Способ дифференциальной диагностики вирусного гепатита с

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к инфекционным болезням. Способ обеспечивает повышение точности дифференциальной диагностики вирусного гепатита С. Проводят выявление антител и специфических иммунных комплексов, при этом в иммуноферментном тесте определяют антитела к неструктурным белкам (NS4) как в свободном виде, так и в составе иммунных комплексов, промывают параллельно буферным раствором и 6М раствором мочевины, затем определяют авидность этих антител и дифференцируют острую форму гепатита С по увеличению уровня антител на 12%, а хроническую форму по уменьшению их в пределах 50-90%. 2 табл.

Изобретение относится к медицине и, в частности, к диагностике вирусного гепатита С.

Вирусный гепатит С является актуальной проблемой во всем мире, так как его носителей насчитывается более 500 млн. человек. В последние годы отмечается существенный рост заболеваемости гепатитом С в России среди подростков, молодых лиц до 29 лет, в том числе и женщин детородного возраста. Возможность передачи инфекции от инфицированной матери новорожденному ребенку делает данную проблему еще более социально значимой. Вирус гепатита С поражает человека и вызывает инфекцию, которая может протекать как в острой, так и в хронической форме. Острый гепатит С регистрируется существенно реже, но его своевременная диагностика очень важна, так как раннее начало противовирусной терапии влияет на исход заболевания.

Хронический гепатит представляет основную клиническую форму вирусного гепатита С. Однако эти больные не однородны и в зависимости от активности вирусного процесса делятся на две группы с репликацией вируса и без репликации, принципиально отличающиеся между собой по подходам в тактике лечении и наблюдения. Однако критерии дифференциальной диагностики острой, хронической формы и фаз активности процесса вирусного гепатита С до настоящего времени остаются недостаточно разработанными. Установление данных показателей является крайне необходимым для клиницистов, так как позволяет не только правильно оценить течение инфекционного процесса, но и определить тактику ведения и лечения больного, а также прогнозировать исход заболевания.

Вирус гепатита С сложен по своей структуре, он относится в роду Flaviviridae и представляет собой РНК-содержащий вирус с наличием нескольких собственных белков в структуре вириона. Размножение вируса происходит в клеточных структурах организма человека, в основном, в гепатоцитах и сопровождается синтезом структурных вирусных белков и нескольких неструктурных белков (NS2, NS3, NS4, NS5), не встраивающихся в структуру вируса, но способствующих его репродукции. Развитие острого инфекционного процесса при гепатите С сопровождается образованием антител к структурным и неструктурным белкам (Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты, 2-е изд. - СПб, 1998, с.201-245; Lemon S.M. Targeting the achilles‘ heel of hepatitis С virus. - Hepatology, 1997, v.25, №4, p.1035-1037).

В настоящее время известны различные способы диагностики вирусного гепатита С и прежде всего по выявлению в сыворотке антител к сумме белков вируса гепатита С и РНК-HCV. Однако наличие суммарных антител не позволяет отличить текущую вирусную инфекцию от прошедшей, так как они выявляются как у больных острым, так и хроническим гепатитом С, а также длительно у лиц с пастинфекцией. Обнаружение РНК-HCV указывает лишь на репликацию вируса, которая может иметь место и при остром, и при хроническом заболевании, не разграничивая их между собой (Yoshimura E., Hayashi J., Ueno К. et al. "No significant changes in levels of hepatitis С virus (HCV) RNA by competitive polimerase chain reaction in blood samples from patients with chronic HCV infection", Dig.Dis. Sci., 1997, v.42, №4, p.772-777).

Следует отметить, что определение РНК проводится методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в больших вирусологических и генно-инженерных лабораториях, требующих крупных материальных затрат. Кроме того, постановка ПЦР сложна, а ее результаты не дают конкретного ответа о наличии или отсутствии синтеза полноценного вириона, а также не раскрывают многие вопросы патогенеза, в частности включения вирусных частиц в структуру иммунных комплексов. Несмотря на высокую чувствительность, метод ПЦР не является абсолютно специфичным и точным, так как дает сомнительные результаты не менее чем в 10-15% случаев.

