Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)

 

Изобретение относится к биотехнологии. L-треонин и L-валин получают культивированием бактерии Escherichia coli. После накопления L-аминокислот их извлекают из культуральной жидкости. В качестве штамма продуцента используют штамм, способность к продукции L-аминокислоты которого дополнительно увеличена за счет повышения активности белка, кодируемого геном b 1242. В качестве штамма - продуцента L-треонина может быть использован штамм Escherichia coli VL2054(pYCHE), а в качестве продуцента L-валина - Escherichia coli H-81(pYCHE). Изобретение позволяет получать L-аминокислоты с высокой степенью эффективности. 3 с. и 4 з.п.ф-лы, 1 ил., 3 табл.

Область техники.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения L-аминокислот методом ферментации, и, более конкретно, к генам, полученным из бактерии Escherichia соli. Указанные гены позволяют улучшить продукцию L-аминокислот, например L-треонина и L-валина.

Предшествующий уровень техники Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (см. , например, выложенную патентную заявку Японии 56-18596 (1981), WO 95/16042 или патенты США 5661012 и 6040160).

С другой стороны, повышенная экскреция L-аминокислот может увеличить продуктивность штамма, продуцирующего L-аминокислоту. Описан штамм бактерии, принадлежащей к роду Corynebacterium, обладающей повышенной экспрессией гена экскреции L-лизина (ген lysE) (WO 9723597A2). Кроме того, описаны гены, кодирующие белки, способные к секреции L-цистеина, L-цистина, N-ацетилсерина или производных триазолидина (патент США 5972633).

К настоящему времени описаны несколько генов, кодирующих, как предполагается, мембранные белки, которые увеличивают продукцию L-аминокислот. Дополнительная копия гена rhtB делает бактерию более устойчивой к L-гомосерину и увеличивает продукцию L-гомосерина, L-треонина, L-аланина, L-валина и L-изолейцина (Европейская патентная заявка ЕР994190А2). Дополнительная копия гена rhtC делает бактерию более устойчивой к L-гомосерину и L-треонину и увеличивает продукцию L-гомосерина, L-треонина и L-лейцина (Европейская патентная заявка ЕР1013765А1). Дополнительные копии генов yahN, yeaS, yfiK, и yggA увеличивают продукцию L-глутаминовой кислоты, L-треонина, L-аланина, L-гистидина, L-пролина, L-аргинина, L-валина и L-изолейцина (Европейская патентная заявка ЕР1016710А2). И хотя нуклеотидная последовательность всего генома Escherichia coli К-12 описана (Blattner F.R., Plunkett G., Bloch C.A. et al., Science, 227, 1453-1474, 1997; ftp://ftp.genetics.wise. edu/pub/sequence/ecolim52.seq.gz), существует множество открытых рамок считывания, функция которых остается неизвестной.

Описание изобретения Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов, продуцирующих L-аминокислоты, и предоставление способа получения L-аминокислот, например L-треонина и L-валина, с использованием указанных штаммов.

Данная цель была достигнута путем идентификации генов, кодирующих белки, которые не вовлечены в пути биосинтеза целевых L-аминокислот, но увеличивают их продукцию. Примером такого белка может являться мембранный белок, обладающий активностью, обеспечивающей экскрецию L-аминокислот. При анализе нуклеотидной последовательности полного генома Escherichia coli были отобраны белки с 4 или более предполагаемыми трансмембранными сегментами (ТМС). В результате тщательного исследования авторы настоящего изобретения идентифицировали среди них два гена, такие как b2682 и b2683, и тщательно изучили их. Гены b2682 и b2683 были известны как предполагаемые кодирующие последовательности, которые могут кодировать белки с неизвестной функцией (номера нуклеотидов с 92 по 829 и с 819 по 1154 в нуклеотидной последовательности под номером АЕ000353 U00096 в Genbank, соответственно). Ген b2683 также известен как ygaH. Также авторы настоящего изобретения установили, что при повышении активности белков, кодируемых генами b2682 и b2683, увеличивается продуктивность штаммов, продуцирующих L-аминокислоты. Таким образом было совершено настоящее изобретение.

