Способ получения состава с замедленным высвобождением активного ингредиента

 

Изобретение относится к способу получения соединения I с замедленным высвобождением активного ингредиента, которое включает соединение (А): и полимер, содержащий лактидные, гликолидные мономеры и мономеры винной кислоты в количестве 71-73%, 26-28% и 1-3% соответственно, а аминогруппа соединения (А) соединена при помощи ионной связи с карбоксильной группой кислотных мономеров полимера, при этом указанный способ включает стадию взаимодействия водного раствора (А) с полимером или его солью в смеси ацетонитрила и воды, в которой весовое соотношение ацетонитрила и воды равно примерно 3 : 1 соответственно, при температуре, примерно равной 0-5^oС, до тех пор, пока образование соединения I не будет завершено; способ получения микрочастиц соединения I путем распыления раствора соединения I в этилацетате в изопропиловый спирт с получением дисперсии микрочастиц соединения I. 2 с. и 5 з.п. ф-лы, 1 ил.

Настоящее изобретение относится к способу получения комплексного соединения с замедленным высвобождением активного ингредиента - Соединения (I), которое включает Соединение (А), имеющее формулу и сополимер, включающий поли-(1)-молочную-гликолевую-винную кислоту (P(1)LGT), причем аминогруппа Соединения (А) связана с карбоксильной группой P(1)LGT ионной связью.

Многие системы доставки лекарственных препаратов были разработаны, испытаны и использованы для контролируемого высвобождения фармацевтических составов in vivo. Например, полиэфиры, такие как поли-DL-молочная кислота, полигликолевая кислота, поли--капролактон, и различные другие сополимеры были использованы для высвобождения биологически активных молекул, например - прогестерона; они имели форму микрокапсул, пленок или стержней (М. Chasin and R. Langer, editors, Biodegradable Ploymers as Drug Delivery Systems, Dekker, NY 1990). После имплантации состава, состоящего из полимера и терапевтического средства, например - подкожно или внутримышечно, терапевтическое средство выделяется в течение определенного периода времени. Такие биосовместимые биоразлагаемые полимерные системы предназначены для того, чтобы обеспечивать диффузию захваченного терапевтического средства из полимерной матрицы. После высвобождения терапевтического средства полимер разлагается in vivo, что исключает хирургическое удаление имплантата. Хотя факторы, способствующие деградации полимера, еще не до конца понятны, считается, что деградацию полиэфиров может регулировать доступность эфирных связей для неферментативного автокаталитического гидролиза полимерных компонентов.

Несколько публикаций ЕРО и Патентов США посвящены проблемам разработки полимерной матрицы и ее роли в регулировании скорости и степени высвобождения терапевтических средств in vivo.

Например, Deluca (публикация ЕРО 0467389 А2) описывает физическое взаимодействие между гидрофобным биоразлагаемым полимером и белком или полипептидом. Образованный состав был смесью терапевтического средства и гидрофобного полимера, который задерживал высвобождение терапевтического средства из матрицы после введения в человека.

Hutchinson (патент США 4767628) регулировал высвобождение терапевтического средства посредством равномерного диспергирования его в полимерном компоненте. Было открыто, что такой состав обусловливает непрерывное регулируемое высвобождение за счет совпадения двух фаз: во-первых, диффузионно-зависимой утечки лекарственного препарата с поверхности состава и, во-вторых, высвобождения через заполненные водой каналы, возникающие при разложении полимера.

В публикации международной заявки, поданной в соответствии с Договором о Патентной Кооперации (РСТ), WO 93/24150 описан состав с замедленным высвобождением терапевтического средства, содержащий пептид с основной группой и полиэфир с концевой карбоксильной группой.

В патенте США 5612052 описаны катионообменные микрочастицы, в типичном случае состоящие из полиэфирных цепей, несущих карбоксильные группы, на которых иммобилизованы основные биоактивные агенты с целью обеспечения системы с контролируемым высвобождением на основе абсорбируемого гелеобразующего жидкого полиэфира.

Соединение (А) описано и заявлено в патенте США 5552520.

В публикации РСТ WO 97/40085 Заявителя описаны биоразлагаемые полиэфиры, содержащие мономеры молочной кислоты, мономеры гликолевой кислоты и мономеры гидроксил-поликарбоксильной кислоты, такой как винная кислота или памоевая кислота, и способы получения указанных полиэфиров. Более конкретно, в заявке описаны сополимеры молочной, гликолевой и винной кислот в соотношении 65/33/2, соответственно.

В публикации РСТ WO 97/15587 Заявителя описаны ионные конъюгаты полиэфиров, имеющих свободные группы -СООН, с биологически активными пептидами, имеющими, как минимум, одну эффективную ионогенную аминогруппу. Более конкретно, в ней открыто преобразование полимеров в поликарбоксильные посредством реакции сополимеров с яблочной или лимонной кислотами. Патент США 5672659 является продолжающей заявкой на национальном уровне по отношению к WO 94/15587. Патент США 5863985 является продолжением патента США 5672659. Находящаяся на рассмотрении Заявка на патент США 09/237405 является частичным продолжением патента США 5863985, который дополнительно описывает полиэфир, который должен включать лимонную кислоту, -капролактон и гликолид; составы, включающие указанный полиэфир и полипептид; полиэфир, который должен включать винную кислоту в качестве одного из мономеров; составы, включающие указанный полиэфир и полипептид; и указанные составы в форме стержней, которые, по выбору, покрывают биоразлагаемым полимером.

