Способ получения пептидов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

245680

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимый от патента №вЂ”

Заявлено 12.XI.1966 (№ 1112660/23-4)

Приоритет 12.XI.1965, № 15637/65, Швейцария

Опубликовано 04.т 1.1969. Бюллетень № 19

Дата опубликования описания З,Х.1969

Кл. 12q, 6/01

МПК. С 07d

УДК 547 964 4 07 (088 8) Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

Авторы изобретения

Иностранцы

Беат Изелин, Хайни Каппелер, Бернхард Риникер и Вернер Риттель (Швейцария) Иностранная фирма

«ЦИБА АГ» (Швейцария) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ

Предлагается способ получения пептидов, которые обладают усиленным адренокортикотропным действием и отличаются от подобных известных пептидов тем, что в качестве первой и-аминокислоты в аминоконце они содержат

D-аминокислоту.

Предметом изобретения является способ получения D-серил-1 -тирозил-L-серил-L-метионил-L-глутамил-L - гистидил-L - фенилаланилL-apiv u-L - триптофилглицил - 1 — лизил - Lпропил-L-валилглицил-1 -лизил-1 -лизил — L-лизил-L-лизил-1 -пропил-1 -валил-1 -лизил-1 - валил-1 -тирозил-L-пролина, а также соответствующих соединений, которые вместо глутамилового остатка содержат остаток глутамина, заключающийся в том, что защищенный декапептид D-сер ил-тир озил-сер ил-метионил-глутамил (глутаминил) -гистидил-фенилаланиларгинил-триптофил-глицин конденсируют известным способом, например карбодиимидным

HJIH методом смешанных ангидридов, с эфиром или амидом тетрадекапептида лизил-пролилвалил-глицил-лизил-лизил-лизил - лизил - пролил-валил-лизил-валил-тирозил-пролина или с пептидами разной длины, в которых боковые группы защищены, с последующим отцеплением защитных групп известным способом, например обработкой трифторуксусной кислотой.

Новые соединения обладают значительно большим адренокортикотропным действием, чем соответствующие соединения с L-конфигу. рацией у первой аминокислоты. Их следует применять в медицине и ветеринарии, например вместо естественных гормонов.

Новые пептиды получают методами, известными для получения пептидов с длинной цепью, с применением D-аминокислоты в качестве N-концевой аминокислоты. При этом аминокислоты присоединяются в вышеупомянутой последовательности отдельно или после предварительного образования более мелких пептидных группировок. Особенно следует выделить синтез на твердом носителе, согласно которому пептид образуется с карбоксильного конца, соединенного эфирообразно с полимером, путем последовательной конденсации аминокислот. В качестве методов конденсации следует упомянуть, например, карбодиимидный и азидный методы, метод активированного

20 сложного эфира и ангидридный метод. Так, молекулу аминокислоты или пептида в виде сложного эфира можно присоединить к другой молекуле аминокислоты или пептида, содержащего защищенную аминогруппу, в присут25 ствии конденсирующего средства, например карбодиимида или галогенида сложного эфира фосфористой кислоты. Можно также провести реакцию обмена сложного эфира аминокислоты или пептида со свободной аминогруппой

ЗО с аминокислотой или пептидом с активирован245680

60

65 ной карбоксильной группой и защищенной аминогруппой (галогенид, азид, ангидрид, имидазолид, изоксазолид кислоты; активированный сложный эфир, например сложный цианметиловый эфир, сложный карбоксиметилтиоловый эфир или сложный нитрофениловый эфир) . Чожно провести также реакцию аминокислоты или пептида со свободной карбоксильной группой и защищенной аминогруппой с аминокислотой или пептидом с активированной аминогруппой и защищенной карбоксильной группой, например с фосфитамидом.

Не участвующие в реакции свободные функциональные группы целесообразно защищать остатками, особенно легкоотщепляемыми, путем гидролпза или восстановлением: карбоксильную — преимущественно путем этерификации, например, метанолом, третбутанолом, бензиловым, а-нитробензиловым спиртами, или амидированием; аминогруппу — например, введением тозиловой, тритиловой, формиловой, трифторацетиловой, о-нитрофенилсульфениловой, фталиловой или карбобензоксигруппы либо цветных защитных групп, таких как и-фенилазо- и n- (n -метоксифенилазо) -бензилоксикарбонильная группа, или особенно третбутилоксикарбонильного остатка. Для защиты аминогруппы в гуанидогруппировке аргинина пригодна нитрогруппа, но названная аминогруппа аргинина в реакции должна быть недостаточ:G защищенной. Иминогруппу гистидина можно защитить с помощью бензилового илп тритилового остатка.

