Реактив для определения фосфатаз
ГОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
02> 444376
Соо CooeTокнх т;оциеРиотичеок22х реооублик (61) 3ав22сю2ь222 от патента (22) Заявлено 14.11.67 (2! ) 1197398/23-4 (51) М. Кл. С 12k 1/04
G 01п 33/16
G 01п 31/14 (32) Приоритет 14.!1.66 (31) 593740
31.03.67 627430 (33) CILIA
1ооудароте.:.Кньй комнтет
СоВоТо Ьi- .-lHI- .oTI2оз CCCP па де22ем азооретеннй
OTN 2bITi221
Опубликовано 25.09.74. Бюллетень № 35 (53) УДК 577.153.082:
:543.866-41 (088.8) Дата опубликования описания 24.09.75 (72) Авторы изоо ретения
Иностранцы
Даниель Гарольд Дойч, Джон Дуглас Муррей, Стенли Эдвард Грин, Эдвард Вабе Салеби и Богдан Мирослав Стесив (США) Иностранная фирма
«Смит Клайн энд Френч Лабораториз» (США) (71) Заявитель (54) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФАТАЗ
Предлагается реактив для обнгруткепи . и количественного определения щелочнь2х и кислотных фосфатаз в биологических жидкостях, например в сыворотке.
Известен реактив для анализа фосфатаз, который включаег субстрат — двунатр2тсву2о соль и-нитрофенилфосфорной кислоты, сухой буфер для поддержания рН 4 — 11 и активатор — соль магния. Эта соль в сухом состоянии нестабильна и получение ее затруднено.
Кроме того, чувствительность известного реактива недостаточна, особенно при определении щелочных фосфатаз.
С целью повышения стабильности реактива и чувствительности анализа, предлагается реактив, в который в качестве субстрата введена аминная соль п-нитрофенилфосфорной кислоты. Келатель22о в качествс суострата использовать соль трис- (оксиметил) аминометана и и-нитрофенилфосфорной кислоты- .ил: соль дициклогексиламина и и-нитрофенилфосфорной кислоты. Целесообразно также в состав реактива добавлять маннит.
Сухой порошкообразный реактив содерокит аминную соль и-нитрофенилфосфорной кислоты, буфер (карбонат щелочного металла, например карбонат натрия и бикарбонат натрия), металлсодержащий активатор, предпочтительно глютамат магния или магниевую соль аспаргиновой кислоты, и ма222222т.
Обычно в зависимости от того, какую фосфатазу определяют, кислую пли щелочную, рН
5 поддерживают в пределах 4 — 11, соответствующим образом выбирая один пли несколько известных буфсров.
В сухом виде этот порошок стабилен и может долго сохраняться. Он может быть разде10 лен на отдельные небольшие порции для образования водного раствора, пригодного для проведения одного анализа сыворотки. Каждую из этих порций можно затем расфасовывать в виде таблеток или капсул.
15 Указанные субстраты в сухом виде более стабильны, чем двунатриевая соль и.-нитрофенплфосфорной кислоты. Маннит также увеличивает стабильность субстрата. Кроме того, он активен в энзиматической реакции. Количество
20 добавляемого маннита можно изменять в широких пределах, так как положительное влияние маннита прпблизительно пропорционально его количеству. Верх2222м пределом, по-видимому, является растворимость этого инди25 видуального вещества в воде при температуре проведения испытания, т. е. около 37 С, Точными экспериментами было установлено, что заметные результаты можно получить при концентрации дооавки несколько миллиграм30 мо в на 1 мл растворенного в воде аналитиче444376
Пример 1. Определение активности солей п-нитрофенилфосфорной кислоты (п-НФФК).
Компоненты реактива.
Буфер (рН 10,2). Растворяют 8 г Ха СОа
5 2 г NaHCO3 и 300 мг глютамата магния в
1 л воды.
Анормальная клиническая химическая контрольная сыворотка Хиланда, 0,03 М растворы ами нных солей п-НФФК.
Ip 0,03 М раств(зр двунатриевой соли п-НФФК (в качестве контрольного) .
Расчет.
Скорость реакции аминной соли п-НФФК, о/о.
ЛА4ОБ/мин (амин) ><100
15 ЬА4оь/мин (1 1аа) Свободный п-нитрофенол (вес. %) определяют при 405 ммк.
Свободный и-нитрофенол =
20 А4щ (для Пробы)
А4О, (для стандарта) В табл. 1 приведена энзиматическая активность аминных солей.
