Способ получения протеолитических ферментов
Q,,r c, ОП И СAÍИ Е
ИЗОБРЕТЕНИЯ
379IOl
Союз Советскиз
Социалистически»
Республик
К ПАТЕНТУ
М, Кл. С 12d 13/10
Заявлено 02.Х.1968 (№ 1277123/28-13) Приоритет по п. 1 ОЗ.Х.1967, № 45046/67, Дания, по п. 2 03.Х.1967, № 45046/67, Дания и 26ХП.1968, № 35921/68, Великобритания
Опубликовано 18Л7.1973. Бюллетень № 19
Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров
СССР
УДК 577.15.07(088.8) Дата опубликования описания ЗОХ11. 1973
Авторы изобретения
Иностранцы
Киуд Аунструп, Отто Андресен, Хелле Оуттруп,:(Дания) Иностранная фирма
«Ново Терапеутиск Лабораториум AJC ,(Дания) Заявитель
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ
ФЕРМЕНТОВ
Зависимый от патента №
Изобретение относится к ферментной промышленности.
Известен способ получения протеолитически х ферментов путем выращивания микроорга низмов рода Bacillus на питательной среде, содержащей источники углерода, азота в присутствии минеральных солей при щелочном значении рН среды и аэрации с последующим выделением ферментов из культур ал ьной жидкости.
Предлагаемый способ позволяет получить ферменты, обладающие оптимальной протеолитической активностью по отношению к гемоглобину. в присутствии мочевины при зна; чесании рН не менее 10.
Для этого рН среды устанавливают на значении 8,5 — 10,5, а в качестве микроорганизмов используют один из штаммов, н аходяшихся на хранении в Национальной Коллекции Промььшленных бактерий, Исследовательской станции Торри, Абердин, Шотландия. под №№ 10144, 10148, 10281, 10284, 10286, 10288, 10301, 10304, 10306 — 10313, 10315—
10327, 10282, 10287, 10291, 10293, 10302, 10314, mm их мутанты.
Способ заключается в следующем.
Производят культивирование бактерий рода Bacillus на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей при аэрации и рН среды 7,5 — 10.
В качестве источника углерода используют карбогидраты, такие как сахароза, глюкоза, крахмал, мука из зерен хлебных злаков, рнс. сорго и др. Концентрация кароогидратов со5 ставляет 25 — l o, наиболее оптимальная
8 — 10% (процент вычисляется .по декстрозе).
Присутствие в питательной среде карбогидратов способствует образованию кислотных компонентов, в результате чего рН среды прп
10 культивировании снижается. Так как рН среды необходимо поддерживать в пределах 7—
12, необходимо его измерять. Для поддержания среды в указанных пределах можно определенное количество карбогидратов вво15 дить вместе с буферным веществом. Кар бонаты н особенно сесквикарбонаты, используемые в концентрации 0,2М в среде, способ ны поддерживать рН среды 10.5 и 9,3 соответственно.
20 Могут применяться и другие буферные смеси, например фосфатные. Карбогидраты можно вводить небольшими порциями в течение всего, процесса. Можно использовать автоматическое регулирование рН добавлением
25 различных подщелачивающих веществ.
Источники азота могут быть использованы неорганической и/или органической природы
Подходящими неорганическими источника ми азота являются нитраты и соли аммония, 30 а органическими — соевая мука, м1ка семян
«379101
100
0,1 хлопка, а pах««совс«я м1 ка. »aae»н 1гукурузн ь! Й и дрожжсвой экстракты„мочевина, альбумин.
Культивирование осуществляют при 25—
55 С (предпочтительно при 30 — 40 С).
«Максимальная активность протеолитических ферментов достигается после культивирования в тече«ние 1 — 5 суток.
К льтивировангне бактерий осуществляется кar глубинным методом при аэрации, так и понерхн,остным.
При поверх««остном культивировании используется среда, содержащая 10 г пшеничных отрубей, 2 г NaqPO< 12Н О и 10 лг.г воды. Перед инокуляцией рН среды устанавливают на значении около 10 с помощью 2 мл
NaOH. Дан«ным методом культивируют штамм С 300 и С 303. Активность полученных ферментов около 20 ед. Ansona на 1 кг пшеничных отрубей.
Активность ферментов определяется с помощью гемоглоби нового метода Ansona (Anson gournal о1 yeneral Physiology, 22, 79 — 89, 1939) .
Одна единица Ansona означает количество протеолитического фермента, расщепляющего гемоглобин при рН 10,1 и температуре 25 С в течение 10 мин с такой первоначальной скоростью, при которой в 1 мин образуется такое количество продуктов расщепления, которое не может осаждаться трихлоруксусной кислотой, чтобы эти .продукты расщепления дали тот же цвет с фенольн ым реагентом, какой дает олин миллиэквивалент тирозина.
