Малая субъединица изозима iii и изозим iii синтетазы ацетогидроксикислот из escherichia coli, фрагмент днк (варианты), штамм бактерии escherichia coli - продуцент l- валина (варианты) и способ получения l-валина

 

Изобретение относится к способу получения L-валина. Выращивают штамм E. coli, содержащий ДНК, кодирующую изозим III синтетазы ацетогидроксикислот из Escherichia coli в питательной среде, обеспечивающей продукцию и накопление L-валина в питательной среде, и выделения L-валина из питательной среды. Изозим III синтетазы не ингибируется L-валином и обладает каталитической активностью в двух реакциях: реакции синтеза -ацетолактата из пирувата и реакции синтеза -ацето--гидроксибутирата из -кетобутирата и пирувата. Изозим III в малой субъединице содержит мутацию в положении 17 с заменой серина на фенилаланин, или в положении 29 с заменой аспарагинового остатка на лизин или тирозин, или мутацию, приводящую к делеции С-концевого участка, начиная с аминокислоты в положении 91, или к замене глицинового остатка в положении 14 на остаток аспаргиновой кислоты. Последовательности приведены в описании. Штаммы E. coli содержат соответствующие фрагменты ДНК. Изобретение позволяет повысить экспрессию L-валина. 9 с.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.

Изобретение относится к способу получения L-валина методом ферментации и касается, в частности, ДНК, кодирующей изозим III синтетазы ацетогидроксикислот, нечувствительной к ретроингибированию L-валином, микроорганизма, содержащего эту ДНК, и способа получения L-валина с помощью такого микроорганизма.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ Известны способы получения L-валина методом ферментации с использованием микроорганизмов, принадлежащих главным образом к роду Brevibacterium. Corynebacterium или Serratia или их мутантов, продуцирующих L-валин или L-лейцин (Amino Acid Fermentation, Japan Scientific Society's press, pp.397-422, 1986). И хотя применяемые в настоящее время методы позволяют значительно увеличить производство этих аминокислот, разработка более продуктивных, рентабельных методов требуется для того, чтобы удовлетворить растущую потребность в L-валине и L-лейцине в будущем.

В качестве примера бактерий, отличных от указанных выше и использующихся для производства L-валина, можно привести принадлежащий к роду Escherichia coli продуцент L-валина, требующий для роста липоевую кислоту и/или лишенный активности Н⁺-АТФазы. Таким же примером является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia coli и обладающая вышеуказанными характеристиками, в которую введен оперон ilvGMEDA, экпрессирующий гены ilvG, ilvM, ilvE и ilvD и не экспрессирующий треонин дезаминазу (WO96/06926).

Последняя стадия биосинтеза L-валина осуществляется под действием группы ферментов, кодируемых опероном ilvGMEDA. Оперон ilvGMEDA состоит из генов iLvG, ilvM, ilvE, ilvD и ilvA, которые кодируют большую и малую субъединицы изозима II синтетазы ацетогидроксикислот, трансаминазы, дегидратазы дигидроксикислот и треонин дезаминазы соответственно. Среди этих ферментов синтетаза ацетогидроксикислот, трансаминаза и дегидратаза дигидроксикислот катализируют реакцию синтеза L-валина из пирувиновой кислоты и L-изолейцина из 2-кетомаслянной кислоты, а треонин дезаминаза катализирует дезаминирование L-треонина в 2-кетомаслянную кислоту, которое является стадией, лимитирующей скорость биосинтеза L-изолейцина. При этом экспрессия оперона ilvGMEDA контролируется (ослабевает) L-валином, L-изолейцином и/или L-лейцином.

В качестве синтетазы ацетогидроксикислот, имеющей отношение к биосинтезу L-валина, кроме изозима II (здесь и далее упоминающегося как AHAS II) известен изозим III (здесь и далее упоминающийся как AHAS III). AHAS III кодируется опероном ilvH, состоящим из гена ilvI, кодирующего большую (каталитическую) субъединицу, и гена ilvH, кодирующего малую (регуляторную) субъединицу. AHAS III подвергается ретроингибированию L-валином.