Таблица 1
Свободный п-нитрофенол, вес. о"
Соль
Скорость,, Динатрий л-НФФ
Динатрий л-НФФ
Метиламин и-НФФ
Диметил амин л-НФФ
Триметиламин п-НФФ
Моноэтаноламин и-НФФ
Морфолин п-НФФ
Монобензиламин и-НФФ
Фурфуриламин п-НФФ
Анилин п- НФФ трис-(Оксиметил) аминометан л-НФФ трис-(Оксиметил) аминометан п-НФФ (сухой)
Дициклогексиламин п-НФФ полного растворения, то твердый осадок удаляют).
В кювету отбирают пипеткой 0,05 мл образца и добавляют 2,5 мл буферного раствора (рН 10,2). Определяют светопоглощение при
30 405 ммк на любом подходящем спектрофотомегре.
Расчет.
Свободный п-нитрофенол (вес. ) =
= А4сэК0,228.
В табл. 2 приведены результаты определения свободного п-нитрофенола после обработки реагента фосфатазой, ского реактива. Пределы конструкции маннита составляют 25 — 180 мг на 1 мл разбавленного водой реактива.
Реактив можно растворять в стандартном количестве воды и смешивать затем его с биологической пробой для проведения энзиматической реакции. Количество субстрата, содержащегося в реактиве, должно быть достаточным для того, чтобы реакция происходила с постоянной скоростью. В результате определяют количество или величину активности неизвестного фермента.
Аминные соли п-нитрофенилфосфорной кислоты (n-НФФ) могут быть получены реакцией соответствующего амина с солью щелочного металла и-нитрофенилф о сфо1рной кислоты. Эти соли могут быть осаждены концентрированием или же добавлением органического растворителя. Кроме того, свободную п-нитрофенилфосфорную кислоту можно нейтрализовать соответствующим амином в растворе и осадить соль добавлением органического растворителя или упариванием до начала кристаллизации, затем соль отделяют, промывают и сушат.
* Перед добавлением сыворотки.
Определение образования п-нитрофенола из солей п-НФФК при различных внешних условиях.
Методика. Взвешивают 3 пробы каждой соли по 100 мг. Помещают первую пробу каждой соли п-НФФК в сухой эисикатор, кладут вторую пробу в эксикатор с насыщенным раствором сульфата аммония для выдерживания ее при постоянной влажности, третью пробу выдерживают при комнатных условиях.
Выдерживают все образцы в этих условиях по крайней мере в течение 48 час. Растворяют каждую пробу в 5 мл воды (свободный п-нитрофенол растворяется в 5 мл воды, если нет
104
107
I05
84
98
86
66
96
91
81
104
0,04
0,07
0,08
0,09
0,10
0,05
0,12
0,06
0,04
0,04
0,03
0,04
0,04
444376
Таблица 2
Свободный п-нитрофенол, вес.
Опыт
Соль
1 (комнатные условия) 2 (сухой) 3 (влажный) холостой
Динатрий и-НФФ
Этиламин и-НФФ
0,010
0,009
0,014
0,006
0,004
0,007
0,016
0,035
0,010
0,016
0,005
Метиламин и-НФФ
Диметиламин и-НФФ
Триметиламин и-НФФ
Моноэтаноламин и-НФФ
0,04
Не анализировали
0,007
0,04
0,04
0,02
0,03
0,03 о Растворим не полностью.
Пример 2. Методика определения щелочной фосфатазы.
Реактивы.
Раствор A. В 100 мл дистиллированной воды растворяют следующие вещества, мг:
Na CO3 850
NaHCO3 250
Магниевая соль аспарагиновой кислоты 50
Ди- (циклогексиламмонийная) соль п-НФФ 315
Б (концентрация маннита в реатенте равна
0 мг/мл).
Реагент 3: 2 мл раствора А+1 мл раствора
Б (концентрация маннита в реагенте равна
5 33 мг/мл).
Реагент 4: 0 мл раствора А+3 мл раствора
Б (концентрация манннта в реагенте равна
100 мг/мл).
Реагенты помещают в кюветы, выдержива10 ют в течение 10 мин при 37 С, после чего определяют и записывают оптическую плотность при 415 ммк.
Энзиматическую реакцию инициируют добавлением 20 Х анормальной сыворотки Хи15 ланда (серийный номер 368А16 ) ..
Показания снимают спустя 10 мин после того, как реагент смешали с сывороткой (А о) и через 15 мин (А а). Результаты приведены в табл. 3.
