 н. раствора NaOH, оставляют на 10 мин при комнатной температуре, добавляют

1 мл 2,4-динитрофенилгидразина и подогревают на водяной бане при 38 С в течение 10 мин. Доводят объем про-. бы 0,75 н. раствором NaOH до 6 и 8 мп и колориметрируют при 540 ммк (зеленый светофильтр). Стабильная окраска сохраняется на протяжении 15 мин.

Активность транскетолазы в сперме хряка можно определять и по приросту гептулозы или по убыли в инкубационной среде пентоз.

В центрифужные пробирки к 0,5

1,0 мл трихлоруксусного фильтрата добавляют равный объем орцинового реактива (1%-ный раствор орцина,приготовленного на 0,1%-ном растворе хлорного железа) в концентрированной соляной кислоте НСЙ. Закрывают.воздушными холодильниками и кипятят в водяной бане 40 мин. После охлаждения разбавляют дистиллированной водой до 6 мл и центрируют на протяжении 10 мин при 4000 об/мин. Аккуратно сливают на достаточную жидкость и в ней определяют концентрацию пентоз. .при 660 ммк. Осадок растворяют в 3 мл или больше этилового спирта. Появляется сине-зеленый цвет с максимальным поглощением 640 ммк. B обоих случаях стабильная окраска сохраняется продолжительное время. Имея стандартный раствор гептулозы или рибозы по пропорции или калибровочному графику, можно высчитать количество убыли пентоэ или прирост гептулозы,по которым можно судить об активности транскетолаэы.

10 При отсутствии химических чистых фосфотриоз можно испольэовать щелочно-лабильный фосфат из фосфотриоз, образовавшихся в ходе форментативной реакции.

)6 Применение предложенного способа позволит с большой точностью определить активность транскетолаэы без применения метилового спирта.

Способ определения активности транскетолазы,преимущественно в сперме хряков, включающий введение иссле,.дуемого материала в реакционную смесь, содержащую трис. HCЙ буфер, натриевую соль, рибозо-5-фосфат с последующим инкубированием, добавление раствора трихлоруксусной кислоты для прекращения реакции и определение активности по количеству образовавшихся

Фосфотриоз или гептулоэ или по убыли пентоз, отличающийся тем, что, с целью повышения точности анализа, перед добавлением исследуемого.

35 материала в реакционную смесь вносят гидразинсульфат в виде 0,16 М раствора в количестве 0,25 мл и хлористый магний в виде 0,1 М раствора в количестве 0,02 мл.

40 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1.Вагапа F.,В4осЬем,geitscбгift 330, 1958, 4.497,