В международной публикации WO 97/39738 Заявителя описан способ изготовления микрочастиц из ионного конъюгата с замедленным высвобождением активного ингредиента, описанного в WO 94/15587.

Содержание указанных патентов, заявок и публикаций полностью включено в настоящую работу.

Настоящее изобретение направлено на предпочтительный способ получения предпочтительного примера осуществления ионного конъюгата полимера и Соединения (А) с замедленным высвобождением активного ингредиента, который характеризуется результирующим неожиданным и неочевидным свойством нулевого порядка высвобождения Соединения (А) из конъюгата. Еще одним преимуществом способа согласно настоящему изобретению является то, что использованные растворители не вызывают побочных реакций, и то, что он является менее дорогим при использовании, чем ранее описанный способ.

Фиг. 1 изображает профиль выделения in vivo Соединения (А) из образца Соединения (I) у собаки, причем образец Соединения (I) содержит примерно 11,25% Соединения (А), полимер является сополимером 1-лактида: гликолида: винной кислоты (в соотношении 72:27:1), а Соединение (I) вводят внутримышечно в виде микрочастиц. Термин "облученный образец" относится к образцу Соединения (I), который облучен -излучением от источника, содержащего радиоактивный изотоп кобальта.

Настоящее изобретение направлено на способ получения Соединения (I), где Соединение (I) включает Соединение (А), и полимер, причем полимер содержит лактидные мономеры, гликолидные мономеры и мономеры винной кислоты, доля лактидных мономеров в полимере составляет от 71 до 73%, доля гликолидных мономеров - от 26 до 28% и доля мономеров винной кислоты - от 1 до 3%, а аминогруппа Соединения (А) соединена при помощи ионной связи с карбоксильной группой кислотных мономеров полимера; при этом указанный способ включает стадию реагирования водного раствора Соединения (А) с полимером или его солью в смеси ацетонитрила и воды, в которой весовое соотношение ацетонитрила и воды равно примерно 3 к 1, соответственно, при температуре, примерно равной от 0^oС до 5^oС, до тех пор, пока образование Соединения (I) не будет, по существу, завершено.

Предпочтительным примером осуществления указанного способа является способ, в котором температура реакционной смеси составляет примерно 2,5^oС, и способ включает дополнительную стадию выделения Соединения (I).

В другом аспекте настоящее изобретение включает способ получения микрочастиц Соединения (I), описанного выше, причем указанный способ включает стадии: распыления раствора Соединения (I) в этилацетате в изопропиловый спирт с получением дисперсии микрочастиц Соединения (I), при этом концентрация Соединения (I) в этилацетатном растворе составляет от примерно 8% до примерно 12% (вес/вес); скорость распыления раствора Соединения (I) в изопропиловый спирт из распылителя составляет от примерно 4,9 до примерно 5,1 мл/мин; заданная частота распылителя такова, что распылитель не создает брызг раствора Соединения (I) в этилацетате; объем изопропилового спирта соответствует примерно 20-30-кратному объемному избытку, по сравнению с объемом этилацетата; и температура изопропилового спирта составляет от примерно -60^oС до примерно -78^oС; обеспечения возможности нагрева изопропилового спирта до температуры примерно от 0^oС до 22^oС и выделения указанных микрочастиц из изопропилового спирта.

Предпочтительным примером осуществления указанного способа является способ, в котором скорость распыления примерно равна 5 мл/мин, а объем изопропилового спирта соответствует примерно 20-кратному объемному избытку, по сравнению с объемом этилацетата.

Предпочтительным вариантом осуществления указанного способа является такой способ, в котором полимер содержит примерно 72% лактидных мономеров, примерно 27% гликолидных мономеров и примерно 1% мономеров винной кислоты.

Предпочтительным вариантом осуществления указанного способа является такой способ, в котором микрочастицы имеют средний размер от примерно 10 мкм до примерно 100 мкм.

Предпочтительным вариантом осуществления указанного способа является такой способ, в котором микрочастицы имеют средний размер от примерно 40 мкм до примерно 70 мкм.

Термин "примерно", используемый в настоящей работе по отношению к параметрам или количествам, означает, что параметр или количество находится в диапазоне 5% от указанного значения параметра или количества.

Термин "микрочастица" ("микрочастицы") при использовании в настоящей работе относится к микронному размеру частиц ионного конъюгата, состоящего из Соединения (А) и сополимера молочной, гликолевой и L-(+)- винной кислот, которые предпочтительно имеют, по существу, сферическую форму.