Настоящее изобретение включает в себя следующее: 1. Бактерия - продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia, в которой продукция L-аминокислоты упомянутой бактерией увеличена за счет повышения активности белков, описанных в пунктах (А) или (В) и (С) или (D), в клетке упомянутой бактерии: (A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 3; (B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 3, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам; (C) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 5; (D) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 5, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам; (здесь и далее, белки, описанные в вышеупомянутых пунктах (А) или (В) и (С) или (D) упоминаются как "белки согласно настоящему изобретению").

2. Бактерия в соответствии с вышеупомянутой бактерией, в которой активности белков, описанных в пунктах (А) или (В) и (С) или (D), повышены путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) или (В) и (С) или (D), или путем изменения регуляции экспрессии нуклеотидной последовательности в хромосоме упомянутой бактерии.

3. Бактерия в соответствии с вышеупомянутой бактерией, в которой трансформация осуществляется с использованием многокопийного вектора.

4. Способ получения L-аминокислоты, включающий выращивание бактерии в соответствии с вышеупомянутой бактерией в питательной среде и сбор из культуральной жидкости полученной и накопленной в ней L-аминокислоты.

5. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором L-аминокислотой является L-треонин.

6. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором у указанной бактерии повышена экспрессия треонинового оперона.

7. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором L-аминокислотой является L-валин.

8. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором у указанной бактерии повышена экспрессия ilv оперона.

Способ получения L-аминокислоты включает продукцию L-треонина с использованием бактерии - продуцента L-треонина, в которой повышены активности белков согласно настоящему изобретению, например, представленных аминокислотными последовательностями, приведенными под номерами 3 и 5. Также способ получения L-аминокислоты включает продукцию L-валина с использованием бактерии - продуцента L-валина, в которой повышены активности белков согласно настоящему изобретению, например, представленных аминокислотными последовательностями, приведенными под номерами 3 и 5.

Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.

Вышеуказанной бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия - продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia, в которой продукция L-аминокислоты указанной бактерией увеличена за счет повышения активностей белков согласно настоящему изобретению в клетке бактерии.

Вышеуказанной бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия - продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia и обладающая повышенной активностью белков, которые увеличивают продукцию целевой L-аминокислоты. Конкретно, бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия - продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia и обладающая повышенной активностью белков согласно настоящему изобретению. Более конкретно, бактерия согласно настоящему изобретению содержит ДНК, в которой повышена экспрессия генов b2682 и b2683 на хромосоме ДНК или на плазмиде в бактерии, обладает повышенной способностью к продукции L-аминокислоты, например L-треонина и/или L-валина.

К белкам согласно настоящему изобретению относятся белки, описанные в следующих пунктах (А) или (В) и (С) или (D): (А) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 3;
(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 3, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам;
(C) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 5;
(D) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 5, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам.

Количество "нескольких" аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Оно может быть от 2 до 24, предпочтительно от 2 до 12, и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А), и от 2 до 11, предпочтительно от 2 до 7, и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (С) соответственно.

Устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам означает способность бактерии к росту на минимальной питательной среде, содержащей L-аминокислоту и/или ее аналог в концентрации, при которой штамм дикого типа или родительский штамм не может расти, или способность бактерии расти с большей скоростью на питательной среде, содержащей L-аминокислоту и/или ее аналог, чем штамм дикого типа или родительский штамм. Примерами аналогов L-аминокислот являются 3,4-дигидропролин, DL-тиаизолейцин, DL-o-метилсерин, 4-азалейцин, норлейцин, L-o-фторфенилаланин и DL-o-фторфенилаланин. Упомянутая выше концентрация L-аминокислоты и ее аналога варьируется значительно (от 0,5 мкг/мл в случае DL-тиаизолейцина до 9600 мкг/мл в случае DL-o-метилсерина) в зависимости от химической структуры используемого соединения. Например, указанная концентрация составляет обычно от 7 до 70 мкг/мл, предпочтительно от 20 до 25 мкг/мл в случае 3,4-дигидропролина; обычно от 0,5 до 5,0 мкг/мл, предпочтительно от 0,9 до 1,1 мкг/мл в случае DL-тиаизолейцина; обычно от 1100 до 9600 мкг/мл, предпочтительно от 3000 до 3500 мкг/мл в случае DL-o-метилсерина; обычно от 15 до 150 мкг/мл, предпочтительно от 40 до 50 мкг/мл в случае 4-азалейцина; обычно от 150 до 1500 мкг/мл, предпочтительно от 450 до 550 мкг/мл в случае норлейцина; обычно от 0,6 до 6,0 мкг/мл, предпочтительно от 1,5 до 2,0 мкг/мл в случае L-o-фторфенилаланина; обычно от 2 до 20 мкг/мл, предпочтительно от 5 до 7 мкг/мл в случае DL-o-фторфенилаланина.