Кроме того, известно, что ген ilvH, клонированный из мутантной Escherichia coli, устойчивой к L-валину, содержит мутацию, приводящую к аминокислотной замене ¹⁴Gly на Asp (Vyazmensky, M. et al., Biochemistry, 35, 10339-10346(1996)). Более того, известна мутация ilvH612, затрагивающая AHAS III (De Felice et al. , J.Bacteriol., 120, 1058-1067 (1974)). Ген ilvH в опероне ilvIH штамма Escherichia coli MI262 (Guardiola et al., J.Bacteriol., 120, 536-538(1974); De Felice et al., J.Bacteriol., 120, 1068-1077 (1974)) содержит двойную мутацию, приводящую к замене ²⁹Asn на Lys и замене ⁹²Gln на стоп-кодон (TAG).

Как описано выше, кодирующая AHAS II ДНК была использована для создания продуцента L-валина, в то время как об AHAS III упоминаний в литературе нет.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ Целью настоящего изобретения, с вышеупомянутых позиций, является приготовление ДНК, кодирующей AHAS III, не подверженной ретроингибированию L-валином, микроорганизма, содержащего эту ДНК, и способа получения L-валина с использованием такой бактерии.

В результате тщательного исследования с целью получения описанных выше объектов авторы установили, что продукция L-валина повышается в том случае, когда ДНК, кодирующая устойчивую к L-валину AHAS III и выделенная из мутантнов, устойчивых к L-валину, вводилась в Escherichia coli. Так было выполнено настоящее изобретение.

Таким образом, настоящее изобретение включает следующие элементы: 1). Малая субъединица изозима III синтетазы ацетогидроксикислот из Escherichia coli, содержащая мутацию, приводящую к замене аминокислотного остатка, соответствующего сериновому остатку в положении 17, на остаток фенилаланина в последовательности, приведенной в списке последовательностей под 2 (SEQ ID No: 2), или одновременно две мутации, приводящие к замене аминокислотного остатка, соответствующего сериновому остатку в положении 17, на остаток фенилаланина и к замене аминокислотного остатка, соответствующего глициновому остатку в положении 14, на остаток аспарагиновой кислоты в последовательности, приведенной в списке последовательностей под 2 (SEQ ID No:2); 2). Фрагмент ДНК, кодирующий малую субъединицу изозима III синтетазы ацетогидроксикислот по п.1); 3). Изозим III синтетазы ацетогидроксикислот из Escherichia соli, который не ингибируется L-валином и обладает каталитической активностью в двух реакциях: реакции синтеза -ацетолактата из пирувата и реакции синтеза -ацето--гидроксибутирата из -кетобутирата и пирувата; и в котором малая субъединица содержит мутацию, приводящую к замене аминокислотного остатка, соответствующего сериновому остатку в положении 17, на остаток фенилаланина, или мутацию, приводящую к замене аминокислотного остатка, соответствующего аспарагиновому остатку в положении 29, на остаток лизина или тирозина, или мутацию, приводящую к делеции С-концевого участка, начиная с аминокислоты в положении 91 в последовательности, приведенной в списке последовательностей под 2 (SEQ ID No:2), или комбинацию двух или более мутаций, выбранных из группы описанных выше мутаций, и мутации, приводящей к замене аминокислотного остатка, соответствующего глициновому остатку в положении 14 на остаток аспарагиновой кислоты в последовательности, приведенной в списке последовательностей под 2 (SEQ ID No:2); 4). Фрагмент ДНК, кодирующий изозим III синтетазы ацетогидроксикислот по п.3); 5). Штамм бактерии Escherichia coli, содержащий фрагмент ДНК по п.2) в хромосомной ДНК или на плазмиде, находящейся в штамме указанной бактерии, и обладающий способностью к продукции L-валина; 6). Штамм бактерии по п.5), в котором экспрессия указанного фрагмента ДНК в штамме бактерии повышена за счет помещения указанного фрагмента ДНК под контроль сильного промотора или за счет увеличения количества копий указанного фрагмента ДНК; 7). Штамм бактерии Escherichia соli, содержащий фрагмент ДНК по п.4) в хромосомной ДНК или на плазмиде, находящейся в штамме указанной бактерии, и обладающий способностью к продукции L-валина;
8). Штамм бактерии по п.7), в котором экспрессия указанного фрагмента ДНК в штамме бактерии повышена за счет помещения указанного фрагмента ДНК под контроль сильного промотора или за счет увеличения количества копий указанного фрагмента ДНК;
9). Способ получения L-валина, включающий в себя стадии выращивания штамма бактерии по любому из пп. 6)-8) в питательной среде, обеспечивающей продукцию и накопление L-валина в питательной среде, и выделения L-валина из питательной среды.