Раствор Б. В 10 мл свежеприготовленного раствора растворяют 1000 мг маннита.
Растворы А и Б смешивают вместе для получения четырех аналитических реагентов, как описано ниже.
Реагент 1: 3 мл дистиллированной воды.
Реагент 2: 3 мл раствора А+О мл раствора
Таб липа 3
Увеличение скорости по сравнению с опытом 2, Опыт
Ао
Вычислено
А!0
Ь, мин
0,051
0,051
0,051
279
473
0,480
0,560
0,652
0,033
0,042
0,056
0,645
0,772
0,932
27
Морфолин и-Нфф
МонЬбензиламин и-Нфф+
Фурфуриламин и-НФФ+
Анилин и-НФФ трис-(Оксиметил) аминометан и-Нфф трис-(Оксиметил) аминометан и-НФФ (сухой)
Циклогексиламин и-Нфф*
0,04
0,07
0,09
0,07
0,15
0,05
0,13
0,06
0,04
0,05
0,02
0,28
0,07
0,10
О,ll
0,14
0,04
0,11
0,05
0,04
0,04
0,02
0,04
0,07
0,09
0,20
0,11
0,05
0,15
0,05
0,04
0,04
0,02
444376
Таким образом, В оптической кювете растворяют одну таблетку (или капсулу), содержащую указанные ингредиенты, в 3,0 мл воды, добавляют 20 i. анализируемого образца сыворотки. Как только реагент и образец перемешаются, происходит следующая реакция: рН 8 — 10 (буфер)
Лминная соль+ Щелочная
-+и-НФФ фосфатаза
А1; — А!е
5 (мин) рн 8 — 10 (буфер) — — — -- - Нитрофенол+ Соль фосфорной кислоты.
Кювету выдерживают при 37 С и измеряют
15 скорость изменения оптической плотности в течение 10 мин. 1ак как это — скорость реакции, температура и определяемые интервалы должны быть точно соблюдены. общий объем 1000
17,7 .ил сыворотки
A4„ s!MK (при 5 >AH) 20
5 мин
1. Реактив для определения фосфатаз,включающий субстрат — соль и-нитрофенилфосфорной кислоты, — сухой буфер для поддержания рН 4 — 11 и активатор — соль магния, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения стабильности реактива и чувствительности анализа, в качестве субстрата использована
30 аминная соль и-нитрофенилфосфорной кислоты.
2. Реактив по п. 1, отл и ч а ю щи и с я тем, что в качестве субстрата применена соль трис(оксиметил) аминометана и п-нитрофенилфосфорной кислоты.
3. Реактив по п. 1, отл и ч а ю щи йс я тем, что в качестве субстрата использована соль дициклогексиламина и п-"гIитрофейилфосфорПОЙ K)I CJIOTbI.
40 4. Реактив по п. 1, отличающийся тем, что в его состав введен маннит. б00
250
Приоритет 14.11.бб установлен по пп. 1, 2 и 3; приоритет 31.03.б7 — по п. 4, Составитель С. Зуммеров
Тскрсд Т. Курилко
Корректор Е, Рогайлина
Редактор О. Кузнецова
Заказ 2599 1 Изд . о 575
ЦНИИПИ Государственного комитета по делам изобретений и
Москва, )К-35, Раушская
Типография, пр. Сапунова, 2
") Эту серию сыворотки предварительно калибруют хорошо известными методами для определения соответствующего числа Ме кдупародных единиц (М. Е.) следующим образом.
Оптическая плотность раствора и-нитрофепола с концентрацией 1 мкмоль/мл равна 17,7.
А418 — оптическая плотность при длине ьолны
41. ммк.
М. Е./л сыворотки = ЬА„, ммк ><
А„, ммк (при 10 мин) ммк мин:
5 мин
Общий объем = 3,0 мл.
Количество сыворотки =0,020 мл (201).
Расчет.
М.Е./л сыворотки =- ЛА„, ммк/мин ><
3,0 1000
17,7 0,020
М. Е./л сыворотки — 8450.
Для изготовления реактива сухие ингредиенты смешивают и смесь таблетируют или капсулируют известными методами. Состав таблетки реактива для 3 мл щелочной фосфатазы:
ХагСОз, мл 850
Магниевая соль аспарагиновой кислоты, мг 50 трис- (Оксиметил) аминометан п-НФФ, мг
Маннит, мг
Карбовакс 4000, мг
Предмет изобретения
Тираж 474 Поди!! с нос
Совета Министров СССР открытий наб., д. 4/5