В настоящей заявке аминокислоты обозначены с использованием стандартных трехбуквенных аббревиатур, известных в данной области техники, например, Phe - фенилаланин; Abu - -аминомасляная кислота.

Образование сополимера: Сополимер, состоящий из L-лактида, гликолида и L(+)-винной кислоты, можно получить согласно способам, хорошо известным специалистам в данной области техники и адаптированным для использования в настоящей работе. Соответственно, в реактор загружают мономеры гликолида, L-лактида и L(+)-винной кислоты и раствор 2-этилгексаноата олова (II) в толуоле. Предпочтительно молярные концентрации L-лактида, гликолида и L(+)-виннoй кислоты составляют примерно 72/27/1, соответственно.

L(+)-винную кислоту предпочтительно сушат над силикагелем в сушильном аппарате Абдерхальдена в течение примерно 10 часов. Затем реактор помещают под вакуум при перемешивании для удаления толуола. Затем реактор нагревают в бескислородной атмосфере азота, предпочтительно - путем погружения в масляную баню с температурой, примерно равной от 180^oС до 190^oС, и скорость перемешивания увеличивают примерно до 125 об/мин. Перед погружением на крышку реактора помещают ленточный нагревательный элемент (например, Thermolyne модели 45500, настройка входных управляющих сигналов равна 4). Регистрируют время, потребовавшееся до полного расплавления содержимого реактора, в типичном случае - примерно 15 минут для загрузки весом около 300 г при температуре, примерно равной 180^oС. В ходе синтеза через каждый час отбирают пробы и анализируют посредством гельпроникающей хроматографии (GPC) с целью определения процентного содержания остаточных мономеров и получения значений среднего молекулярного веса из распределений по числу атомов (Мn) и по весу (Mw). Типичное время реакции находится в диапазоне примерно от 9 до 15 часов. Конечный полимер также анализируют путем титрования для определения кислотного числа в мэкв/г и посредством газовой хроматографии (GC) для определения остаточного количества непрореагировавших мономеров. Дополнительные анализы включают инфракрасную спектроскопию (IR) (выявление характеристического С= О пика), ЯМР (определение содержания лактида и гликолида в полимере) и анализ на остаточное содержание олова (определение остаточного содержания олова, обусловленного использованием 2-этилгексаноата олова (II) в качестве катализатора).

Очистка/образование натриевой соли указанного сополимера
Остаточные мономеры (в типичном случае менее 5% (вес/вес)) удаляют, а сополимер переводят в форму его натриевой соли (чтобы способствовать образованию ионной соли) в одну стадию. Сополимер L-молочной, гликолевой и L(+)-винной кислот (PLGTA) растворяют в ацетоне путем обработки ультразвуком в ультразвуковой ванне с получением раствора с концентрацией PLGTA в диапазоне 19-21 вес.%.

К этому раствору добавляют слабый раствор неорганического основания, например NaOH или Na₂CO₃ (предпочтительно используют 0,2М раствор карбоната натрия (Na₂CO₃)), в таком количестве, чтобы результирующая концентрация натрия обеспечивала молярный избыток по отношению к карбоксильным группам сополимера в 1-2 раза, предпочтительно - в 1,2 раза. Раствор продолжают перемешивать в течение 15-60 минут, предпочтительно - в течение 30 минут, при комнатной температуре для образования натриевой соли. Затем его подают со скоростью, примерно равной 50-300 мл/мин, предпочтительно - примерно равной 100 мл/мин, в реактор с рубашкой, содержащий деионизированную воду, охлажденную до температуры примерно от 1^oС до 4^oС, предпочтительно - до 2,5^oС, с помощью циркуляционной ванны; количество воды обеспечивает 20-30-кратный объемный избыток по сравнению с объемом ацетона, предпочтительно - объемный избыток по отношению к объему ацетона, равный 20:1. Воду перемешивают лопастью, соединенной с двигателем мешалки, со скоростью, достаточной для того, чтобы создать поверхностные завихрения, во избежание агломерации полимера во время осаждения.

По завершении осаждения дисперсию продолжают перемешивать в течение дополнительных 30-60 минут с целью удаления мономеров, после чего ее помещают в сосуды для центрифугирования и центрифугируют. Супернатант отбрасывают, а осадки повторно суспендируют в дополнительном количестве воды, повторно центрифугируют и высушивают, предпочтительно - посредством лиофилизации.

Получение ионного конъюгата полимера и Соединения (А)
Синтез состоит в присоединении Соединения (А) к натриевой соли сополимера в среде, в которой они оба растворимы, предпочтительно - в смеси ацетонитрила с водой в соотношении 3:1 (вес/вес), с последующим осаждением образующегося ионного конъюгата в деионизированной воде и выделении образовавшегося нерастворимого в воде осадка конъюгата.