Преобразование защищенной амино- или иминогруппы в свободную группу, а так?ке перевод функционально видоизмененной карбоксильной группы в свободную карбоксильную группу во время реакции осуществляют известными методами путем обработки гидролизирующими или восстанавливающими средствами.

Предпочитаемый метод заключается в том, что трипептид, содержащий Н-D-Сер-Тир-Сер0Н (все аминокислоты L-ряда, если D-аминокислоты специально не оговариваются), или тетрапептид конденсируют с гепта- или гексапептидом последующих аминокислот до аминокислоты 10, преимущественно по азидному методу, а затем конденсируют декапептид с тетрадекапептидом аминокислот 11 — 24.

В этом процессе конденсации в качестве метода соединения преимущественно применяют карбодиимидный метод или метод активированного сложного эфира, прежде всего, с помощью сложного а-нитрофенилового эфира.

В последнем случае не обязательно специальF1o выделять сложный и-нитрофениловый эфир декапептида, но можно образовать его на какой-либо стадии конденсации из декапептида со свободной карбоксильной группой обработкой и-нитрофенолом и дициклогексилкарбодиимидом. Итак, декапептид применяют в виде а-аминозащищенного пептида со свободной карбоксильной группой или группой сложного п-нитрофенилового эфира. Тетрадекапептид

50 применяют в виде сложного эфира, преимуще. ственно сложного третбутилового эфира или амида. Содержащиеся в конденсируемых частях пептидов аминогруппы боковых цепей преимущественно защищаются третбутилоксикарбсксильной группой, карбоксильные группы боковых цепей — третбутилэфирной группой.

В последней стадии защитные группы можно отщепить с помощью трифторуксусной кислоты.

По другой предпочитаемой технологии тетрапептид Н-D-Cep-Тир-Сер-Мет-ОН, содержащий первые четыре аминокислоты, конденсируют с эйкозапептидом аминокислот 5 — 24.

В процессе конденсации в качестве метода соединения применяют преимущественно азидный метод. а-Амидную группу тетрапептидгидразида или тетрапептидазида преимущественно защищают третбутилоксикарбонильной группой. Эйкозапептид Mo?KHO применить в виде свободного пептида или сложного эфира, особенно сложного третбутилового эфира, или в виде Про- 4-амида. Та <же в эйкозапептиде аминогруппы боковых цепей защищают с помощью третбутилоксикарбонильной группы, карбоксильную группу боковой цепи — с Iloмощью группы сложного третбутилэфира.

После того как путем конденсации пептидных группировок получен тетраикосапептид, c:-аминогруппа и аминогруппы боковых цепей которого защищены третбутилоксикарбонильной группой, а концевая карбоксильная группа и карбоксильная группа боковой цепи— группой сложного третбутилового эфира, можно все эти защитные группы одновременно отщепить с помощью кислого гидролиза, например трифторуксусной кислотой. Если концевая карбоксильная группа представлена не группой сложного третбутилового эфира, а амидной группой, то получают пептидамиды.

Пептидгидразиды получают, например, путем обработки концевой группы низшего алкильного эфира гидразингидразином.

Изобретение касается также таких способоо, в которых исходным материалом является промежуточный продукт какой-либо стадии процесса.

Изобретение описывается в следующих примерах. Температуры даются в градусах по

Цельсию. Системы тонкослойной хроматографии обозначаются следующим образом:

Система 43А: гретамиловый спирт — изопропанол — вода (100; 40: 10).

Система 45: зторбутанол — 3 /О-ный водный аммиак (100: 44).

Система 100: этилацетат — пиридин — ледя. ная уксусная кислота — вода (62: 21: 6: 11) .

Система 101: и-бутанол — пиридин — ледяная уксусная кислота — вода (30: 20: 6: 24) .

Применяют следующие сокращения: кбз— нарбобензокси; БОК вЂ” третбутилоксикарбонил; тБ — третбутил.

