Способ получения протеолитических

 

,1„: .".

О П И С А Н И Е 350266

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сова Советския

Социалистичесних

Республик

К ПАТЕНТУ

Зависимый от патента ¹

Заявлено 06.Х1.1968 (№ 1282065/28-13) М. Кл. С 12d 13/10

Приоритет 10.Х1.1967, № 51307/67, Великобритания

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министрсе

СССР

Опубликовано 04.1Х.1972. Бюллетень ¹ 126

Дата опубликования описания 9.Х.1972

УДК 577.15.08.156,1 (088.8) Авторы изобретения

Иностранцы

Киуд Аунструп, Отто Андерсен и Хелле Оуттруп (Дания) 11ностранная фирма

«Ново-Терапеутиск Л абораториум А/С» (Дания) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЧ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ, АКТИВНЪ|Х

В ЩЕЛОЧНОЙ СРЕДЕ

Изобретение относится к ферментной промышленности и касается способа получения протеолитических ферментных препаратов, активных в щелочной среде.

Извсстсн способ получения протеолитических ферментов, активных в щелочной среде, культивированием штаммов Entomophrales на питатсл ыитх средах, содержащих источники углерода, азота в присутствии минеральных солей при рН среды 5,0 — 9,0.

Разработан способ получения протеолитичсских ферментных препаратов активных при рН 7,5 — 11,0, что достигается использованием штамма бактерий Bacillus alcalophilus № ClB 8772 или № СТС 4553.

Используемые в настоящем способе штаммы описаны в А. Веддером в голландском периодическом издании «Antonie van 1 ecnwenhook» том 1, стр. 141 — 147 (1934 г.) н включены в б-е издание Бергея «Руководства

IIo определеншо бактерий». Штамм Bacillus

alcalophilus № СТС 4553 хранится в Национальной коллекции штаммов бактериальных культур в Лондоне, а штамм под шифром

¹ CIB 8772 в Национальной коллекции промышленных бактерий, находящейся в Эдинбурге, но этот штамм по ошибке был назва11

Bacillus вт1Ы1!1з.

Предлагаемый способ заключается в том, что штамм культивируют на птттательной среде, содержащей источники углерода и азота в легко усваивасмой микроорганизмами форме, при значениях рН среды 7,5 — 11,0 с последующим выделением протеолитических ферментов, продуцируемых внеклеточно.

В качестве источников углерода используют углеводы, например сахарозу, глюкозу, крахмал, зерна iëåáuû злаков, солод, рис, сорго н т. д. Концентрация углеводов в питате.льной среде может колебаться в широких пределах (25 — 1 — 5о/ ), причем концентрация 8 — 10% является наиболее благоприятной (указанная концентрация углеводов рассчитывается в пересчете на декстрозу). рН среды поддерживают на нужном уровне за счет добавления буферных веществ, в частности карбонатов, бикарбонатов и фосфатов натрия, а также автоматическим регулированием добавления веществ основного характера.

20 Источники азота в питательной среде могут быть неорганические или органические. В качестве подходящих неорганических источников азота можно использовать различные нитраты и соли аммония, а из органических — соевую

25 муку, муку из IQIIKOBbIx семян, арахисовую х!у!л:, казвин, дрожжевые экстракты| мочевину, альбумин и т. д.

Кроме источников углерода и азота питательная среда должна содержать в незначи30 тельном количестве необходимые для роста

Редактор В. Блохина

Составитель Н. Селиверстова

Техред 3. Тараненко Корректор Л. Царькова

Заказ 3033, 8 Изд. № 1262 Тираж 406 Подписное

ЦПИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

350266

Таблица 2 рН среды

Штамм

11 12

9 10

7 7,5

100

71

54

44 № CIB 8772

79 100

52 № СТС 4553

64 72

Таблица 3

В присутствии пербората при температуре, С

В отсутствии пербс>рата при температуре, С

Энзим

70

60

I IopoIIloK энзима

¹ CIB 8772

41,5

54,7

49,2

Контрольньий опыт в отсутствии эизима

31,5

46,2

46,7

55

Лктпвность штамма ¹ СТС 4553 измерялась при постоянном рН 10,1 и температурах

25, 37, 50, 60, 66 и 75 С.