Раствор уксуснокислой соли Соединения (А) в деионизированной воде добавляют к раствору, состоящему из промытой натриевой соли PLGTA с молекулярным весом 12000 и соотношением компонентов от 71/28/1 до 73/26/1 и ацетонитрила (концентрация раствора в диапазоне 24-26% (вес/вес)), к которому добавлено слабое основание, предпочтительно - 0,5М раствор Na₂CO₃, в таком количестве, чтобы в результате был получен молярный избыток Na по отношению к содержанию ацетата в ацетатной соли Соединения (А), равный примерно 1,05, и перемешивают в течение примерно 5 минут для создания щелочной среды, предпочтительно - с рН, равным 8, для нейтрализации ацетатной группы Соединения (А). Примерное весовое соотношение ацетонитрила и воды составляет 3:1. На основании требующегося целевого содержания активного ингредиента в полимере (обычно от примерно 8% до примерно 12%) определяют необходимое количество Соединения (А). Исходя из него, определяют объем водного раствора карбоната натрия, необходимый для нейтрализации ацетата Соединения (А), и в заключение рассчитывают объем воды, необходимый для растворения Соединения (А), на основании желаемого объемного соотношения ацетонитрила и воды (включая добавленный карбонат натрия), равного примерно 3:1.

Раствор Соединения (А) и сополимера перемешивают в течение примерно 10-15 минут при температуре, примерно равной от 0 до 5^oС, предпочтительно - при 2,5^oС, с целью содействия ионному связыванию и предотвращения ковалентного связывания (за счет использования низкой температуры) двух компонентов. Затем раствор перекачивают со скоростью, примерно равной от 50 до 300 мл/мин, в деионизированную воду, объемный избыток которой находится в диапазоне от примерно 20-30 до 1 по отношению к объему ацетонитрила в указанном растворе ацетонитрила в воде в соотношении 3:1, перемешивают со скоростью, достаточной для обеспечения взбалтывания поверхности и исключения агломерации, и охлаждают до температуры, примерно равной от ^oС до 4^oС, предпочтительно - до 1,7^oС, в реакторе с рубашкой, соединенной с циркуляционной ванной.

После завершения осаждения дисперсию продолжают перемешивать еще в течение 30-60 минут для удаления растворимых в воде соединений Соединения (А) с олигомерами (олигомерами являются фракции PLGTA с более низким молекулярным весом, нежелательные в связи с растворимостью их в воде), после чего помещают ее в сосуды для центрифугирования и центрифугируют со скоростью, примерно равной 5000 об/мин, в течение примерно 15 минут. Образующиеся после центрифугирования осадки повторно суспендируют в деионизированной воде и повторно центрифугируют. Затем их замораживают, высушивают посредством лиофилизации в течение 2 дней и получают Соединение (I) (т.е. Соединение (А), связанное ионной связью с PGLTA). Содержание активного вещества в полимере определяют путем высокопродуктивной жидкостной хроматографии (HPLC) и анализа на азот (содержание азота в Соединении (А) известно, а полимер вообще не содержит азота). Экстракция Соединения (А) из Соединения (I) с последующим HPLC-анализом также дает возможность определить содержание активного вещества в полимере.

Распыление Соединения (I)
Для получения состава, пригодного для инъекции пациенту, из Соединения (I) формируют микросферы посредством растворения его в этилацетате и использования ультразвуковой атомизации (известной также, как "пульверизация") для распыления раствора в находящиеся при низкой температуре (примерно от -60^oС до -78^oС) этанол, изопропанол или смесь гексана и изопропанола, предпочтительно - в изопропанол, что приводит к образованию микросфер из Соединения (I) при контакте раствора Соединения (I) с холодным изопропанолом. Раствор Соединения (I) в этилацетате можно стерилизовать посредством пропускания его через фильтр с размером пор, равным 0,2 мкм.

Соединение (I) растворяют в этилацетате, предпочтительно - при обработке ультразвуком/перемешивании, с получением раствора с концентрацией, примерно равной 8-12% (вес/вес), предпочтительно - 12%, в зависимости от молекулярного веса полимера и содержания в нем Соединения (А), так как оба эти фактора могут изменять вязкость раствора. Раствор перекачивают со скоростью, примерно равной 4,90-5,10 мл/мин, предпочтительно - 5,00 мл/мин, в промышленный распылитель или пульверизатор (мощность - примерно 70%, амплитуда - примерно 80%, частота - примерно 34-35 кГц, предпочтительно - 34,50 кГц; в целом, распылитель должен быть достаточно мощным для того, чтобы обеспечить частоту, при которой можно равномерно распылять (без образования "брызг") растворы Соединения (I) в этилацетате с концентрацией от примерно 8% до примерно 12% (вес/вес), так как такие концентрации обеспечивают образование цельных микросфер, и частота должна быть такой, чтобы средний размер полученных частиц находился в диапазоне от 40 до 70 мкм, что обеспечивает легкое введение путем инъекции через иглу номер 21 или номер 19) и распыляют в объем изопропанола (IPA), который обеспечивает 20-30-кратный (предпочтительно - 20-кратный) объемный избыток по отношению к объему этилацетата, охлаждают до температуры примерно от -60^oС до -78^oС (охлаждение можно осуществить, например, с помощью рубашки реактора, посредством добавления сухого льда или погружения охлаждающего змеевика) и перемешивают при частоте вращения мешалки не менее 200 об/мин (для предотвращения агломерации микросфер). В рубашку распылителя подают деионизированную воду при температуре, примерно равной 6^oС, с предпочтительной скоростью, равной 1,5 л/мин, для исключения любых эффектов локального нагрева, которые могут привести к засорению наконечника распылителя из-за испарения этилацетата. Раствор распыляют равномерно, и в изопропилацетате наблюдается образование желтоватой дисперсии частиц. Дисперсии дают возможность нагреться до 0-22^oС в течение периода времени от примерно 30 минут до 2 часов, после чего пропускают ее через сито с диаметром ячеек, равным 125 мкм (для удаления любых крупных капель/частиц, которые невозможно будет инъецировать) и помещают на фильтровальную бумагу Whatman 1, через которую осуществляют вакуумную фильтрацию. Осадок, полученный после фильтрации, промывают дополнительным количеством изопропанола и высушивают под вакуумом.