Д гя культивирования видов и штаммов используют две среды:
Среда BPFA co следующим составом, г/л водопроводной воды:
Картофельная мука
Сахароза
Ячменная мука
Соевая мука
Казеинат натрия
Ха НРО.«12НгО
Рl ецгonic
Среда BSX со следующим составом г/л водопроводной воды:
Ячменная мука
Соевая мука
Р1е«« гоп i c
Обе эти среды доводятся до требуемого значения рН добавлением сесквнкарбоната или соды в стерильных условиях. Присутствующий крахмал нейтрализуется а-анилазой.
Эксперименты проводятся в 500 мл встряхиваемых колбах, каждая из колб содержит
100 лг,г питательной среды BPFA u BSX соответственно, которые стерилизуются в автоклаве в течение 90 мин при 120 С. После обработки в автоклаве значение рН доводится до 9,3 — 10,5 с помощью сесквикарбоната натрия. Для каждой бактерии используется четыре колбы, и пробы из культуральных
Зо
65 сред для определения активности фермента, выраженного в единицах Anson, берутся после культивирования через 3, 4, 5 и 6 дней соответственно. Колбы при культивировании помещаются на вращающийся стол с
240 об, мггн.
В табл . 1 приводятся максимальные выходы энзимов и значения рН.
Питательные средства BPFA u BSX используются также для культивирования в емкостях в глубинных условиях при искусственной аэрации.
В табл. 2 приведены данные культивирования при 34 С на пилотной установке в 550 л емкостях. При других культивированиях на пилотной установке используются другие штаммы с варьируемыми составами питательной среды.
В остальных цистернах культивируется штамм
С 303 в четырех вариантах с различными условиями.
Композиции культуральных сред, условия культивации и полученные результаты даются в табл . 3.
Протеолитические ферменты выделяют из культуральной среды путем удаления клеток бактерий центрифугированием и осаждения ферментов из фугата добавлением - Na>sO< или этанола. Образовавшийся осадок отделяют фильтрованием на кизельгуре и полученный осадок су.шат.
Примеры выделения ферментов приведены в табл. 4.
Исходные материалы, упомянутые в табл.4, получают кул«ьтивированием в 550 л цистернах из нержавеющей:стали при искусственной аэрации, рН питательных сред устанавливается первоначально с помощью 2М раствораà N а СОЗ.
Испытание протеолитических ферментов, показывает, что между ними есть существен«ные различия, относящиеся к ряду их свойств.
«По протеолитической актив«ности ферменты мотут быть разделены на три .группы или типа. Протеолитическая активность измеряется при р«Н 12 и выражается в про|центах максимальной активности:
Тип 1 100 вЂ
Тип 2 80 — 50
Тип 3 50 — 0
Известно на практике, что ионы кальция стабилизируют активность большинства протеолитических ферментов. Новые ферменты, продуцируемые бактериями, перечисленными в табл. 1 и разделенные «на виды и разновидности, испытывают .в отношении стабил«изирующего действия ионов кальция в концентрации 0,01М и при рН 10,5 или lil. Ста!билизация выражается в, процентах остаточной активности после выдержки в течение 30 мин прн 50 С.
Результаты испытания типов ферментов и стабилизирующего эффекта ионов кальция приводятся в табл. 5, в которой плюс означает, что остаточ«ная протеолитическая активТаблица 1
BSX, единицы Anson на 1кг рн рн
Вид среды среды
10,0
9,2
9,5
9,3
С 323
С 339
С 323
С 323
33
7,6
9,3
9,1
9,3
22
38
32
115
6,5
9,7
9,1
С 304
С 311
С 336
48
8,1
9,4
8,0
С 335
С 341
10,0
9,9
38
9,5
9,2
С 358
С 410
9,6
7,1
9,5
С 365
С 412
8,2
9,3
С 370
9,0
115
VI I
9,8
9,4
10
47
С 326
С 342
9,5
8,9
9,1
8,9
44
С 347
С 350
9,3
8,8
13
С 337
С 340
9,6
9,8
78
8,0
9,4
9,5
9,2
С 324
С 355
97
8,9
9,1
9,6
С 353
8,9
7,3
С 373
6,4
18
С 325
С 413
6,5
9,5
Разновидность
Штаммы
С 303
С 354
С 357
С 366
С 367
С 371
С 375
С 378
С 351
С 356
С 364
С 376
С 377
С 411
С 338
С 343
С 346
С 348
С 349 3.79101
ВРРА, единицы
Anson на
1 кг
17
5
2
2
3
72
14
26
17
7,2
9,0
8,2
8,7
8,8
8,5
7,6
8,5
8,3
7,7
8,3
9,3
7,8
8,2
9,0
8,5
9,6
9,0
11
15
2
7,2
9,7
9,1
9,4
9,5
9,4
9,4
9,6
9,3
9,7
9,7
9,3
9,7
9,7
7,7
8,9
9,4
9,1
9,2
3.79101
Таблица 2
Штамм
С 324 С335 I С339 С 347 С 351
Среда
Показатели
BSX
ВРРА
BPFA
BPFA
BPFA
10,2
34
0,3
83
9,35
10,2
34
0,25
59
8,9
10,2
34
0,25
34
9,2
10,5
34
0,25
97
9,1
9,3
34
0,3
53
8,3
29
44
Таблица 3
Номер культивации
0,03
200
0,03
0,03
0,03
Таблица 4
Штамм
С 347
С 351
С 339
Условия проведения опыта
Исходный материал
600 мл культуральной жидкости, содержащей 32 ед.
