Патент ссср 390727

 

Весе юеееае еетент4Ь- тее ее м ееевеев

C юнее МфА

ОП ИСАН И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимый от патента №

М. Кл. С 12d 7/00

Заявлено 20.1Х.1971 (№ 1703785/30-15) Приоритет 21.!Х.1970, № 82733/70, Япония

Государственный комитет

Совета Министров СССР во делам изобретений и открытий

УДК 63:576.8(088.8) Опубликовано 11.VII.19?3. Бюллетень № 30

Дата опубликования описания 29.Х!.1973

Авторы изобретсния

Иностранцы

Сусуми Юцуми и Тосио Каназава (Япония) Иностранная фирма

«Сумитомо Кемикал Компани, Лимитед» (Япония) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОБНОГО ИНСЕКТИЦИДА

Изобретение относится к области защиты возделываемых растений от насекомых-вредителей микробиологическим путем, более конкретно к микробиологическим способам получения инсектицидных веществ.

Уже известен способ получения микробиологических препаратов, содержащих микроорганизмы, относящиеся к виду Bacillus thuringiensis, для борьбы с вредными насекомыми сада, огорода и леса, основанный на том, что протеиновые кристаллы-токсины, образующиеся в клетках спор этих микроорганизмов, проявляют высокую токсичность по отношению к личинкам насекомых. Гамма-эндотоксины вызывают отравление, приводящее к гибели насекомых.

Известные препараты оказывают аналогичное инсектицидное действие и на тутового шелкопряда. Кроме того, действие препарата продолжается и после опрыскивания, так как в телах убитых токсинами насекомых из-за образования спор возникает вторичная инфекция, которая переносится на другие индивидуумы, в частности на тутового шелкопряда, ветром, дождем, движением животных и насекомbIx.

Предлагается способ получения микробного инсектицида, включающей культивирование

Вас. thuringiensis в жидкой питательной среде, выделение спнор и токсинов посредством центрифугирования и высушивание, при котором с целью исключения вторичной инфекции споры лишают способности к размножению, сохраняя их инсектицидную активность. Для этого культуральную жи IKQcrb обрабатывают в период минимального образования токсинов перекисью водорода, р-пропилактоном нли

10 ультразвуком.

В период минимального образования токсинов культивирование прерывают и к культуральной жидкости добавляют перекись водорода из расчета 0,5 — 5,0 вес.o, p-пропилактон

15 берут из расчета 0,25 вес. Воздействие ультразвуком проводят из расчета 20 килоциклов в течение 20 мин.

Пример. Микроорганизм, относящийся к виду Bac. thuringiensis, выделяют из мертвых

20 насекомых и культивируют, а затем отбирают наиболее токсичные штаммы.

В пробирку загружают 10 мл среды, состоящей из 1 мл дистиллированной воды, 10 г пептона, 1О г мясного экстракта и 3 г хлористого

25 натрия и доводят рН до 7,2. После стерилиза ции среду инокулируют отобранными штам. мами. Культнв; рованпе проводят прп взбалтывании в течение 72 час. Споры и гамма-ток390727

Таблица 1

Число убитых насекомых, штук, через время, час

Штамм

Bacillus

thuringtensis

2 9 24 72

12

О

7

О

Sotto (контроль)

А

В

С

Е

G

20

О

20

О

1

О

13

6

12

Таблица 3

К о д

И д

Й одо

Й v о д о

И

=Год

Число убитых насекомых через время, час

Таблица 2

Насекомое

Способность размножаться спор штаммов*

Степень стабилизации гамма-токсинов" ".

Концентрация перекиси водорода, вес. 0, 45

30 50 (%) 24

А Е

Гусеница сосновая

Капустный червь

Рисовый червь

12 (100)

О (100)

О (100) 5

2

0,75

0,50

0,25

0,125

0,065

17

|

++

++

++

++

50!

+ сины собирают путем центр ифугирования (15 С, 7000 об/мин, 10 мин) и промывают дистиллированной водой, после чего снова центрифугируют (5 С, 7000 об/мин, 10 мин) и высушивают в вакууме с сохранением способности их к размножению.