С целью дифференциальной диагностики острой и хронической формы вирусного гепатита С используют определение авидности антител к структурным белкам вируса гепатита С (Wreghitt T.G. Gray J.J. "Antibody avidity test for recent infection with hepatitis С virus", Lancet, 1990, Mar.31, p.789; Leon P., Lopes J.A. et al. "Detection of low-avidity IgG antibodies in the diagnosis of primary acute infection by hepatitis С virus", Enferm Infect.Microbiol.Clin., 1997, v.15, №1, p.14-18). При острой форме синтезируются слабоавидные антитела, в то время как при хронизации процесса они становятся высокоавидными.

Однако степень авидности антител к неструктурным белкам исследователями пока не установлена. В то же время неструктурные белки являются важными звеньями в репродукции вируса, и определение свойств антител к этим белкам может оказаться полезным для суждений о патогенезе вирусного гепатита С.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ диагностики гепатита С путем выявления специфических иммунных комплексов (СИК) и определения в них антител класса IgM, IgG и различных фракций комплемента (Sansonno D., Iacobelli A.R. et al. "Immunochemical and biomolecular studies of circulating immune complexes isolated from patients with acute and chronic hepatitis С virus infection", Eur. Clin. Invest., 1996, v.26, №6, p.465-475; Troisi C.L., Hollinger F.B. "Detection of antibodies to hepatitis С virus in seronegative patients using an immune complex dissociation assay", J. Viral Hepat., 1997, v.4, №6, p.383-386). Способ основан на хроматографическом выделении специфических иммунных комплексов в градиенте плотности сахарозы с последующим их кислотным расщеплением и тестированием полученных составляющих в иммуноферментном методе.

Метод позволяет выявлять такие комплексы и при остром, и при хроническом гепатите С, но дифференцировать эти формы по его результатам не представляется возможным.

Данный способ не позволяет определять антитела к ранним неструктурным белкам как начальному процессу синтеза вирионов, которые появляются на ранних сроках острого процесса и определяются в высоком титре. Более того, не исследуется авидность антител к неструктурным белкам (NS4), что чрезвычайно важно для понимания процесса диссоциации специфических иммунных комплексов в организме и диссеминации вируса гепатита С. Он достаточно трудоемок и вследствие этого не обладает достаточной точностью.

Предлагаемый способ позволяет устранить указанный недостаток, технический результат его заключается в повышении точности.

Это достигается тем, что в иммуноферментном тесте определяют антитела к неструктурным белкам (NS4) как в свободном виде, так и в составе иммунных комплексов, промывая параллельно фосфатно-солевым буферным раствором (ФСР) и 6М раствором мочевины. После расщепления специфического иммунного комплекса 6М мочевиной устанавливают авидность этих антител и диагностируют острую форму гепатита С по увеличению уровня антител на 12%, а хроническую форму по уменьшению их в пределах 50-90% при сравнении показателей оптической плотности в лунках, промытых 6М мочевиной и ФСР.

Эти две характеристики - антитела к неструктурному белку и их авидность -дифференцируют острую форму инфекции от хронической.

При острой форме, при которой антитела как к структурным, так и неструктурным белкам находятся в составе специфического иммунного комплекса, отмывание 6М мочевиной приводит к разрыву комплекса из-за низкой авидности этих антител и вторичной сорбции их на подложке. Это позволяет дифференцировать развивающийся процесс, сопровождающийся репродукцией вируса, от инфекционного процесса, имеющего длительную историю и не сопровождающегося вирусной репродукцией, при котором антитела к структурным белкам обладают высокой авидностью и не включаются в состав комплексов вирус - антитело по причине отсутствия или малого количества вирусных частиц.

Антитела же к неструктурным белкам включены в состав низкоавидного иммунного комплекса и легко отщепляются от него, давая увеличение экстинции при отмывании мочевиной по сравнению с буферным раствором.

При отмывании 6М мочевиной увеличение показателя ОП в ИФА объясняется разрушением комплекса антител к неструктурному белку NS4 с этим белком, так как молекулярная масса белка меньше, чем суммарная масса того же белка в составе иммуносорбента. Это происходит в случае, если авидность таких антител низкая. Часть антител после разрушения СИК остается на поверхности лунки, связавшись с адсорбированным в них неструктурным белком, что увеличивает ОП раствора после завершения субстрат-ферментной реакции.