Апзоп на 1 кг
250 кг культуральной жидкости, содержащей 25 ед.
Anson на 1 кг
250 кг культуральной жидкости, содержащей 45 ед.
Anson на 1 кг
19,2
6250
11250 количество ,иниц
4000 об/мин (30 мин)
t0 С 1200 мл С,Н,ОН
3000 об/мин (30 л4ин) 3000 об, мин (30 мин) Центрифугирование
Осаждение
35 С, 85 кг/Na,SO,, отстаивание 1 час
t35 С, 85 кг Na SO4, отстаивание 1 час
Никакой (центрифугирование)
30 мин при 4000 об/мин; промывка 600 л4л С,Н,ОН при 0 С, центрифугирование
4000 об/мин 10 мин
2,25 кз кизельгуровый фильтр-пресс
Фильтр-пресс
Фильтрация
Сушильная камера (40 С) Сушильная камера (40 С) Вакуум Р,О„
Сушка
Порошок фермента
4000 г содержание 0;4 ед. 1300 г, содержание 0,8 ед.
Anson на 1 г Anson на 1 г
9,7 г, содержание 1,3 ед.
Anson на 1 г
1600 ед. Апзоп=25 об
Выход
1020 ед. Anson=9
12,6 ед. Апзоп=65О, .
Значение РН перед инокулированием
Температура культивирования, С
Воздух, м /мин
Время культивации, час
Конечное значение рН
Конечная протеолитическая активность, выраженная в единицах на 1 кг субстрата
Условия культивации и культуральные среды
Ячменная мука г/л
Соевая мука г/л
P I eu roni с, мл/л
Na,ÑO3 (стерильная добавка перед и нокул прова ни ем)
РН перед инокуляцией
Температура культивации, С
Воздух, мз/мин
Время культивации, час
Максимальное значение рН
Максимальные единицы Anson на 1 кг
0,2М
10,0
34
0,3
9,3
0,2М
10,0
34
0,3
104
9,3
0,2М
10,35
34
0,3
113
9,6
0,4М
10,1
34
0.3
126
9,3
З.79101
Таблица 5
СА++стабилизация
Вид
Штамм ы
Разновидность
Тип энзима
С 300, С 301, С 360
С 372, С 374
С 302, С 334
С 323, С 339, С 352, С 369
С 304, С 311, С 336
++тт (t
+++
С 335, С 341
+С 326, С 342
С 347, С 350
С 337, С 340
С 338, С 343, С 346
С 348, С 349
С 324, С 355
+7777
С 353
С 303, С 354, С 357
С 366, С 367, С 371, С 375, С 378
1Ч
С 351, С 356, С 364, С 376, С 377, С 411
С 358, С 410
С 365, С 412
С 373
С 325, С 413
VП
С 370 ность в отсутствии иолов кальция является ниже 80% соответствующей активности контроля (в присутствии ионов кальция), а минус означает, что остаточная протеолитическая активность в отсутствии ионов кальция является выше 80% соответствующей активности контроля в присутствии донов кальция.
Протеолитическая активность ферментов, продуцируемых штаммами, перечисленными в табл. 5, испытывается не только при рН 12, но также при более низких его значениях.
Новые ферменты подвергают следующим и и ь1 т B н и я м: а) Стабильность против триполифосфата
379101
Испытания проводя«тся 30 мин при 50 С и при рН 10; метод анализа — нитро-казеиновый (Е. V. РесЬпапп, Biochemische Zeitschrift, Bd.
321, 248 — 260/1950) .
Определяется стабильность ферментов в растворе, содержащем 0,2% три!поли фоофата.
Стабиль ность выражается в процентах остаточной активности спустя 50 мин, при 50 С при рН 10. Концентрация фермента 0,1 ед, Anson на 1 л (по методу Ansona).
Цифры в табл. 6 расшифровываются следующим образом: цифра над строкой показывает процент остаточной активности, когда анализ выпол10 няется сразу после добавления поверхностноактивного вещества, то есть дан ная цифра дает показатель первоначальной степени инактивации; цифра под строкой показывает разницу
15 между данной первоначальной остаточной активностью и процентом остаточной активн ости с п уст я 30 мин.
d) Оптимальная температура.
Температура дана в градусах Цельсия, при
20 которой была найдена максимальная активность при рН 10. (Методом анализа был метод Anson). е) Тип фермента.
Найдено, что все ферментные препараты
25 ингибируются моментально с полностью фенилметилсульфонилфторидом. Это означает, что все ферменты в активном центре имеют серии.
f) рН вЂ” устойчивость.