Сухие вещества разбавляют водой до концентрации 2 вес.% и после персмсшивания распыляют на тутовые листья, которые скар гливают двадцати шелкопрядам второго дня второго возраста для определения вирулентности штамма.

Полученные результаты даны в табл. 1.

П р и м е ч а н и е. Общее число подопытных насекомых каждого штамма — 20.

Из данных табл. 1 видно, что самые сильные по вирулентности штаммы — А, Е, F. Эти штаммы выращивают в стерильной среде (500 мл при 27 С в течение 96 час) состава, г/л: 5 КН Р04, 5 К НРО», 0,0002 хлористоводородного тиамина, 0,5 MgSO4, 0,3 МпЯО», 0,01 FeSO», 0,05 СаС1,, 1,5 Na — NH»PO», 3 цитрата натрия и 10 Casamio acid.

После подтверждения с помощью фазо-контрастного микроскопа, что образовалось до— обозначает уничтожена, -+- обозначает уцелела.

+ эффективность токсинов слегка уменьшена по сравнению с необработанной культуральной жидкостью;

-+--1- эффективность токсинов такая же, как у необработанной жидкости.

35 статочно кристаллических токсинов, культивирование прекращают и культуральную жидкосгь подвергают обработке для лишения спор спосзбности к размножению. B качестве обр :батывающсго агента добавляют перекись ьодорода из расчета 0,065; 0,125; 0,25; 0,5;

О,i 5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0, вес.%. Через 24 час берут

1 мл обработанной культуральной жидкости и инокулируют 10 мл стерильной среды. Полученные результаты даны в табл, 2, из которой ьидно, что при добавлении к культуральной жидкости 0,5 вес. % перекиси водорода живых спор не наблюдалось.

Так как после добавления 0,5% или более перекиси водорода выживших спор не наблюдают совсем, то каждый штамм подвергают обработке перекисью водорода из расчета

0,5 вес. для лишения способности спор к размножению, споры собирают путем центрифугирования (5 С, 7000 об/мин, 30 мин) несколько раз промывают дистиллированной водой, высушивают под уменьшенным давлением для получения сухих веществ. Затем готовят 2%-ный препарат и равномерно наносят его на тутовые листья, которые скармливают четырем шелкопрядам. Результат подтверждает, что обработанный препарат может полностью убивать тутового шелкопряда за 2—

3 час и что токсины в клетках в активном состоянии. Такие же результаты получают с препаратами, обработанными Р-пропилактоном, взятым из расчета 0,25 вес.% или ультразвуком из расчета 20 кплоциклов в течение

20 мин.

Проводят опыты по определению инсектицидной активности препарата, полученного из штамма (табл. 1) вышеуказанным путем, на вредных насекомых. Полученные результаты приведены в табл, 3.

Из табл. 3 видно, что микробный инсектицид, полученный путем лишения микроорганизма способности размножаться, обладает инсектицидным действием для вредных насекомых. Кроме того, микробный инсектицид не вызывает вторичной инфекции и поэтому не оказывают вредного действия на тутового шелкопряда.

Указанные сухие клетки вводят внутрь мышам в дозах 3 г на 1 кг веса, отравления или нарушения физиологических отправлений не происходит.

390727

Предмет изобретения

Составитель С. Скрябина

Техред Л. Грачева

Корректор А. Васильева

Редактор Е. Хорина

Заказ 3060,, 15 Изд. № 1753 Тираж 467 Подписное

1ЯНИИПИ Государственного комитета Совста Министров СССР по делам, изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

1. Способ получения микробного инсектицида, включающий культивирование Bacillus

thuringicnsis в жидкой питательной среде, выделение спор и токсинов посредством центрифугировапия и высушивапия, отличающийся тем, что, с целью исключения вторичной инфекции, споры лишают способности к размножению, сохраняя их инсектицидную активность.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что лишение спор возможности к размножению осуществляют путем обработки культуральной жидкости перекисью водорода Р-пропилактоном или ультразвуком.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что перекись водорода берут для обработки куль5 туральной жидкости из расчета внесения 0,5—

5 0 вес ю/ю.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что для обработки культуральной жидкости берут

Р-пропилактон из расчета внесения 0,25 вес. /о.

lo 5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что обработку культуральной жидкости ультразвуком производят из расчета 20 килоциклов в течение 20 мин.