245680

Пример. 1). 10 г кбз-Лиз(БОК)Лиз(БОК)ОСНз (полученного из Лиз(БОК)—

ОН+Н.Лиз(БОК)ОСНОВ с помощью дицпклогексилкарбодиимида) растворяют в 160 лгл метанола и добавляют 7,8 лгл гидразингидрата. Прозрачный раствор отстаивают при

25 С в течение 24 час и концентрируют до /з первоначального объема. При добавлении

200 мл воды выпадает маслянистый осадок, который при охлаждении и отделении отверждается и из которого можно получить порошок. Порошок промывают водой и высушивают. Продукт очищают путем однократной перекристаллизации па смеси метанолсложный уксусный эфир — петролейный эфир. Получают продукт с т. пл. 118 — 119,5 С. На тонкослойных силикагельных пластинках получают следующие значения К1: (43А) 0,40 (хлороформ — метанол — 9:1) 0,75.

2), Кбз-Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -пролин.

1,87 г кбз-Лиз (БОК) -Лиз (БОК) гидразида растворяют в 15 мл свежедистиллированного диметилформамида и охлаждают до — 25 С.

Медленно добавляют каплями 2,07 лгл 4,35 н. соляной кислоты и затем 0,66 мл 5 н. раствора нитрита натрия. Перемешивают в течение

10 мин при — 10 С и добавляют раствор

692 мг L-пролина в 4,2 мл смеси диметилформамида с водой (2: 1). Затем при — 10 С каплями еще добавляют 1,82 мл триэтиламина и стстаивают реакционный раствор и р и 0 С в течение ночи и еще 2 час уже при комнатной температуре. Затем концентрируют под высоким вакуумом до объема 4 мл и добавляют в клейкий остаток 25 мл воды. При охлаждении до 0 С растирают в порошок. Нутчуют, промывают небольшим количеством воды, высушивают под высоким вакуумом при 40 С.

Для очистки некристаллизирующегося сырого продукта проводят многократное распределение по Крейгу в системе растворителя метанол — буфер — хлороформ — четыреххлор истый углерод — (35:13:15:15 (буфер — 28,5 мл ледяной уксусной кислоты+19,25 г ацетата аммония в 960 мл воды) с фазовыми объемами по 10 мл. После 220 стадий из распределительных элементов № 49-73 (г „,=61; к=0,39) путем концентрации досуха и сублимации ацетата аммония выделяют хром атографически истое, но аморфное производное трипептида с т. пл. 70 — 80 С. Тонкослойная хроматограмма на силикагели дает следующие значения Rf: (хлороформ — метанол — 9:1) 0,19 (43А) 0,29 (45) 0,52

3) . Кбз-Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -Про-Вал-Лиз (БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ.

2,4 г кбз-ЛИЗ(БОК)-Лиз(БОК)-пролина и

3,12 г Вал-Лиз-Лиз (БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ . растворяют в 30 мл аосолютного хлороформа, при 0 С добавляют 0,845 г дициклогекснлкар5

65 бсдиимида, перемешивают прн 0 С 1 час и отстаивают прп 25 С 30 час. Выпавшупо в оса, ок кристаллическую дициклогекснлмочевину огфильтровывают и промывают в небольшом количестве эфира уксусной кислоты. В фильтрат добавляют 150 мл эфира уксусной кислоты и трижды экстрагируют органическую фазу при 0 С по 30 м г 3 /о-ным раствором винной кислоты для удаления избыточного пентапептида, промывают несколько раз водой до нейтральной реакции и выпаривают досуха. Для выделения липофильных загрязнений остаток растворяют в 10 ял метанола н 20 м;г эфира уксусной кислоты и добавлением 120 мл петрслейного эфира осаждают октапептнд в виде маслянистой массы, которую сушат под вакуумом при 40 С. Полученный таким образом сырой продукт (3,1 г) подвергают окончательной очистке путем распределения по Крейгу в системе метанол — буфер — хлороформ — четыреххлористый углерод †: 10: 3: 30 (буфер тот же, что и в п. 2) по 225 стадиям с фа"-свыми объемами по 10 лиг. Хроматографически однообразное производное октапептида получают при концентрации содержания элементов № 65 — 96 (ц „„.,=78. к=0,53) досуха и удалении ацетата аммония сублимацией под

""ûñîêèì вакуумом. Белый аморфный продукт имеет т. пл. 130 — 140 С. На силикагели продукт имеет следующие значения Rf:

Система (43А) 0,74; (хлороформ — метанол

9:1) 0,54 (бензол — ацетон — 1: 1) 0,33.

4) . Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -Про - Вал - Лиз (БОК) -Вал-Тир-Пор-ОТБ.

1,46 г кбз-Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -Про-ВалЛиз (БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ после добавления 300 мг 10 /о-ного палладированного угля гидрируют в 40 мл метанола при встряхивании с абсорбцией двуокиси углерода. Поглощение водорода заканчивается уже через

20 мин. Через 1 час отфильтровывают катализатор, промывают метанолом и выпаривают фильтрат досуха. Получают значительный количественный выход хроматографически однородного дикарбобензоксилированного производного октапептида в виде белого порошка с т. пл. 110 — 120 С.

По тонкослойной хроматограмме на силнкагели продукт имеет следующие значения Rf: (43А) 0,53 (хлороформ — метанол — 9:1) 0,34.

5) . Кбз-Лиз (БОК) -Про-Вал-Глу-Лиз (БОК)—

Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -Про - ВалЛиз (БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ.

1,98 г кбз-Лиз (БОК) -Про-Вал-Глу — Лнз(БОК) -Лиз (БОК) гидразида растворяют в

22 лгл абсолютного диметилформамнда и после охлаждения до — 25 С при перемешивании по каплям добавляют 3,4 мл 2,115 н. соляной кислоты и затем 0,378 м г 5 н. раствора нитрита натрия. Прозрачный раствор при — 10 С продслжают перемешивать и затем добавляют

245680

7 предварительно охлажденный до — 5 С раствор 1,313 г вышеописанного производного октапептида в 4 мл диметилформамида. Промывают 1 мл диметилформамида и затем медленно при — 5 С по каплям добавляют 1,05мл триэтиламина. Реакционную смесь еще перемешивают 30 мин, отстаивают при 0 С.15час, а затем концентрируют до образования вязкого масла и осаждают из него при добавлении

20 мл воды маслянистую массу. Массу при нагревании снова растворяют в 20 мл метанола и снова осаждают пептид при добавлении

30 мл воды. При охлаждении до 0 С и растирании получают порошковую массу, которую фильтруют, промывают водой и высушивают.

Для очистки полученный сырой продукт подвергают распределению по Крейгу в системе метанол — буфер — хлороформ — четыреххлористый углерод — 60:20:3:60 (буфер, как в и. 2) с фазовыми объемами по 20 мл. После

218 стадии из элементов № 105 — 134 (p„„, =

=121, к=1,25) путем концентрации досуха и удаления сублимации ацетата аммония под высоким вакуумом выделяют хроматографически однородный защищенный тетрадекапептид в виде белого аморфного порошка с т. пл.

180 — 190 С. Продукт на силикагели имеет следующие значения Rf: (43A) 0,80 (хлороформ — метанол — 9:1) 0,49

6) . Лиз (БОК) -Про-Вал-Глу-Лиз (БОК) -Лиз{БОК) -Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -Про- Вал - Лиз(БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ.

1,66 г кбз-Лиз (БОК) - Про-Вал-Глу-Лиз(БОК) - Лиз (БОК) - Лиз(БОК) - Лиз(БОК)Про-Вал-Лиз (БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ гидрируют обычным способом в 40 мл метанола с 300 мг палладированного угля (10 /о Pd) .

При концентрировании фильтрованного раствора гидрирования досуха получают непосредственно хром атографически однородный продукт (1,49 г) в виде аморфного порошка, который нередко плавится при 175 — 190 С. На силикагели продукт дает следующие значения Rf: (43А) 0,41 (хлороформ — метанол — 9:1) 0,24.

7). БОК-D-Cep-Тир-Сер-Мет-Глу(ОТБ) -ГисФен-Арг-Три-Глу-Лиз (БОК) -Про - Вал - ГлуЛиз (БОК) -Лиз (БОК) -Лиз (БОК) - Лиз (БОК)Про-Вал-Лиз (БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ.