Ниже настоящее изобретение будет описано более детально.

Исходной ДНК согласно настоящему изобретению является ДНК, кодирующая малую субъединицу AHAS III, проявляющую активность синтетазы ацетогидроксикислот и не подверженную ретроингибированию L-валином в комплексе с большой субъединицей. Под активностью синтетазы ацетогидроксикислот в данном случае подразумевается каталитическая активность в двух реакциях: реакции синтеза -ацетолактата из пирувата и реакции синтеза -ацето--гидроксибутирата из -кетобутирата и пирувата. Последовательность малой субъединицы AHAS III из Escherichia coli приведена в списке последовательностей под 2 (SEQ ID No:2).

Вышеупомянутые мутации выбраны из мутации, приводящей к замене серинового аминокислотного остатка в положении 17 на другой аминокислотный остаток в последовательности 2 (SEQ ID No:2) или обеих мутаций, приводящих к замене серинового аминокислотного остатка в положении 17 на другой аминокислотный остаток и глицинового аминокислотного остатка в положении 14 на другой аминокислотный остаток в последовательности 2 (SEQ ID No:2). Предпочтительным примером мутации аминокислотного остатка, соответствующего серину в положении 17, является замена остатка серина остатком фенилаланина, а для аминокислотного остатка, соответствующего глицину в положении 14? - замена остатка глицина остатком аспарагановой кислоты.

Второй ДНК согласно настоящему изобретению является ДНК, кодирующая AHAS III, не подверженную ингибированию L-валином и обладающую каталитической активностью в двух реакциях: реакции синтеза -ацетолактата из пирувата и реакции синтеза -ацето--гидроксибутирата из -кетобутирата и пирувата. ДНК кодирует как большую, так и малую субъединицы AHAS III совместно.

Малая субъединица содержит мутацию, приводящую к замене серинового аминокислотного остатка в положении 17 на другой аминокислотный остаток, или мутацию, приводящую к замене аспарагинового аминокислотного остатка в положении 29 на другой аминокислотный остаток, или мутацию, приводящую к делеции С-концевого участка, начиная с аминокислоты в положении 91 в последовательности 2 (SEQ ID No:2), или комбинацию двух или более мутаций, выбранных из группы описанных выше мутаций, и мутации, приводящей к замене глицинового аминокислотного остатка в положении 14 на другой аминокислотный остаток в последовательности 2 (SEQ ID No:2). Малая субъединица AHAS III, которая содержит эти мутации, здесь и далее упоминается как мутантная малая субъединица AHAS III. Предпочтительным примером мутации аминокислотного остатка, соответствующего серину в положении 17, является замена остатка серина остатком фенилаланина, для аминокислотного остатка, соответствующего аспарагиновой кислоте в положении 29, - замена остатка аспарагиновой кислоты остатком лизина или тирозина, а для аминокислотного остатка, соответствующего глицину в положении 14, - замена остатка глицина остатком аспарагиновой кислоты.

ДНК согласно настоящему изобретению была получена из мутантного штамма Escherichia coli, устойчивого к L-валину. Однако она может быть получена введением указанной мутации (мутаций) в ДНК, кодирующую нативную AHAS III, методом сайт-направленного мутагенеза. AHAS III кодируется опероном ilvH. Оперон ilvH может быть получен, например, амплификацией фрагмента ДНК из Escherichia coli (матрицы), протяженного от промотора до 3'-конца гена ilvH, методом ПЦР с использованием затравок, последовательность которых приведена в списке последовательностей под 3.

Нуклеотидная последовательность оперона ilvH известна (Genbank/EMBL/DDBJ accession X55034). Нуклеотидная последовательность кодирующего участка ilvH показана в списке последовательностей под 1 (SEQ IDNo:1).