Результаты представлены ниже.

Температура, С 25 37 50 60 66 75

Лкти шсость 14 32 65 100 26 2

Фермснтные препараты используются в различных моющих составах, в препаратах для гидролиза белков, для удаления волосяного покрова, для мытья посуды, а также в качестве добавок в септические резервуары и установки для очистки вод.

Порошок энзима, полученный из штамма

¹ 8772 по вышеописанному методу, используют в промывных экспериментах, которые проводятся с помощью полосок испытательной ткани № 116, пропитанной ЕМРЛ, выпускаемой фирмой Айдгеноесише Материалпрюфунгс унд Ферзуханштальт, Сант Галлен, Швейцария, путем нанесения на ткань крови, молока и сажи.

Используемый цетергент (поверхностно-активное вещество) имеет следующий состав, г: додецилбснзолсульфонат (50% -ный) 20 ионилфенол, 9, 5 ЕО 5 триполифосфат натрия 30 карбонат натрия безводный 15

СМС (45% -ный) 2 сульфат натрия безводный 28

Условия для промывания следующие: жесткость воды, градус 10

Отношение веса ткани к воде 1: 20

Время опыта, мин 30

pI-! раствора около 10

Концентрация детергента, г/л промывающего раствора 4,8

Протеолитичсская активность, 0,04 измеренная при рН 7,5, единица

Лисона на литр промывающего раствора

Температура во время промывания, С

60 и 70.

Промывной процесс, который проводится при 60 С, осуществляется следующим образом.

20 мл раствора, полученного из порошка фермента, имеющего температуру 20 С, рН 11,2 и протеолитическую активность

0,24 сд. Лисс>на на 1 л раствора, с помощью пипетки вносят в стакан емкостью 200 мл.

Затем прибавляют 100 мл раствора детергента, рН которого равна 11,8 прн температуре

68 С. Смесь переносят в колбу Эрленмейсра с высоким горлышком емкостью 200 1!.г и помещают в аппарат для встряхивания. Температуру смеси, равную 60 С, поддерживают Ila водяной бане.

В колбу помсща>от шесть полосок ткани ¹ 116, пропитанной ЕМРЛ общим весом

3,0 г, встряхивают в течение всего времени

rIpo> 1ь1вя и пя (30 .>син) . Зятем п ром ьсвя1оlцпй раствор отделяют, охлаждают и измеряют рН.

Лналнтнчсскнс полоски испытательной ткани прополаскнвают в горячей водопроводной воде.

Полоски затем подвергают пзмерсншо ня спсктрофотоз>страх Бс> меня степ 1111 ослабления окраски при длине волны

460 мин. Под ос 13олением QKpacl 11 понимя>от количество света, oTpa?Kc lllloI о от пспьlтятелl ной полоски и выраженное в процентах от количества свста, отряженногс> от образца окиси иапшя.

В экспериментах, проводимых прн температуре 70 С, раствор детepleIITB имеет температуру 80 С.

Б>м чп 11po13E ден11 1 .онтрол1.ниlc экспери меllты, в которых вместо раствора фермента использовалась вода.

Кроме того, все эксперименты проводят при использовании пер бората (Na B0 - 4Н20) ня

1 л промывающего раствора.

Результаты экспериментов представлены в табл. 3.

Прн этом вслпчш1а ремиссии представляет собой среднее значение, полученное в результате измерений рсмпсспн каждого нз шести образцов.

Предмет изобретения

Способ получения протсолнTпческих ферментных препаратов, активных в щелочной среде, путем выращивания пх продуцентов

60 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота в присутствии минеральных солей при щелочном значении рН среды, отличс?юи1иися тем, что в качестве продуцснта используют штаммы оактернй ВасИ1пэ

65 alcalophilrrs ¹ CIB 8772 илп № СТС 4553.