30 Стабильность,при различных значениях рН определяется:в отношен ии пяти ферментных препаратов при следующих условиях: выдерживание — 24 час .при 25 С; значения рН—
5 — 7 — 8 — 10 — 12; .концентрация фермента
35 0,2 ед, Апзоп на 1 л.
Результаты приводятся в табл. 6.
Соответствующие растворы с 0,01М СаС!г показывают остаточную активность во всех случаях 80 †1 .
b) Стабильность против пербората.
Определяется а ктивн«ость раствора, содержащего фермент и перборат натрия в. количестве 0,1%. Стабильность выражается в процентах остаточной активности спустя 30 мин при 50 C и рН 10. Концентрация фермента и методика анализа такие же, ка!к в испытании а.
c) Стабильность против поверхностно-активиых веществ.
Стабильность растворов, содержащих фермент и различные поверхностно-активные вещества, определяется .при использовании трех типичных поверхностно-активных веществ в концентрациях, соответствующих концентрациям, применяемым в моющем растворе:
Мыло 0,25 г/л
ДВЬ вЂ” алкил-арилсульфонат (50% -ный) 2,5 г/л
TAS — сульфат жирного спирта (25% -ный) 5,0 г/л
Концентрация фермента 0,1 ед
Ап.- о;1 па 1 л
Таблица б
i Лктивиость, Тип единицы
Anson ua
1 г при рН ма
Стабильность
Энаимиый преl1s >sT в виде порошка, г
Оптимальная температура. С
Поверхностно-активные вещества
Серии
Стабильность
ПерTPP рН м, ДBS TAS
6,0 — 10,5
5,0 — 11,0
6,0 — 10,5
6,3 — 10,3
6,3 — 11,0
С 300
С 301
С 302
С 303
С 304
С 334
С 351
С 354
С 360
С 364
С 365
С 366
С 367
С 370
С 371
С 372
С 376
С 377
С 335
С 3:9
С 369
С 347
3
600
2,5
1500
117
456
2000
500
3000
430
213
1500
217
7,2
573
0,5, 10;
0,7!10, 0,7/10!
3,0/7,5!
0,3/7,5/
0,5/7,5!
1,3/7,5/
0,6/7,5/
0,4/7,5/
0,9!7,5, 0,4! 7,5,«
0,8/7,5/
2,2,7,5/
0,6/7,5,!
1,0, 7,5, 2,7!7,5!
7,8/7,5/
1,9/7,5/
0,3/7,5/
1,4!7,5/
1,4!7,5, - «О
91
78
90
100
89
88
60
81
89
47
48
39
66
82
53
86
96
91
93
78
Яб
29
76
36
82/71
50/47
59/56
85/50
57/56
100/83
93/67
77/33
97, 94
81/31
100/О
92/42
88/2
94/4
97/60
93/95
66, 42
100, 10
95 51
89 10
28!28
81,78
56/48
35/31
40/30
34/31
90/27
67/50
60/38
76/70
27/11
72!30
67/14
58/34
33/15
70! 44
75/68
25/10
59, 27
40/32
75. 57
6/6
94!71
7/6
4/2
3/1
23/18
3/О
93/73
53/45
60/53
75/75
16/8
92/48
68/61
71/52
67/30
93/57
87/85
15/12
74/59
78/71
83!62
О, 0
67, 63
+
+
+
+
+
Г
+
+
+
+
-t
379101
Таблица
Ссылочный номер № NCiB:
Источник выделения
Метод обогощси:
С 300
10144
С 301
10145
С 302
10146
С 303
10147
С 304
10148
С 311
10281
Пербэратовый агар
С 323
10282
To iK
С 324
10283
С 325
10284
С 326
10385
С 334
10286
С 335
10287
С 336
10288
С 337
10289
С 338
10290
С 339
10291
С 340
10292
С 341
10293
С 342
10294
С 343
10295
С 346
10296
С 347
10297
С 348
10298
С 349
10299
С 350
10300
С 351
10301
Куриный помет
С 352
10302
9,2 — 9.6) Почва с кладбища в Копенгагене
Почва с кладбища в Копенгагене
Почва с речного берега в Копенгагене
Груда почвы и листьев с кладбища в Ко пенгагеие
Древесный песок на Blokhus. gutland
Лесная почва из Ascheber, Holstein
Полевая почва из Датского городка
Почва с берега озера из Aschcberg, Holstein
Инфекция на пластинке с перборатными отверстиями
Инфекция на пластинке с перборатными отверстиями
Почва с берега реки из Даского города
Почва из сада Датского города
Конский и слоновый навоз
Гкина с травяного поля иэ Ascheberg, Но!-
stein
Почва с кладбища в Копенгагене
Почва с речного берега Датского города
Почва с речного берега Датского города
Полевая почва из Датского города
Садовая почва из Датской деревни
Садовая почва пз Датского города
Почва с птичьего двора (курятника) из
Даткого города
Олений навоз из оленьего парка вблизи
Копенгагена
Почва с птитьего загона (курятника) Олений навоз из оленьего парка вблизи
Копенгагена
Вода из Копенгагенского озера
Страусосьш номе. из зоопарка
Крахмально-казепновая среда (pl-1 noiui!i мается постепенно от 10 до 12) Посев образцов по::вы
На ага рс C cccKBuкароо:и: i o. : lf!H =. J,(!