Мутантная малая субъединица AHAS III, кодирующая ДНК согласно настоящему изобретению, может иметь последовательность аминокислот, которая содержит замены, делеции, вставки, дополнения или инверсии одной или нескольких аминокислот так же, как и упомянутые выше мутации, приводящие к тому, что мутантная малая субъединица проявляет активность синтетазы ацетогидроксикислот и не подвергается ретроингибированию L-валином в комплексе с большой субъединицей.

ДНК, кодирующая по существу такой же белок, как и описанная выше мутантная малая субъединица, получается путем модификации нуклеотидной последовательности, например, методом сайт-направленного мутагенеза таким образом, что один или несколько остатков аминокислот в заданных местах подвергаются замене, делеции, вставке, дополнению или инверсии. ДНК, модифицированная описанным выше способом, может быть получена с помощью общеизвестных методов получения мутаций. Методами получения мутаций являются обработка in vitro ДНК, кодирующей малую субъединицу, с помощью, например, гидроксиламина, а также обработка бактерии, принадлежащей к роду Escherichia coli и содержащей ДНК, кодирующую малую субъединицу, с помощью мутагена, такого как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин и азотистой кислоты, обычно используемых для получения мутаций, или обработка ультрафиолетовым облучением.

ДНК, кодирующая по существу такой же белок, как и мутантная малая субъединица AHAS III, получается экспрессией ДНК, содержащей описанную выше мутацию в большом числе копий в соответствующей клетке, исследованием устойчивости к L-валину и отбором ДНК, увеличивающей эту устойчивость. Также общеизвестно, что аминокислотная последовательность белка и кодирующая его нуклеотидная последовательность могут слегка различаться в зависимости от штамма, мутанта или варианта, и вследствие этого ДНК, кодирующая по существу такой же белок, может быть получена из устойчивых к L-валину видов, штаммов, мутантов и вариантов, принадлежащих к роду Escherichia.

А именно ДНК, кодирующая по существу такой же белок, как и мутантная малая субъединица, может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с ДНК, имеющей, например, нуклеотидную последовательность, показанную в списке последовательностей под 1 (SEQ ID No:l), и которая кодирует белок, обладающий активностью синтетазы ацетогидроксикислот, из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, подвергнутой обработке с целью получения мутации, или дикого мутанта, или варианта бактерии, принадлежащей к роду Escherichia. Термин "жесткие условия", упомянутый здесь, обозначает условия, при которых происходит так называемая специфическая гибридизация, а неспецифический гибрид не образуется. В численном виде такие условия трудно отразить. Однако, к примеру, строгие условия включают в себя условия, при которых гибридизуются ДНК с высокой степенью гомологии, например ДНК с гомологией не менее 70% гибридизуются, а ДНК с гомологией менее 70% не гибридизуются.

Штамм бактерии согласно настоящему изобретению содержит первую или вторую ДНК согласно настоящему изобретению и обладает способностью к продукции L-валина. Круг бактерий не ограничен особым образом при условии, что в бактерии присутствует биосинтетический путь L-валина, в котором принимает участие синтетаза ацетогидроксикислот. Примерами таких бактерий являются бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, к роду Serratia, коринеформные бактерии. Конкретным примером бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, является Escherichia coli.

Примерами методов введения ДНК согласно настоящему изобретению в бактерии являются, например, метод, в котором бактерия трансформируется плазмидой, содержащей ДНК согласно настоящему изобретению, а также метод, в котором ДНК согласно настоящему изобретению интегрирована в хромосомную ДНК бактерии с использованием гомологичной рекомбинации или подобным методом.

Предпочтительным является усиленная экспрессия ДНК согласно настоящему изобретению. Усиление экспрессии достигается помещением ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора или увеличением числа копий ДНК. Сильными промоторами являются, например, lac промотор, trp промотор, trc промотор, tac промотор, P_R промотор, P_L промотор фага лямбда, tet промотор, amyЕ промотор и spac промотор. Также возможно увеличить число копий ДНК согласно настоящему изобретению поддержанием ее многокопийного вектора или введением множественного числа копий ДНК в хромосомную ДНК. Примерами многокопийных векторов являются pBR322, pTWV228, pMW119 и pUC19 или подобные им.