Настоящее изобретение иллюстрировано приведенными ниже примерами, но оно не ограничено их деталями.

Пример 1
Ионный конъюгат P(I)LGTA и Соединения (А)
Стадия А: Синтез 300 г сополимера Р(1)LG/винной кислоты (соотношение L-лактида: гликолида: винной кислоты =72:27:1)
В реактор загружали мономеры гликолида (Purac Biochem, Нидерланды, 68,71 г), лактида (Purac Biochem, Нидерланды, 227,53 г) и L(+)-винной кислоты (Riedel-de Haen, Seelze, Германия, номер товара 33801, 3,75 г) и раствор 2-этилгексаноата олова (II) (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США, номер товара S-3252) в толуоле (Riedel-de Haen, Seelze, Германия) (0,0982М, 4,47 мл). Это соответствовало молярным процентным долям, равным 71,81, 26,82 и 1,36%, соответственно, для L-лактида, гликолида и L(+)-винной кислоты.

L(+)-винную кислоту предварительно сушили над силикагелем (Riedel-de Haen, Seelze, Германия) в сушильном аппарате Абдерхальдена в течение примерно 10 часов. Затем реактор (соединенный с насосом через ловушку с жидким азотом) помещали под вакуум (0,04 мбар, что составляет примерно 0,04 г/см²) при перемешивании примерно на 50 минут для удаления толуола. Реактор в атмосфере бескислородного азота (ВОС gases, Дублин, Ирландия, содержание влаги - 8 об. %) затем помещали в масляную баню (температура примерно 180^oС) и увеличивали скорость перемешивания до 125 об/мин. Перед погружением на крышку реактора помещали ленточный нагревательный элемент (Thermolyne модели 45500, настройка входных управляющих сигналов равна 4). Регистрировали время, прошедшее до полного расплавления содержимого реактора, в типичном случае - примерно 15 минут для загрузки весом около 300 г при температуре, примерно равной 180^oС. В ходе синтеза через каждый час отбирали пробы и анализировали их посредством гельпроникающей хроматографии (GPC) с целью определения процентного содержания остаточных мономеров и определения значений среднего молекулярного веса из распределений по числу атомов (Мn) и по весу (Mw). Типичное время реакции составляло порядка 15 часов. Конечный полимер также анализировали посредством титрования для определения кислотного числа в мэкв/л и посредством газовой хроматографии (GC) для определения остаточного количества непрореагировавших мономеров. Дополнительные анализы включают инфракрасную спектроскопию (IR) (выявление характеристического С=O пика), ЯМР (определение содержания лактида и гликолида в полимере) и анализ на остаточное содержание олова (определение остаточного содержания олова, обусловленного использованием 2-этилгексаноата олова(II) в качестве катализатора).

Стадия Б: Очистка/Образование натриевой соли указанного сополимера
Остаточные мономеры (в типичном случае менее 5% (вес/вес)) удаляли, а сополимер переводили в форму его натриевой соли (чтобы способствовать образованию ионной соли) в одну стадию. 81,05 г сополимера L-молочной, гликолевой и L(+)-винной кислот с молекулярным весом 12000 г/моль и соотношением мономеров, равным 72/27/1 (кислотное число при титровании равно 0,231 мэкв/г), растворяли в 324,24 г ацетона (Riedel-de Haen, Seelze, Германия) путем обработки ультразвуком в ультразвуковой ванне (Branson, Денбери, Коннектикут, США) с получением раствора с концентрацией PLGTA, равной 20,00 вес.%.

К этому раствору добавляли 56,17 мл 0,2М раствора NazCOa (Aldrich, Гиллингхем, Дорсет, Великобритания), обеспечивая молярный избыток натрия по отношению к карбоксильным группам, равный 1,2. Раствор продолжали перемешивать в течение 30 минут при комнатной температуре для образования натриевой соли. Затем его перекачивали со скоростью, примерно равной 100 мл/мин, в реактор объемом 10 л с рубашкой, содержавший 8,2 л деионизированной воды (объемный избыток по сравнению с объемом ацетона, равный примерно 20:1), охлажденной примерно до 2,5^oС. Воду перемешивали с помощью лопасти, соединенной с мотором мешалки, со скоростью, достаточной для того, чтобы создать поверхностные завихрения и исключить агломерацию полимера во время осаждения.