Испытание зон гидро:iii:.а иа нейтрал,!io:i агаре со снятыми сл,.иками
Щелочь, снятые c;i!inк:., aãàðo:. е пластии:I!, заполненные перборатом натрия
Перборатньш агар
Перборатный агар
Перборатньш навоз
Перборатная заготовка
Псрборатная заготовка
Псрборатпый агар
Псрборатньш агар
Перборатный агаг.
Садовая заготовка
Переработанный агар
Многократное у,,обрение щслз:u,uiм и,. ;...,.алом
Многократное удобрепие:цело:и;ым рахмалом
Многократное удобрение щело шь:и крахмалом
1Целочно-крахмально-казенновen среда с триполифосфато:
Термофii isuoe сссквир,"iapnoue c -:oc \ ;доорсш с. (50 С, рН 8,6 — 9,7) Узобретени ccсвик;:n:î ià, o:.. изгои."., (; Il
379101
Продолжение
Источник выделения
Метод обогощения номер
С 353
10303
Навоз слона
10304
С 354
Почва с куриного двора
Почва с куриного двора
С 355
10305
С 356
10306
Садовая кора
10307
С 357
Почва с куриного двора
10308
С 353
Почва с куриного двора
10309
С 360
Переработанный агар
10310
С364
10311
С 365
Отрубно-садовое удобрение
10312
С 366
10313
С 367
Слоновый навоз
10314
С 369
Страусовый помет
10315
С 370
Узобрение щелочной маниит — KNO, 10316
С 371
Слоновый навоз
10317
С 372
Крахмально-казеиновое моющее удобрение
Садовая почва из Датского города
С 373
10318
Переработанный агар
С 374
10319
С 375
10320
Страусовый помет из зоопарка
С 376
10321
Слоновый навоз
10322
С 377
Вода из бассейна гиппопотама
10323
С 378
Маннит — KNO> удобрение
С 379
10324
С 411
10325
10326
С 412
С 413
10327
": Номер, под которым бактерия находится в национальной коллекции промышленных бактерий.
Ссылочный № ХС(В:
Садовая почва из Датского города
Соскоб с унитаза (туалетного резервуара) Я(идкость из сыромятно-известковой ванны
Детский кал
Соскоб с сыромятно-известковых контейнеров
Глина с травяного поля из Ascheberg, Ноlstein
Глина с травяного поля из Ascheberg, Но1stein
Соскоб с сыромятно-известковых контейнеров
Тигриный навоз
Голубиный помст
Почва с куриного двора из Датского города
Глина с травяного поля из Aschcberg, Ноlstein
Узобретение сесвикарбонатом натрия (рН
9,2 — 9,6) Удобрение на основе нитрата глюкозы при
40 С
Удобрение на основе нитрата глюкозы при
40 С
Удобрение на основе нитрата глюкозы при
50 С
Удобрение на основе нитрата глюкозы при
50 С
Удобрение на основе нитрата глюкозы при
50 С
Термофильное сесквикарбонатное удобрение (50 С, рН 8,8 — 9,7) Крахмальное удобрение (рН 11) с неорганическим азотом
Термофильное сесквикарбонатное удобрение (50 С, рН 8.8 — 9,7) Протеоза пентон (встряхиваемые колбы) рН 9,7
Протеоза пептон (встряхивание колбы) рН 9,7
Натриевая соль этилендиамин-тетрауксусной кислоты крахмально-казеиновое удобрение
Натрийсесквикарбонатное удобрение (рН
9,2 — 9,6) Натрийсесквикарбонатное удобрение (рН
9,2 — 9,6) Термофильное казеиновое крахмальное удобрение с NaOH
Термофильное сесквикарбонатное удобрение (50 С рН 8,8 — 9,7) Картофельная мука и натрийсесквикарбонатная заготовка
Крахмальное удобрение (рН 11) с неорганическим азотом,379101
17
45 роста 37—
55
65
В табл. 6 показан интервал рН, в котором была найдена остаточная активность порядка
80 — 100 ю/ю.
Испытание ферментных препаратов,:полу ченных с помощью штаммов С 303 и С 347, по отношению к сульфиту натрия показывает, что ферменты не чувствительны к да и ному восстанавливающему агенту, из чего следует, что S — S мостики не существенны для третичной структуры ферментов.
Из табл. 6 видно, что ряд ферментных,препаратов .показывает удивительные свойства стабильности. Ферментные препараты или композиции, согласно изобретению, состоят из твердой или жидкой смеси протеол итических ферментов и других ком понентов, количество и состав которых зависят от цели и технической или научной области, в которой намереваются использовать их.