378 мг БОК-D-Cep-Тир-Сер-Мет-Глу (ОТБ)Гис-Фен-Арг-Три-глутаминовой кислоты и

451 мг Лиз (БОК) -Про-Вал-Глу-Лиз (БОК)Лиз(БОК)-Лиз(БОК)- Лиз(БОК)- Про - ВалЛиз (БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ суспендируют в

4 мл абсолютного пиридина и после добавки

0,15 мл воды и 0,32 мл 1 н. соляной кислоты перемешивают при 50 С 10 мин. Затем в мутную суспензию добавляют 145 мг дициклогексилкарбодиимида и после отстаивания в течение 3 час еще раз добавляют такое же количество. Перемешивают 3 час при 50 С и затем о1стдищют в теченце ночи. Выпавшую в оса20

С5 док дициклогексилмочевину отфильтровывают и трижды промывают по 0,8 мл 90 /о-ным пиридином. В фильтрат добавляют 45 мл бензола, причем выпадает порошкообразный сырой продукт, который отфильтровывают и сушат при 45 С. Путем переосаждения из метанолбензол-петролейного эфира выделяют наибольшую часть липофильных примесей, после чего проводят окончательную очистку распределением по Крейгу в системе растворителей метанол — буфер — хлороформ — четыреххлористый углерод — 10:3,17:5:4 (буфер применяют согласно п. 2) по 300 стадиям с фазовыми объемами по 10 мл. Из распределительных элементов М8 51 — 85 (14„,„,=67, к=0,29) путем концентрирования досуха и сублимации ацетата аммония при 40 С под высоким вакуумом выделяют 445 г хроматографически чистого защищенного тетраикосапептидацетата в виде аморфного порошка с т, пл. 205 — 210 С (с разл.). Продукт на силикагели дает следующие значения Rf: (43A) 0,63 (100) 0,60 (хлороформ — метанол — 75:25) 0,42.

8). D-Сер-Тир-Сер-Мет-Глу-Гис-Фен - AprТри-Глу-Лиз-Про-Вал-Глу-Лиз-Лиз-Лиз - ЛизПро-Вал-Лиз-Вал - Тир - пролин (D - Сер4Лиз47 18 pi 24-кортикотропин).

370 мг защищенного производного тетраикосапептида растворяют в 7,4 мл 90%-ной трифторуксусной кислотой и отстаиваютпри 25 С

45 мин. Затем раствор концентрируют до 2 мл, разбавляют 20 мл воды, еще раз концентрируют и, наконец, лиофилизируют. Получают трифторацетат свободного тетракозапептида, который для преобразования в ацетат растворяют в небольшом количестве воды и фильтруют в виде ацетата через колонну (Ф = 12,5 мм, i=15 см) со слабоосновным ионообменником, например Мерк=11. Элюат концентрируют до

3 мл, лиофилизируют и сушат под высоким вакуумом при 40 С. Получают 316 мг хроматографически и электрофоретически однородного ацетата D = Сер4-Лиз47->8+-84-кортикотропина в виде белого аморфного порошка.

По тонкослойной хроматограмме на окиси алюминия в системе 101 соединение дает значение Rf 0,40 (p»4-кортикотропин при таких же условиях дает 0,51). При электрофорезе (16 об/см) цри рН 6,1 (пиридинацетатный буфер) продукт переходит на 8,4 см к катоду в течение 2 час.

Предмет изобретения

Способ получения пептидов D-серил4-лизил47 вЂ>8 р 84-кортикотропина или D-серил4глутаминил8-лизил47 48-р4 84-кортикотропина и их амидов, отличаюи4ийся тем, что защищенный декапептид D-серил-тирозил-серил-метионил-глутамил (глутаминил) -гистидил-фенилаланил-аргинил-триптофил-глицин конденсируют известным способом, например карбодиимидным или методом смешанных ангидри245680

Составитель А, Акимова

Редактор Л. А. Ильина Техред А. А. Камышникова Корректоры: T. И. Горбанова н Л. Голованова

Заказ 2298/18 Тираж 480 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Центр, пр. Серова, д. 4

Типография, пр. Сапунова, 2 дов, с эфиром или амидом тетрадекапептида лизил-пролил-валил-глицил-лизил - лизил - лизил-лизил-пролил-валил-лизил-валил- тирозилпролина или с пептидами разной длины, боковые группы которых защищены, с последующим отцеплением защитных групп известным способом, например обработкой трифторуксус,ной кислоты.