По завершении осаждения дисперсию продолжали перемешивать в течение дополнительных 30 минут с целью удаления мономеров, после чего ее помещали в сосуды для центрифугирования и центрифугировали при частоте вращения, равной 5000 об/мин, в течение примерно 15 минут в центрифуге Sorvall (DuPont Sorvall Products, Вилмингтон, Делавэр, США). Супернатант отбрасывали, а осадки повторно суспендировали в дополнительном количестве деионизированной воды, повторно центрифугировали и замораживали в морозильной камере (-13^oС) в течение ночи, после чего на следующий день сушили в небольшом лиофилизаторе (Edwards, Кроули, Западный Суссекс, Великобритания). Этот лиофилизатор не содержит системы хладагента. После 5-дневной лиофилизации получали 65,37 г промытого сополимера, что составляло выход, равный 80,65%.

Стадия В: Получение Соединения (I)
Раствор 1,27 г ацетатной соли Соединения (А) (Партия 97К-8501 производства Kinerton Ltd., Дублин, Ирландия; эффективность равна 85,8% (эффективность означает процентное содержание свободного основного пептида в ацетатной соли пептида); содержание ацетата равно 10,87%) в 5,87 г деионизированной воды добавляли к раствору, состоявшему из промытой натриевой соли PLGTA с молекулярным весом 12000 и соотношением компонентов от 71/28/1 до 73/26/1 и 24,84 г ацетонитрила (Riedel de-Haen) (раствор с концентрацией 24,38% (вес/вес)), к которому было добавлено 2,41 мл 0,5М раствора Na₂CO₃ (это соответствует избытку Na по отношению к содержанию ацетата в ацетатной соли Соединения (А), равному 1,05), и перемешивали в течение примерно 5 минут с целью создания щелочной среды (рН 8) для нейтрализации ацетатных групп Соединения (А). Примерное весовое соотношение ацетонитрила и воды составляло 3: 1. На основании требующегося целевого содержания активного ингредиента в полимере определяли необходимое количество Соединения (А). Исходя из него, определяли объем водного раствора карбоната натрия, необходимый для нейтрализации ацетата Соединения (А), и в заключение рассчитывали объем воды, необходимый для растворения Соединения (А), на основании желаемого объемного соотношения ацетонитрила и воды (включая добавленный карбонат натрия), равного 3:1.

Раствор Соединения (А) и сополимера перемешивали в течение примерно 10-15 минут примерно при 2,5^oС с целью содействия ионному связыванию и предотвращения ковалентного связывания двух компонентов. Затем раствор перекачивали со скоростью, примерно равной 100 мл/мин, в 630 мл деионизированной воды (объемный избыток по отношению к объему ацетонитрила примерно равен 20: 1), перемешивали со скоростью 350 об/мин (для обеспечения взбалтывания поверхности и исключения агломерации Соединения (А)-сополимера) и охлаждали примерно до 1,7^oС в реакторе на 6 л с рубашкой, соединенной с циркуляционной ванной.

После завершения осаждения дисперсию продолжали перемешивать в течение дополнительных 30 минут для удаления растворимых в воде соединений Соединения (А) с олигомерами, после чего помещали ее в сосуды для центрифугирования и центрифугировали со скоростью, равной 5000 об/мин, в течение примерно 15 минут в центрифуге Sorvall (DuPont Sorvall Products, Вилмингтон, Делавэр, США). Образовавшиеся после центрифугирования осадки повторно суспендировали в деионизированной воде и повторно центрифугировали. Затем их замораживали и высушивали посредством лиофилизации в течение 2 дней. Было получено 8,30 г названного выше продукта, что соответствовало выходу, равному 91,38%. Содержание наполнителя определяли путем высокопродуктивной жидкостной хроматографии (HPLC) супернатанта для анализа на несвязанное Соединение (А) и анализа на азот (содержание азота в Соединении (А) известно, а полимер вообще не содержит азота). Экстракция Соединения (А) из Соединения (I) с последующим HPLC-анализом также дает возможность определить содержание активного ингредиента в полимере, которое в этом примере было равно 11,25%.