К бактерии согласно настоящему изобретению также относятся бактерии, в которых активности белков согласно настоящему изобретению повышены путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) или (В) и (С) или (D), или путем изменения регуляции экспрессии последовательности указанной ДНК в хромосоме упомянутой бактерии.

Упомянутая ДНК, использующаяся для модификации бактерии согласно настоящему изобретению, кодирует, как предполагается, мембранный белок. Конкретно, упомянутая ДНК кодирует белок с 4 или более трансмембранными сегментами. Такая ДНК может кодировать белки, обладающие активностью по экскреции L-аминокислот. Более конкретно, гены b2682 и b2683 являются такой ДНК. Необходимо отметить, что кодирующий участок гена b2682 в области 728-738 и кодирующий участок гена b2683 в области 1-11 перекрываются. Оба гена могут быть получены, например, с помощью ПЦР с использованием затравок с нуклеотидной последовательностью, приведенной под номерами 1 и 2, в виде единственного продукта.

Анализ последовательности полного генома Escherichia coli позволил выбрать гены, кодирующие белки с 4 и более предполагаемыми ТМС. Белки с известной функцией и транспортеры, описанные Paulsen I.T., Sliwinski M.I., Saier M. H. (J. Mol. Biol. , 1998, 277, 573) и Linton K.J., Higgins C.F. (Molecular Microbiology, 1998, 28(1), 5), исключили из группы, подлежащей изучению. В результате тщательного отбора среди оставшихся генов были выбраны несколько генов, кодирующих, как предполагалось, мембранные экспортеры. И было обнаружено, что повышенная экспрессия генов b2682 и b2683 увеличивает продукцию L-аминокислот штаммами - продуцентами L-аминокислот.

К ДНК согласно настоящему изобретению относится ДНК, кодирующая белок, включающий делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в одно или несколько положений белка (А) или (С) при условии, что они не приводят к утрате активности указанного белка. Хотя количество "нескольких" аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка, оно может быть от 2 до 24, предпочтительно от 2 до 12, и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А), и от 2 до 11, предпочтительно от 2 до 7, и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (С) соответственно. ДНК, кодирующая практически такой же белок, как белок, описанный в пунктах (А) и (С), может быть получена, например, путем модификации нуклеотидной последовательности, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) и (С), с использованием сайт-направленного мутагенеза таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков будут удалены, заменены, введены или добавлены. Модифицированная подобным образом ДНК может быть получена традиционными методами, использующими обработку химическими реагентами и содержание в условиях, вызывающих мутации. К подобного рода обработкам относятся обработка ДНК, кодирующей белки согласно настоящему изобретению, с помощью гидроксиламина или обработка бактерии, содержащей ДНК, с помощью УФ излучения или химического реагента, такого как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.

К ДНК согласно настоящему изобретению относятся варианты, которые могут быть найдены в различных штаммах или вариантах бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, в виду природного разнообразия. ДНК, кодирующая подобные варианты, может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется с генами b2682 и b2683 или частью указанных генов в жестких условиях, и которая кодирует белок, увеличивающий продукцию L-аминокислот. Термин "жесткие условия", упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру ДНК, обладающие гомологией не менее 70% друг относительно друга. В качестве варианта, примером жестких условий являются условия, соответствующие условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 60^oС, 1xSSC, 0,1% SDS, предпочтительно 0,1xSSC, 0,1% SDS. В качестве зонда, для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с генами b2682 и b2683, также может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 3 или номером 5, соответственно. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 3 или номером 5, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 3 или номером 5, в качестве матрицы. В случае, когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50^oС, 2xSSC и 0,1% SDS.

Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок, означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, с помощью традиционных методов, для того, чтобы усилить экспрессию генов, кодирующих белок согласно настоящему изобретению, и повысить активность белка в клетке бактерии.

К методам увеличения экспрессии генов относятся методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает число копий указанного гена. Для подобных целей могут быть предпочтительно использованы многокопийные векторы. Примерами многокопийных векторов являются pBR322, pMWl19, pUC19, pET22b и подобные им.

Кроме того, усиление экспрессии гена может быть достигнуто путем введения некоторого числа копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации или подобным.

В случае, когда добиваются усиления экспрессии двух или более генов, указанные гены могут быть расположены вместе на одной и той же плазмиде или раздельно на различных плазмидах. Также допустимо, чтобы одни из генов располагались в хромосоме, а другие гены располагались на плазмиде.

С другой стороны, усиление экспрессии генов может быть достигнуто помещением ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора. Например, в качестве сильных промоторов известны lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_L и P_R промоторы фага лямбда. Использование сильного промотора может быть совмещено с увеличением числа копий гена.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-аминокислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-аминокислоты. В качестве родительских штаммов, в которых активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, могут быть использованы бактерии - продуценты L-треонина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как VL2054 (ВКПМ В-8067), ВНИИГенетика 472Т23 (патент США 5631157), ВКПМ В-3996 (патенты США 5175107 и 5976843), КССМ-10132 (WО009660A1), КССМ-10133 (WО009661A1) или подобные. Также, в качестве родительских штаммов, в которых активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, могут быть использованы бактерии - продуценты L-валина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как Н-81 (ВКПМ В-8066), NRRL В-12287 и NRRL В-12288 (патент США 4391907), ВКПМ В-4411 (патент США 5658766), ВКПМ В-7707 (европейская патентная заявка ЕР1016710А2) или подобные.

В бактерии согласно настоящему изобретению в дальнейшем может быть усилена экспрессия одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-аминокислот. Примерами таких генов для бактерии - продуцента L-треонина являются гены треонинового оперона, предпочтительно ген, кодирующий аспартаткиназу-гомосериндегидрогеназу, чувствительность к ингибированию L-треонином по типу обратной связи в которой утрачена (патент Японии 1-29559), для бактерии - продуцента L-валина - гены оперона ilvGMEDA, в котором предпочтительно не экспрессируется треониндезаминаза, и аттенуация которого подавлена (выложенная патентная заявка Японии 8-47397).

К способам согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-треонина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-треонина в указанной питательной среде, и сбора L-треонина из культуральной жидкости. Также к способам согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-валина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-валина в указанной питательной среде, и сбора L-валина из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, сбор и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, которые требуются микроорганизму для роста. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от степени ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок используются монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные соединения.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание, ферментация с аэрацией, при температуре от 20 до 40^oС, предпочтительно от 30 до 38^oС. рН питательной среды находится в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6,5 до 7,2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевая L-аминокислота может быть собрана и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

Краткое описание чертежей
На чертеже показана схема конструирования плазмиды placZ.

Наилучший способ осуществления изобретения
Настоящее изобретение более детально описано со ссылкой на примеры. В указанных примерах аминокислоты являются аминокислотами L-конфигурации, если не указано иное.

Пример 1. Клонирование генов b2682 и b2683 на плазмиде placZ.

Для клонирования генов b2682 и b2683 был использован вектор placZ. Вектор placZ является производным вектора pET-22b(+) (Novagen, Madison, WI, USA). Вектор pET-22b(+) был обработан рестриктазами BglII и ХbаI и лигирован с фрагментом полимеразной цепной реакции (ПЦР), полученным на плазмиде рМВ9-lас (Fuller F., Gene, 19, 43-54, 1982), обработанным теми же рестриктазами и содержащим промотор P_lacUV5. Для амплификации с помощью ПЦР фрагмента с промотором P_lacUV5 использовались затравки, приведенные под номерами 7 и 8. В полученную плазмиду была вставлена структурная часть гена lacZ (237 пар оснований без промотора) путем клонирования SalI-BamHI фрагмента плазмиды pJEL250 (Дымакова Е. и др., Генетика, 35, 2, 181-186, 1999). Схема конструкции вектора placZ показана на чертеже.