Для введения вектора, содержащего ДНК согласно настоящему изобретению, в бактерию-хозяина может быть применен любой известный метод трансформации. Например, метод обработки клеток-реципиентов хлоридом кальция с целью повышения их проницаемости для ДНК, сообщенный для Escherichia coli К-12 (см. Mandel, M. and Higa, A., J.Mol.Biol, 53, 159 (1970)), а также метод приготовления компетентных клеток из клеток находящихся в фазе роста с последующим введением ДНК в них, описанный для Bacillus subtilis (см. Duncan, C.H., Wilson, G. A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). В дополнение к этому, также применим метод превращения клеток-реципиентов ДНК в протопласты или сферопласты, которые могут легко захватывать рекомбинантную ДНК с последующим включением ее внутрь клетки, который применим, как известно, к Bacillus subtilis, актиномицетам и дрожжам (Chang, S. and Choen, S.N.. Molec.Gen.Genet, 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward. J.M. Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc.Natl.Sci.USA. 75, 1929 (1978)), или метод трансформации, использовавшийся для воплощения настоящего изобретения, с использованием электрических импульсов (ссылка на выложенную патентную заявку Японии 2-207791).

Подходящим методом введения ДНК согласно настоящему изобретению в хромосомную ДНК бактерии является метод, использующий линеаризованную ДНК и плазмиду, содержащую чувствительный к температуре начальный участок репликации. В качестве альтернативы ДНК согласно настоящему изобретению может быть введена в бактерию из бактерии, содержащей ДНК согласно настоящему изобретению в хромосомной ДНК, методом трансдукции.

С целью введения множественных копий ДНК согласно настоящему изобретению в хромосомную ДНК бактерии осуществляется гомологичная рекомбинация с использованием последовательности, чьи множественные копии присутствуют к хромосомной ДНК в качестве мишени. В качестве последовательностей, чьи множественные копии существуют в хромосомной ДНК, могут быть использованы повторы ДНК, инвертированные повторы, присутствующие на концах транспозируемого элемента. Также, как описано в выложенной патентной заявке Японии 2-109985, возможно вставить ДНК согласно настоящему изобретению в транспозон и индуцировать его транспозицию для того, чтобы ввести множественные копии ДНК в хромосомную ДНК.

Бактерией, в которую вводится ДНК согласно настоящему изобретению, может быть как бактерия, приобретшая способность к продукции L-валина после введения ДНК согласно настоящему изобретению, так и бактерия, обладавшая способностью к продукции L-валина изначально.

Примером бактерии, обладающей способностью к продукции L-валина, является, например, Escherichia coli VL1970 (патент США 5658766). В дополнение к этому, преимущественно используются в качестве продуцентов L-валина бактерия, описанная в патенте WO96/06926, принадлежащая к роду Escherichia и требующая для роста липоевую кислоту и/или лишенная активности H⁺-АТРазы, или принадлежащая к роду Escherichia бактерия, включающая оперон ilvGMEDA, экспрессирующий по крайней мере гены ilvG, ilvM, ilvE и ilvD. Ввиду того, что экспрессия оперона ilvGMEDA подвержена негативному контролю (аттенуации) под действием L-валина, L-изолейцина и/или L-лейцина, предпочтительно, чтобы участок, существенно важный для ослабления экспрессии, был удален или мутирован с целью утраты чувствительности к подавлению экспрессии произведенным L-валином. Другой подход предполагает введение мутаций (IleS или ValS), влияющих на аминоацил-тРНК синтетазу, имеющую пониженное сродство (повышенную К_м) к соответствующим аминокислотам. Кроме того, предпочтительно использовать оперон, который не экспрессирует активную треонин дезаминазу.

Escherichia coli VL1970, содержащая мутацию IleS 17, которая нарушает чувствительность к аттенуации, как описано выше, депонирована в депозитарий Российской Государственной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИгенетика (113545, Россия, Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1) под номером ВКПМ В-4411.