Стадия Г: Распыление Соединения (I)
8,27 г Соединения (I) из стадии В растворяли в 60,77 г этилацетата посредством обработки ультразвуком/перемешивания (при комнатной температуре) с получением 12,00%-ного (вес/вес) раствора. Этот раствор со скоростью 5 мл/мин подавали в промышленный распылитель/пульверизатор (Martin Walter Powersonic, модель MW400GSIP, который можно приобрести в компании Sodeva of France), установленный на мощность, равную 70%, амплитуду, равную 80%, частоту, равную 34,5 кГц, и распыляли в 1,35 л изопропилового спирта (20-кратный объемный избыток по отношению к объему этилацетата), охлаждали до примерно -744^oС (охлаждение осуществляли через рубашку реактора) и перемешивали при частоте вращения мешалки, равной 200 об/мин (для предотвращения агломерации микросфер) в реакторе с рубашкой. В рубашку распылителя подавали деионизированную воду при температуре 6^oС со скоростью, равной 1,5 л/мин, для исключения любых эффектов локального нагрева, которые могли привести к засорению наконечника распылителя из-за испарения этилацетата. Раствор распыляли равномерно и наблюдали образование желтоватой дисперсии частиц в изопропиловом спирте. Дисперсии позволяли нагреться до температуры примерно от 0^oС до 4^oС в течение периода времени от примерно 30 минут до 2 часов, после чего пропускали ее через сито с диаметром ячеек, равным 125 мкм (для удаления любых крупных капель/частиц, которые невозможно инъецировать), и помещали на фильтровальную бумагу Whatman 1, через которую производили вакуумную фильтрацию. Осадок, полученный после фильтрации, промывали дополнительным количеством изопропилового спирта, а затем высушивали под вакуумом. Было получено 6,88 г материала, пригодного для введения путем инъекции, что соответствует выходу, равному 83,19%. Микрочастицы Соединения (I) имели средний размер, примерно равный 54 мкм.

Высвобождение Соединения (А) из микрочастиц Соединения (I) in vivo могло быть и было проанализировано согласно приведенному ниже описанию. Исследование in vivo было предназначено для оценки профиля высвобождения in vivo Соединения (А) после внутримышечного введения микрочастиц Соединения (I) взрослым собакам породы гончая посредством определения фармакокинетического профиля Соединения (А) после его введения.

Фармацевтические составы, содержащие микрочастицы Соединения (I), вводили внутримышечно в мышцы задней лапы. После однократного внутримышечного введения облученных или необлученных приготовленных фармацевтических форм, содержавших микрочастицы Соединения (I) (количество инъецированных микрочастиц соответствовало 5 мг Соединения (А) на основании того, что содержание Соединения (А) в Соединении (I) было равно 11,23%), группам, состоявшим из шести собак на каждую фармацевтическую форму, производили количественное определение Соединения (А) в пробах сыворотки и фармакокинетический анализ следующим образом.

Отбор проб крови у собак производили перед инъекцией (момент времени 0) и через 5, 15 и 30 мин; 1, 2, 4, 8 и 12 часов; 1, 2, 3 и 4 дня; после чего - два раза в неделю в течение первого месяца (например, по понедельникам и четвергам) и наконец - раз в неделю, начиная со второго месяца до окончания эксперимента, когда содержание Соединения (А) в сыворотке больше не выявлялось. Фактическое время отбора крови регистрировали и использовали в фармакокинетическом анализе. Пробы крови (5 мл) в моменты времени 0 (перед внутримышечным введением) и через 7, 21, 35, 56 и 84 дня после внутримышечной инъекции и пробы крови (4 мл) в остальные сроки отбора проб отбирали через яремную или головные вены в предписанные моменты времени.

Пробы делили на две фракции: одну, состоявшую из образцов, взятых в определенные моменты времени, объемом примерно по 2,5 или 3,5 мл, в пробирках, содержавших 50 и 80 мкл, соответственно, раствора апротинина (10 мл Trasylol, 500000 KJU, лиофилизированного и повторно разведенного в 2 мл p. p.i. воды), и другую, состоявшую из проб объемом примерно по 1,5 мл, которые оставляли стоять.

После оседания эритроцитов пробирки центрифугировали в течение 20 минут при скорости 30000 об/мин при +4^oС. Сыворотку с апротинином удаляли и хранили в виде двух фракций при -20^oС до анализа образца на Соединение (А).

Концентрацию Соединения (А) в пробах сыворотки анализировали с помощью радиоиммунологического анализа. Стандартные кривые для плазмы контрольных собак и стандартных растворов Соединения (А) получали ежедневно. В этом способе предел количественного определения Соединения (А) в пробах сыворотки собак был равен примерно 0,050 нанограммам (нг)/мл. Площади под графиками (AUC) и максимальная концентрация в сыворотке (С_max) были нормализованы к полученной дозе (доза, введенная каждому животному, выраженная в мкг/кг). Также рассчитывали показатель скорости абсорбции (C_max/AUC).

Результаты описанного выше эксперимента приведены на чертеже.

Соединение (А) или его фармацевтически приемлемую соль, Соединение (I) или микрочастицы Соединения (I) можно вводить посредством перорального, парентерального (например, внутримышечной, внутрибрюшинной, внутривенной или подкожной инъекции или имплантата), назального, интравагинального, ректального, сублингвального или местного способов введения, а рецептуры могут быть составлены с использованием фармацевтически приемлемых носителей для получения дозировочных форм, соответствующих каждому способу введения.