Ферментные препараты или,композиции могут состоять из,гранул, могут быть в виде суспензии .или раствора, содержащего стабилизаторы. ,Полученные ферменты используют в небольших количествах (не более 10 вес. /ю).
Эти ферменты используют в моющих, депилаторных композициях, в препаратах для ги|дролиза протеинов, в установках для очистки канал изации, в орошающих композициях и в качестве септических добавок в резервуары.
Для получения, протеолитических фермен:тов осуществляют культивирование новых видов Bacillus, выделенных из различных образцов почв, навоза животных и других источников.
Для выделения новых видов бактерий рода
Bacillus источники выделения (на пример, почву, навоз) помещают в питательные среды, имеющие значение рН 9 — 11, а затем выделяют бактерии, способные расти при указанных рН, и подвергают их исследованиям.
Для выделения используют и методы удобpeиия (витаминизирования), известные в промышленности.
Характеристики вновь выделенных .штаммов приводятся в табл. 7.
Таксономические иссл едования всех этих членов рода Bacillus осуществляются при использовании, методов, описанных Smith om, Gordon u Clark Ь «АегоЫс Spore forming
Bacteria», U. S. Department of Agr. монография Ко 16 (1952). Эти методы до настоящего времени считаются наиболее подходящими, но они должны видоизменяться в виду того, что все питательные среды должны устанавливаться на более высокой величине рН, чем та, которая указывается Смитом, Gordon u
Clark, потому что все виды Bacillus, перечисленные в табл. 7, растут при,повышенных значениях рН.
Бактерии могут разделяться довольно точ но,на морфологические группы. Эти группы отличаются друг от друга до такой степени, 5
40 что в действительности представляют отдель.ные виды.
Внутри морфологических групп встречаются различия в биохимических реакциях. На основе этих различий группы подразделяются на разновидности, которые представляются одним или более штаммами.
Вид 1 (принадлежащий к морфологической гриппе 1 в соответ"твии с Bergen ).
Морфология. Вегетативные палочки размером 0,5 — 0,7X1,5 — 4 мк, образует споры размером 0,5 — 0,8)(0,8 — 1 мк от центральных до субтерминальных. Встречаются споры овальные, цилиндрические, тонкостенные.
Разновидность а.
С 300„С 301, С 360, С 372, С 374.
Грамположительные.
Рост на питательном агаре при рН 7,3 и
9,7 хороший. Максимальная температура для роста 50 — 55 С.
На глюкозном или маннитовом агаре с нитратом в качестве единственного источника азота .при рН 9,7 рост скудный или отсу-ствует.
Крахмал гидролизует.
Через семь дней зона гидролиза узкая.
Разновидность b.
С 302, С 334.
Грамположительный.
Рост на .питательном агаре при рН 7,3 гораздо медленнее в течение первых двух дней, после этого почти сравним с ростом на питательном агаре при рН 9,7.
Максимальная температура для роста 40—
50 С.
На глюкознэм или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом,в качестве единственного источника азота рост скудный или отсутствует.
Гидролизует крахмал; при этом образуется широкая зона гидголиза.
Разновидность с, С 323, С 339, С 352, С 363.
Граыположительный или грамизменчивый.
Рост умеренный до скудного на питательном агаре при рН 7,3.
Максимальная температура
50 С.
На глюкоз ном или манннитовом агаре с нитратом в качестве единственного источника азота рост скудный. Гидролизует крахмал, зона гидролиза широкая.
Разновидность d.
С 304, С 311, С 336.
Грамположительные палочки.
Рост умеренный до окудного на питательном агаре при рН 7,3.
Максимальная температура для роста
37 С.
Скудный рост на глюкозном или ма ннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источни а азота.
Кр ахм ал .не гидр олизует.
379101
19
Вид 11 (принадлежащий к морфологической группе I, согласно Вегдеу).
С 335, С 341.
Морфология. Вегетативные палочки размером 0,3 — 0,4><1,5 — 2,5 мк, Споры образует. Размер их 0,3 — 0,5)(X0,8 — 1 мк от центральных до парацентральных, от овальных до цилиндрических, тонкостенные.
Спорангии очень мелкие или отсутствуют, разбухание спорами.
Гр амположительный.
Почти нет роста на питательном агаре при рн 7,3.
Максимальная температура для роста 37 С.
Нет или скудный рост на глюкозном или маннитовом агаре с нитратом в качестве единственного источника азота.
Крахмал не гидрол изует.
Вид I I I.
Морфология. Вегетатизные палочки размером 0,6 — 0,7Х1,5- — 3,5 мк с закругленными концами.
Споры эллипсоидальные размером 0,7—
0,9;(1,0 — 1,2 р,,парацентральные до субтерминальных, толстостенные.
Некоторые спорангии отчетливо вздутые.
Палочки в спорулирова нных культурах разбухают и растут очень толстыми, но сохраняют их оригинальный вид. Спорулирующие короткие палочки мо гут иметь глобулярную форму на да иной стадии. Таким образом, нет локального разбухания на месте, где размещается спора, хотя некоторые спорангии веретенообразные.