При хроническом гепатите С без репликации вируса и биохимической активности процесса показатели ОП в лунках, промытых 6М мочевиной, по сравнению с лунками, промытыми только ФСР, либо не меняются, либо уменьшаются до 50% от исходного уровня, что характеризует наличие в сыворотке крови высокоавидных антител в свободном состоянии (Leon P., Lopes J.A. et al. "Detection of low-avidity IgG antibodies in the diagnosis of primary acute infection by hepatitis С virus", Enferm Infect.Microbiol.Clin. l997, v.l5, №1, p.14-18).

В заявляемом способе обязательно использование 6М мочевины, так как только при такой ее концентрации СИК разрушаются минимально и диссоциируют только связи между неструктурным белком и антителами, находящимися в структуре иммунного комплекса. Повышение концентрации мочевины приводит к разрушению комплекса между антителами и белком, находящимся на поверхности лунок микропланшета. В таком случае выявление антител, вышедших из специфического иммунного комплекса и характеризующих его наличие и концентрацию, невозможно, так как отмываются суммарные антитела как из комплекса, так и находящиеся в крови в свободном состоянии.

Способ осуществляется следующим образом.

Сыворотки крови больных гепатитом С, разведенные в 10 раз, вносятся в объеме 100 мкл в 2 параллельных ряда лунок микропланшета с адсорбированным неструктурным белком NS4. Через 40 мин контакта один ряд лунок промывают 3-кратно раствором 6М мочевины и 2-кратно ФСР, а лунки 2 ряда (контрольные) - промывают 5-кратно только ФСР. В дальнейшем во все лунки вносят человеческий антиглобулин, меченный пероксидазой хрена, в объеме 100 мкл и инкубируют в термостате при 37С 20 мин. Далее после пятикратной промывки всех лунок ФСР в них вносят по 100 мкл субстратного раствора - ортофенилендиамина в 5% растворе перекиси водорода. После 15-минутного контакта при 20-22С реакцию останавливают 50 мкл 1М раствора серной кислоты.

Результаты реакции учитывают на иммуноферментном анализаторе любой фирмы при длине волны 492 нм и сравнивают показатели оптической плотности (ОП) растворов в лунках 2-х параллельных рядов, отмытых 6М мочевиной и ФСР соответственно. При увеличении показателя ОП в лунках, промытых 6М мочевиной, по сравнению с ОП в лунках, промытых только ФСР, на 12% и более результат считают положительным в отношении наличия в крови слабоавидных антител как к соr-белку, так и к белку NS4 в структуре СИК. При снижении показателя в пределах 50-90% - наличия свободных антител высокой авидности к структурному белку вируса гепатита С.

Заявляемый метод был испытан в клинике вирусных гепатитов НИИ детских инфекций на 33 детях, больных с острой и хронической формой вирусного гепатита С.

При острой форме гепатита С, подтвержденной положительными показателями уровня общих антител к белкам вируса гепатита С и наличием РНК вируса, увеличение показателей ОП выше 12% в лунках, промытых 6М мочевиной, свидетельствующее о разрушении специфического иммунного комплекса и задержке части антител на иммуносорбенте, выявлено у 3 больных из 6 (50%).

В противоположность этому при хронической форме такое увеличение ОП не было зафиксировано ни у одного больного, а свободные высокоавидные антитела выявлялись у 14 больных из 19 (74%) (таблица 1).