Исходным материалом для клонирования предполагаемых рамок считывания b2682 и b2683 из Е.coli (генов b2682 и b2683) был фрагмент ПЦР, полученный с использованием ДНК из штамма Е. coli TG1 в качестве матрицы. Для синтеза этого фрагмента были использованы две затравки, нуклеотидная последовательность которых приведена под номерами 1 и 2. ПЦР осуществлялась на "Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400" в следующих условиях: 40 секунд при 95^oС, 40 секунд при 47^oС, 40 секунд при 72^oС, 30 циклов. Таким образом был получен линейный фрагмент ДНК длиной 1158 пар оснований, содержащий гены b2682 и b2683. Данный фрагмент ПЦР был обработан рестриктазами ХbаI и ВаmHI и введен в многокопийный вектор placZ, предварительно обработанный теми же рестриктазами.

Полученная плазмида, содержащая фрагмент ПЦР, была названа как pYGAZH и содержала гены b2682 и b2683 под контролем лактозного промотора (P_lacUV5).

Пример 2. Влияние амплифицированных генов b2682 и b2683 на устойчивость штамма Е.coli TG1 к аминокислотам и их аналогам.

Штамм Е. coli TG1 (pYGAZH) и штамм Е.coli TG1, содержащий вектор без вставки, (контрольный штамм) выращивались в течение ночи в среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ночные культуры всех штаммов были разбавлены в 25 раз свежей средой LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и ИПТГ (0,5 мМ), и инкубировались в течение 2 ч при 37^oС с аэрацией. Культуры в фазе логарифмического роста были разбавлены 0,9% раствором хлорида натрия и около 1000 клеток были высеяны на чашки с твердой питательной средой Адамса, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), ИПТГ (0,5 мМ) и аминокислоту или ее аналог. После 2-4 дней инкубации при 37^oС определялись различия в размере колоний или их числе между штаммом TG1, содержащим гибридную плазмиду, и контрольным штаммом TG1. Результаты экспериментов представлены в табл. 1.

Пример 3. Продукция треонина штаммом, содержащим плазмиду pYGAZH.

Штамм VL2054 - продуцент треонина был трансформирован плазмидой pYGAZH, содержащей гены b2682 и b2683 под контролем промотора P_lacUV5. Полученный штамм был назван VL2054(pYGAZH). Штамм VL2054 является производным штамма ВКПМ В-3996 и содержит на хромосоме:
а) интегрированный треониновый оперон под контролем промотора P_R;
б) нативный ген rhtA;
в) инактивированный хромосомный ген, кодирующий треониндегидрогеназу (ген tdh}, и инактивированный ген устойчивости к канамицину (ген kan) в Тn5 (tdh::Tn5, Kan^s);
г) мутацию ilA₄₄₂.

Штамм VL2054 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 30 января 2001 года под инвентарным номером ВКПМ В-8067.

5 колоний каждого из штаммов VL2054, VL2054(placZ) в качестве контрольного штамма, содержащего плазмиду без вставки, и VL2054(pYGAZH) были суспендированы в 2 мл минимальной питательной среды ((NH₄)₂SО₄ - 11 г/л, NaCl - 0,4 г/л, MgSО₄ - 0,4 г/л, К₂НРО₄ - 1 г/л, FeSО₄ - 10 мг/л, MnSО₄ - 10 мг/л, тиамин - 0,1 мг/л, дрожжевой экстракт - 0,5 г/л, глюкоза - 40 г/л и ампициллин - 300 мг/л, если необходимо) в 20 мл пробирках и инкубировались в течение ночи с аэрацией при 32^oС. 0,2 мл каждой ночной культуры были перенесены в три 20 мл пробирки с 2 мл свежей среды для ферментации с или без ИПТГ и выращивались при 32^oС в течение 48 или 72 ч на роторной качалке.