Методы для осуществления, например, гибридизации, ПЦР, приготовление ДНК плазмид, расщепления и лигирования ДНК, трансформации описаны (Sambrook, J., Fritsche, E. F. , Maniatis, Т., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989)).

Продукция L-валина может быть осуществлена путем выращивания бактерии, обладающей способностью к продукции L-валина, в питательной среде, обеспечивающей продукцию L-валина и его накопление в питательной среде, выделение L-валина из питательной среды.

В настоящем изобретении выращивание, накопление и очистка L-валина из среды и тому подобное могут быть осуществлены способом, подобным традиционным методам ферментации, в которых аминокислота производится с использованием микроорганизма. Среда, используемая для выращивания, может быть или синтетической, или натуральной при условии, что в эту среду входят источники углерода и азота, минеральные вещества и, если необходимо, соответствующие количества питательных веществ, необходимых для роста микроорганизма. В качестве источников углерода могут включаться различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от формы ассимиляции используемого микроорганизма может быть использован спирт, включая этанол и глицерин. В качестве источников азота используются различные соли аммония, такие как сульфат аммония и аммиак, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и ферментолизат биомассы микроорганизмов. В качестве минеральных веществ используются монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и подобные соединения.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как встряхивание культуры, и аэрация и перемешивание культуры при температуре от 20 до 40^oС, предпочтительно от 30 до 38^oС. рН среды обычно находится между 5 и 9. предпочтительно между 6.5 и 7.2. рН среды может быть отрегулировано с помощью аммиака, карбоната кальция, различных кислот, оснований и буферов. Обычно от 1 до 3 дней выращивания приводят к накоплению L-валина в жидкой среде.

После выращивания твердые компоненты, такие как клетки, могут быть отделены от жидкой среды с помощью центрифугирования и фильтрации на мембране, затем целевой L-валин может быть собран и очищен с помощью методов ионного обмена, концентрирования и кристаллизации.

ПОЯСНЕНИЯ К ФИГУРАМ
На фиг.1 показаны ПЦР-затравки для получения мутантного гена ilvH, содержащего только одну мутацию ¹⁴Gly на Asp;
На фиг.2 показаны ПЦР-затравки для получения мутантного гена ilvH, содержащего только одну мутацию ¹⁷Ser на Phe.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение описывается следующими примерами:
<1> Штамм E.coli W3350, устойчивый к L-валину.

Мутант, устойчивый к L-валину, был отобран на минимальной среде, содержащей 0.1 мг/мл L-валина, из штамма E.coli W3350 дикого типа. Полученный таким образом мутант W3350 Val_0.1 ^R устойчив к L-валину в концентрации не выше чем 1 мг/мл.

Затем в этот мутант W3350 Val_0.1 ^R методом трансдукции Р1 был введен оперон лейцина (leuABCD), в который был вставлен транспозон Тn10 (lеu::Тn10). Из трансдуктанта W3350 Val_0.1 ^R leu::Tn10 был выведен штамм с двойной мутацией, который рос на минимальной среде, содержащей 20 мг/мл L-валина и 0.05 мг/мл L-лейцина.

<2>Получение штамма VL1991, продуцирующего L-валин.

В E.coli VL1970 (ВКПМ В-4411, патент США 5658766) был введен ген, участвующий в образовании устойчивости к высокой концентрации треонина (более 40 мг/мл) или гомосерина (более 5 мг/мл), который был выделен из штамма В3996, содержащего мутацию (rhtA23), вызывающую такую устойчивость (патент США 5705371). Таким образом был получен штамм VL1971.

Затем гены утилизации сахарозы из E.coli VL478 были введены в VL1971 методом трансдукции с использованием фага Р1 для получения VL1972. Далее из VL1972 был получен спонтанный мутант VL1991, который рос быстрее, чем родительский штамм.

<3> Введение устойчивости к L-валину в штамм VL1991.

Мутации, содержавшиеся в упомянутом выше штамме с двойной мутацией, были введены в VL1991 методом трансдукции фагом Р1. Спонтанный мутант с фенотипом Leu⁺ был отобран среди трансдуктантов. Мутант был обозначен как VL1997. Затем ген ilvD с интегрированным в него Тn10 (ilvD::Tn10) был введен в VL1997 методом трансдукции Р1 для получения VL1997 ilvD::Тn10. После этого VL1997 ilvD: : Тn10 был трансдуцирован опероном ilvGMEDA из E.coli штамма В. Из полученного таким образом VL1998 был отобран спонтанный мутант VL1999, который рос быстрее, чем родительский штамм.