Заявляемый способ может быть подкреплен примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Больная Л.А., 11 лет, находилась в клинике НИИДИ в октябре 2001 г. с диагнозом "Хронический вирусный гепатит С" с целью обследования и выбора тактики терапии. Впервые Гепатит С выявлен в мае 1999 г. случайно (обследование в поликлинике в связи с высевом токсигенной BL). Заболевание протекало малосимптомно с умеренной гиперферментемией. В анализах при поступлении - АлАТ- 135, АсАТ- 98, обнаружены антитела к общим белкам гепатита С в иммуноферментном тесте с ОП - 2,515, к структурным белкам - с ОП 1,486. При обследовании заявляемым способом показатель ОП реакции на антитела к структурному соr-белку в лунке, промытой ФСР, - 0,153 (ниже уровня негативного контроля), а в лунке, промытой 6М мочевиной, - 1,016 (увеличение ОП на 664%). На основании полученных данных установлена репликативная фаза хронического вирусного гепатита С, что в дальнейшем было подтверждено положительным результатом на PHK-HCV в ПЦР.

Пример 2. Больная С.А., 2 года. Поступила в НИИДИ в мае 1999 г. с диагнозом "Хронический вирусный гепатит С" для обследования и выбора тактики терапии. В анамнезе с 3-месячного возраста периодическая гиперферментемия, наличие суммарных анти-HCV и PHK-HCV (+) в 1 год. В клинических анализах выявлены следующие показатели: АлАТ- 68 ЕД/Л, АсАТ- 38 ЕД/л, антитела к общим белкам вируса гепатита С в иммуноферментном тесте с ОП - 1,251, к структурным белкам - с ОП 0,803. При обследовании заявляемым способом ОП реакции на антитела к cor-белку в лунке, промытой ФСР, - 0,546, а в лунке, промытой 6М мочевиной, - 0,406 (снижение ОП на 25,6%). Установлена хроническая форма вирусного гепатита С без репликации вируса, что было подтверждено отрицательным результатом на PHK-HCV в ПЦР.

Пример 3. Больная Н.К., 14 лет. Поступила на лечение в НИИДИ с диагнозом “Вирусный гепатит С, желтушный вариант” в августе 1999 г. Заболела остро, появились желтушность кожи, темная моча. В анамнезе операция на позвоночнике с гемотрансфузией. При осмотре симптомы интоксикации умеренные, иктеричность кожи и склер, гепатомегалия до 1,5-2 см. В анализах: АлАТ - 1780,0 ЕД/л, АсАТ - 1570,0 ЕД/л, билирубин - 82,6 мкмоль/мл. Выявлены антитела к общим белкам вируса гепатита С в иммуноферментном тесте с ОП - 1,765, к структурным белкам - с ОП 1,296. При обследовании заявляемым способом ОП реакции на антитела к неструктурному белку NS4 в лунке, промытой ФСР, - 0,126, а в лунке, промытой 6М мочевиной, - 0,211 (увеличение на 60%), что свидетельствует об острой форме вирусного гепатита С с репликацией вируса, которая подтверждена обнаружением положительным результатом на PHK-HCV в ПЦР.

Сопоставление уровня специфического иммунного комплекса в заявляемом способе при острой форме вирусного гепатита С и свободных высокоавидных антител к структурному соr-белку при хронической форме установило зависимость этих показателей от клинической картины заболевания. Так, снижение активности воспалительного процесса в печени и нормальзация ферментов (АлАт и АсАТ) при хронизации инфекции всегда сопровождается обнаружением свободных антител в высоком титре. В то же время активный процесс с выраженной гиперферментемией сопровождается увеличением показателей ОП в лунках, промытых 6М мочевиной, по сравнению с лунками, промытыми ФСР, что свидетельствовует о присутствии в крови таких больных специфического иммунного комплекса и связанных антител (таблица 2).

Способ прост и легко воспроизводим при наличии тест-системы для иммуноферментного выявления антител к неструктурному белку NS4 вируса гепатита С. Возможно его применение для установления формы вирусного гепатита С у больных без определения РНК вируса в ПЦР, для воспроизведения которой нужна специальная аппаратура и обученные специалисты.

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики вирусного гепатита С путем выявления антител и специфических иммунных комплексов, отличающийся тем, что в иммуноферментном тесте определяют антитела к неструктурным белкам (NS4) как в свободном виде, так и в составе иммунных комплексов, промывают параллельно буферным раствором и 6М раствором мочевины, затем определяют авидность этих антител и дифференцируют острую форму гепатита С по увеличению уровня антител на 12%, а хроническую форму по уменьшению их в пределах 50-90%.