Состав среды для ферментации:
(NH₄)₂SО₄ - 22 г/л
NaCl - 0,8 г/л
MgSО₄ - 0,8 г/л
К₂НРО₄ - 2,0 г/л
FeS04
20 мг/л - MnSО₄ - 20 мг/л
Тиамин - 0,2 мг/л
Дрожжевой экстракт - 1,0 г/л
СаСО₃ - 30 г/л
Глюкоза - 80 г/л
Ампициллин - 300 мг/л, если необходимо
ИПТГ - 0,5 мМ, если необходимо
После выращивания стабильность плазмиды и оптическая плотность культуральной жидкости при 540 нм были определены традиционными методами. Накопленное в культуральной жидкости количество треонина было определено с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Состав подвижной фазы для ТСХ следующий: изопропанол - 50 мл, ацетон - 50 мл, NH₄ОH (30%) - 12 мл, H₂O - 8 мл. Результаты приведены в табл. 2. Как видно, гибридная плазмида pYGAZH увеличивала накопление треонина штаммом VL2054 - продуцентом треонина.

Пример 4. Продукция валина штаммом, содержащим плазмиду pYGAZH.

Штамм Н-81 - продуцент валина был трансформирован плазмидой pYGAZH, содержащей гены b2682 и b2683 под контролем промотора P_lacUV5.

Штамм Н-81 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 30 января 2001 года под инвентарным номером ВКПМ В-8066.

5 колоний каждого из штаммов Н-18, Н-81(р1асZ) в качестве контрольного штамма, содержащего плазмиду без вставки, и H-81(pYGAZH) были суспендированы в 2 мл минимальной питательной среды ((NH₄)₂SО₄ - 18 г/л, K₂HPO₄ - 1,8 г/л, MgSO₄ - 1,2 г/л, тиамин - 0,1 мг/л, дрожжевой экстракт - 0,5 г/л, глюкоза - 60 г/л, ампициллин - 300 мг/л, если необходимо) в 20 мл пробирках и инкубировались в течение ночи с аэрацией при 32^oС. 0,2 мл каждой ночной культуры были перенесены в три 20 мл пробирки с 2 мл свежей среды для ферментации с или без ИПТГ, и выращивались при 32^oС в течение 48 или 72 ч на роторной качалке.

Состав среды для ферментации:
(NH₄)₂SО₄ - 18 г/л
К₂НРO₄ - 1,8 г/л
MgSО₄ - 1,2 г/л
СаСО₃ - 20 г/л
Тиамин - 0,1 мг/л
Глюкоза - 60 г/л
Ампициллин - 300 мг/л, если необходимо
ИПТГ - 0,5 мМ, если необходимо
После выращивания стабильность плазмиды и оптическая плотность культуральной жидкости при 540 нм были определены традиционными методами. Накопленное в культуральной жидкости количество валина было определено с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Состав подвижной фазы для ТСХ следующий: изопропанол - 80 мл, этилацетат - 80 мл, NH₄OH (30%) - 15 мл, Н₂О - 45 мл. Результаты приведены в табл. 3. Как видно, гибридная плазмида pYGAZH увеличивала накопление валина штаммом Н-81 - продуцентом валина.

Формула изобретения

1. Способ получения L-треонина или L-валина методом ферментации, включающий стадии выращивания бактерии Escherichia coli - продуцента L-аминокислоты в питательной среде и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют E. coli, способность к продукции L-аминокислоты которой дополнительно увеличена за счет увеличения активности белка, описанного в пункте (А) или (В): (A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 3; (B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 3, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что активность белка повышена путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок, описанный в пункте (А) или (В), или путем изменения регуляции экспрессии последовательности указанной ДНК в хромосоме упомянутой бактерии.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что трансформация осуществляется с использованием многокопийного вектора.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что у упомянутой бактерии дополнительно повышена экспрессия генов треонинового оперона.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что у упомянутой бактерии дополнительно повышена экспрессия ilv оперона.

6. Штамм Escherichia coli VL2054(pYCHE), трансформированный плазмидой, содержащей ген b1242, кодирующий белок по п. 1, - продуцент L-треонина.

7. Штамм Escherichia coli H-81(pYCHE), трансформированный плазмидой, содержащей ген b1242, кодирующий белок по п. 1, -продуцент L-валина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8