Твердые дозировочные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых дозировочных формах активное соединение смешивают по меньшей мере с одним инертным фармацевтически приемлемым носителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Эти дозировочные формы могут также включать, что является нормальной практикой, дополнительные вещества, отличающиеся от этих инертных разбавителей, например - смазывающие средства, такие как стеарат магния. В случае капсул, таблеток и пилюль дозировочные формы могут также включать буферные средства. Таблетки и пилюли могут дополнительно быть изготовлены с покрытиями, растворимыми в желудочно-кишечном тракте.

Жидкие дозировочные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы, эликсиры, содержащие инертные разбавители, обычно используемые в данной области техники, например воду. Кроме таких инертных разбавителей, составы могут также включать добавки, например смачивающие средства, эмульгирующие и суспендирующие средства, а также подсластители, ароматизаторы и отдушки.

Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей или связующих веществ являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, например оливковое масло и кукурузное масло, желатин и органические эфиры, пригодные для инъекции, например этилолеат. Такие дозировочные формы могут также содержать добавки, например консерванты, смачивающие, эмульгирующие и диспергирующие средства. Они могут быть стерилизованы, например, посредством фильтрации через фильтр, задерживающий бактерии, посредством включения в составы стерилизующих средств, посредством облучения составов или посредством нагревания составов. Они могут быть также произведены в форме стерильных твердых составов, которые можно растворить в стерильной воде или какой-либо другой стерильной среде, пригодной для инъекций, непосредственно перед употреблением.

Составы для ректального или вагинального введения предпочтительно являются суппозиториями, которые могут содержать, кроме активного вещества, наполнители, например масло какао или воск для суппозиториев.

Составы для назального или сублингвального введения также готовят со стандартными наполнителями, известными в данной области техники.

Предпочтительно, чтобы микрочастицы Соединения (I) были введены посредством парентерального введения или перорального введения.

Эффективную дозу микрочастиц Соединения (I) для введения больному может определить лечащий врач или ветеринар, и она будет зависеть от соответствующих доз, намеченных для Соединения (А), и содержания Соединения (А) в микрочастицах Соединения (I). Эти дозы либо общеизвестны, либо их может определить любой специалист в данной области техники. Предпочтительно доза должна находиться на уровне не менее чем 200 пикограмм/мл Соединения (А) для одного больного.

Формула изобретения

1. Способ получения соединения I, где соединение I включает соединение (А),

и полимер, причем полимер содержит лактидные мономеры, гликолидные мономеры и мономеры винной кислоты, доля лактидных мономеров в полимере составляет от 71 до 73%, доля гликолидных мономеров - от 26 до 28% и доля мономеров винной кислоты - от 1 до 3%, а аминогруппа соединения (А) соединена при помощи ионной связи с карбоксильной группой кислотных мономеров полимера; при этом указанный способ включает стадию реагирования водного раствора соединения (А) с полимером или его солью в смеси ацетонитрила и воды, в которой весовое соотношение ацетонитрила и воды равно примерно 3: 1 соответственно, при температуре, примерно равной 0-5^oС, до тех пор, пока образование соединения I не будет, по существу, завершено.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что температура составляет примерно 2,5^oС и указанный способ включает дополнительную стадию выделения соединения I.

3. Способ получения микрочастиц соединения I, где соединение I включает соединение А

и полимер, причем полимер содержит лактидные мономеры, гликолидные мономеры и мономеры винной кислоты, доля лактидных мономеров в полимере составляет от 71 до 73%, доля гликолидных мономеров - от 26 до 28% и доля мономеров винной кислоты - от 1 до 3%, а аминогруппа соединения (А) соединена при помощи ионной связи с карбоксильной группой кислотных мономеров полимера; указанный способ включает стадии: распыления раствора соединения I в этилацетате в изопропиловый спирт с получением дисперсии микрочастиц соединения I, при этом концентрация соединения I в этилацетатном растворе составляет примерно 8 - 12% (вес/вес); скорость распыления раствора соединения I в изопропиловый спирт из распылителя составляет примерно 4,9 - 5,1 мл/мин; заданная частота распылителя такова, что распылитель не создает брызг раствора соединения I в этилацетате; объем изопропилового спирта соответствует 20 - 30-кратному объемному избытку, по сравнению с объемом этилацетата; и температура изопропилового спирта составляет примерно -60 до -78^oС; обеспечения возможности нагрева изопропилового спирта до температуры примерно 0 - 22^oС и выделения указанных микрочастиц из изопропилового спирта.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что скорость распыления равна примерно 5 мл/мин, а объем изопропилового спирта обеспечивает примерно 20-кратный объемный избыток по сравнению с объемом этилацетата.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что полимер содержит примерно 72% лактидных мономеров, примерно 27% гликолидных мономеров и примерно 1% мономеров винной кислоты.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что микрочастицы имеют средний размер примерно 10 - 100 мкм.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что микрочастицы имеют средний размер примерно 40 - 70 мкм.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 15.08.2009

Извещение опубликовано: 20.07.2010        БИ: 20/2010

---