Разновидность а.
С 326, С 324.
Грамположительный.
Рост отсутствует или только незначительный на питательном агаре при рН 7,3.
Максимальная температура для роста 50 С.
Рост отсутствует или только скудный на глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота.
Крахмал гидролизует, при этом образуется широкая зона гидролиза.
Разновидность b.
С 347, С 350.
Грамположительный.
Умеренный рост на питательном агаре при рн 7,3.
Максимальная температура для роста 50 С.
Недостаточный рост на глюкозном или маннитовом arape при рН 9,7 с .нитратом в качестве единственного источника азота.
Крахмал гидролизует, зона гидролиза широкая.
Разновидность с.
С 337, С 340.
Грамотрицатеяьный или грамизменчивый.
Умеренный рост на питательном arape npu рН 7,3.
Максимальная температура для рорта 37 и
50 С
Недостаточный рост на глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источпи ка аз.ота
Крахмал гидролизует с образованием широкой зоны гидролиза.
Разновидность d.
С 338, С 343, С 346, С 343, С 349.
Грамизменчивый ил и грамотрицательный.
Рост на питательном àrape при рН 7,3 умеренный.
Максимальная тем пература для роста 45 —50 С.
Рост отсутствует или очень незначительный на:глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом .в качестве единственного источника азота.
Крахмал гидролизует с образованием широкой зоны гидролнза.
Разновидность е.
С 324, С 355.
Грамположительный.
Роста нет или только очень незначительный на питательном агаре при рН 7,3.
Максимальная температура для роста 45—
50 С.
Умеренный рост на глюкозном ил и маннитовом агаре,при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота.
Гидролизует крахмал с образованием широкой зоны гидролиза.
Разновидность j.
С 353.
Грамотри.цательный.
Умеренный рост на питательном araoe cpu рН 7,3.
Максимальная температура для роста 50 С.
Умеренный рост на глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве источника азота.
Гидролизует крахмал с образованием широкой зоны гидролиза.
Вид Хо IV (принадлежащий к морфологической группе II, согласно Bergey).
Морфология. Вегетативные палочки размером 0,4 — 0,5Х2 — 3 мк часто встречаются в виде длинных цепочек.
Образует споры овальные, субтерминальные толстостенные, легко окрашенные, размером 0,6 — 0,8>(0,7 — 0,9 мк.
Спорангии отчетливо вздутые, булавовидные.
Разновидность а.
С 303, С 354, С 357, С 366, С 367, С 371, С 375, С 378.
Грамотрицательный.
Рост умеренный до хорошего на питательном araoe при рН 7,3.
Максимальная температура для роста 57 С.
Рост умеренный до хорошего на глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота.
Крахмал гидролнзует с образованием умеренной зоны гидролпза.
37ИО1
21
Разновидность b.
С 351, С 356, С 364, С 376, С 377, С 411.
Грамизменчивый.
В других отношениях похож на разновидность а.
Разновидность с:
С 358, С 410. .Грамположительный. ,В других отношениях как разновидость а.
Вид V (принадлежащий к мор фологичес кой группе II, согласно Bergey).
С 365, С 412.
Морфология. Вегетативные палочки, прямые, встречаются слегка, изогнутые, размером
0,3 — 0,4><2 — 4 мк.
Споры размером 0,6 — 0,7)(0,9 — 1,2 мк, овальные до эллипсоидальных,;парацентральные,до терминальных, толстостенные, слегка о кр а шен ные.
Спорангии отчетливо вздутые, булавовидные до ракетковидных.
Грамположительный.
Рост умеренный до хорошего на питательном агаре при рН 7,3.
Максимальная температура для роста 57 С.
Хороший рост на гл юкозном или маннитовом агаре при, рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота.
Гидролизует крахмал с образованием зоны гидролиза от умеренной до широкой. ,Вид VI (принадлежащий к морфологической группе II, согласно Bergey).
Морфология. Вегетативные палочки слегка изогнутые, концы заостренные, размером
0,25 — 0,35X2,5 — 5 мк.
Споры от овальных до эллипсоидных, от субтерминальных до терминальных, размером 0,8 — 1Х1,1 — 1,3 мк.
Спорангии отчетливо вздутые, булавовидные, встречаются формы барабанной палочки.
Разновидность а.
С 373.
Грамотрицательный.
Рост отсутствует или только очень незначительный на питательном агаре при рН 7,3.
Максимальная температура для роста 50 С.
Рост отсутствует или только очень незн ачительный на глюкозном или ман нитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве едичственного источника азота.
Гидролизует крахмал с образованием широкой зоны гидролиза, Разновидность b.
С 325, С 413.
Грамположительный.
Умеренный рост на питательном агаре при рН 7,3.
Максимальная температура роста 50 С.
Рост отсутствует или только очень незн ачительный на глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота.
Крахмал гидролизует с образованием широкой зоны гидролиза.
Вид VII.
С 370.
Этот штамм экспериментально классифицирован как новый вид.
Он, является аспорогенным или олигоспорогенным и, следовательно, не может быть ломещен в какую-нибудь морфологическую группу.
Таблица 8
Разновидность
Штаммы
Виды
С 300, С 301, С 360, С 372, С 374 а
С 302, С 334
С 323, С 339, С 352 С 369
С 304. С 311, С 336
С 335, С 341
С 326, С 342
С 347, С 350
С 337, С 340
Ш
С 338, С 343, С 346, С 348, С 349
С 324, С 355, С 353
С 303, С 354, С 357, С 366, С 367, С 371, С 375, С 378
С 351, С 356, С 364, С 376, С 377, С 411
С 358, С 410
С 365, С 412
С 373
55
С 325, С 413
С 370
VII
Он наиболее вероятно относится к щелочным бактериям, которые принадлежат к морфологической группе IJ рода Bacjllvs (соглас65 по Bergen ), З79101
Таблица
Рост иа ннтрате (ХОз) как единственном источнике
Широта зоны гидролнза на крахмальном arape
Максимальнаяая скорость роста при рн
Максимальная температура роста
Рост на питательном агаре при рН 7,3
Разновидность
Гидролиз крахмала
Вид
Грамм цвет
8,0 — 9,5
8,0 — 8,5
8,3 — 8,8
9,0 — 8,6
50 — 55
40 — 50
37 — 50
37 скудный скудный плохой плохой
1
8,0 — 9,0
37 плохой плохой плохой плохой плохой плохой
++
37 — 50
45 — 50
45 — 50
50 плохой
++ плохой плохой
+++
+++ -XJ (+++
+++
+++
+ изм изм а
Ь с
d е
+
+
8,3 — 9,0
8,5 — 9,0
8,0 — 9,0
8,0 — 9,0
57
57
+++
+++
+++
+++
+++
—,++
+ изм
57 (Ч
+ —:+
8,5-г9,2 плохой плохой
50 плохой
VI
8,0 — 8,5
VII
23
Вегетативные палочки часто в длинных цепочках, нитевидные, концы слегка заостренные или закругленные, размером 0,3 — 0,5X2 — 5 мк.
Грамотрицательный.
Рост от умеренного до хорошего на питательном агаре при р Н 7,3.
Максимальная температура для роста 57 С.
Хороший рост на глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота, Гидролизует крахмал с образованием умеренной зоны гидролиза.
Следующие признаки являются общими для ряда штаммов, принадлежащих к различным разновидностям в видах 1 — EV.
Желатин — гидролизует.
Казеин — гидролизует.
На агаре с глюкозой рост такой же, как на питательном агаре.
На соевом косом агаре рост более обильныи и мягче, чем на питательном агаре.
Тирозиновый косой агар, Рост такой же, как на питательном агаре.
Питательный бульон. Средняя мутность с обильным осадком.
24
Пленки нет или образуется пленка тонкая и хрупкая.
Бульон с NaCE. Хороший рост при 5%-пой концентрации NaCI; растет при 7%, 5 Лцетилметилкарбинола не образует.
Восстанавливает нитрат в нитрит.
На глюкозном бульоне в анаэробных условиях при рН 7,8 или выше за 14 дн ей (рН среды доводится до 9 перед инокуляцией) рост
10 скудный, На основе таксономических исследований изобретателей штаммы рода BacillIIs, перечисленные в табл. 1, классифицируются следующим образом (см. табл. 8).
Все эти виды выращиваются также на лигательном агаре и соево-бобовом агаре, а некоторые из них на глюкозном и маннитовом питательных агарах с целью наблюдения формы, 20 виды и цвета колонии.
В табл. 9 приведены свойства, вариации которых образуют основу для разделения разновидностей внутри различных морфологиче25 ских групп.
379101
Предмет изобретения
Составитель Т. Полянская
Техред Т. Миронова
Корректор Л. Бадылама
Редактор А. Бер
Заказ 1921/13 Изд. № 483 Тираж 467 Подписное
ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР
Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр. Сапунова, 2
1. Способ получения протеолитических ферментов путем выращивания микроорганизмов рода Bacillus на питательной среде, содержащей источники углерода, азота в присутствии минеральных солей при щелочном значении рН среды и аэрации с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью получения ферментов, обладающих оптимальной протеолитической активностью по отношению к ге26 моглобину в присутствии мочевины при значении рН не менее 10, рН среды устанавливают на значении 8 — 10,5.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для выращивания используют один из штаммов рода Bacillus, находящихся на хранении в национальной коллекции Промышленных бактерий, Исследовательской Станции Торри, Абердин (Шотландия) под ¹¹ 10144, 10148, 10281, 10284, 10286, 10288, 10301, 10304, 10306 — 10313, 10315 †103, 10282, 10287, !
0291, 10293, 10302, 10314, или их мутанты.