<4> Штамм VL1999/pVL715, продуцирующий L-валин.

Штамм VL1999 был трансформирован плазмидой pVL715 для получения продуцирующего L-валин рекомбинантного штамма VL1999/pVL715. Плазмида pVL715 была сконструирована следующим образом. BamHI-XmaIII фрагмент ДНК, содержащий гены ilv (ilvGMEDAYC), был выщеплен из содержащей эти гены плазмиды pVR12 (Гаврилова и др.. Биотехнология, 4, 5, 600-608(1988)), и впоследствии введен в pAYC32, производную RSF1010 (Chistoserdov and Tsygankov, Plasmid, 1986, 16, 161-167), с заменой BamHI-XmaIII фрагмента ДНК плазмиды pAYC32 с получением плазмиды pVS712. Затем была получена плазмида pVL715, супресируюшая мутацию valS91, оказывающую влияние на валил-тРНК синтетазу (патент США 5658766), из плазмиды pVS712 следующим образом. Плазмида pVS712 была введена в мутант valS91. Полученный штамм ValS91/pVS712 сохранял ауксотрофность по валину как штамм-реципиент. Затем были отобраны ревертанты, способные к росту на минимальной среде, не содержащей валин. В некоторых из них эта способность была определена мутацией в генах ilvGMEDAYC. содержащихся в плазмиде pVS712. Из одного из ревертантов была выделена плазмида pVL715. В штаммах, содержащих pVL715, по крайней мере активность AHAS была увеличена в сравнении с штаммами, содержащими pVS712.

<5> Выявление мутаций, придающих устойчивость к L-валину.

Ген ilvH из W3550 Val_0.1 ^R и VL1997 был клонирован, и его нуклеотидная последовательность была определена. Клонирование гена ilvH было осуществлено амплификацией фрагмента ДНК от области промотора до 3'-конца гена ilvH методом ПЦР с использованием затравок, нуклеотидная последовательность которых приведена в списке последовательностей под номерами 3 и 4 (SEQ ID No.3 and 4). Условия ПЦР: 94^oС - 60 сек, 48^oС - 30 сек, 72^oС - 90 сек, 30 циклов. Амплифицированный ген ilvH был обработан фрагментом Кленова и клонирован в вектор pUC19 по сайту рестрикции Hinc II с получением pILVIH1 и pILVIH1,2. Подобным образом нативный оперон ilvH из штамма W3550 был клонирован в pUC19 с получением pILVIH.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей выявил, что мутантный оперон ilvH из W3550 Val_0.1 ^R содержит замену С на Т в позиции 50 и что VL1997 содержит две замены: С на Т в позиции 50 и G на А в позиции 41 в последовательности SEQ ID No. l. Эти мутации вызывают аминокислотные замены ¹⁷Ser на Phe и ¹⁴Gly на Asp. Мутации ¹⁷Ser на Phe и ¹⁴Gly на Asp могут быть названы как мутации ilvH1 и ilvH2 соответственно. Гены ilvH, содержащие одну или обе эти мутации, обозначены как ilvH1, ilvH2 и ilvH 1,2 соответственно.

<6> Разделение мутации ilvH1 и мутации ilvH2 из мутантного гена ilvH1,2.

С целью оценки влияния каждой мутации ilvH 1,2 эти мутации были разделены сайт-направленным мутагенезом с использованием ПЦР.

Для получения мутантного гена ilvH, содержащего только одну мутацию ¹⁴Gly на Asp, был использован тот факт, что эта мутация приводит к образованию единичного сайта рестрикции MluI (фиг.1). Затем были синтезированы две затравки с нуклеотидными последовательностями SEQ IN No.5 и 6.

С использованием этих затравок была подвергнута амплификации плазмида pILVIH1,2, содержащая клонированный ген ilvH1,2. Таким образом был получен линейный фрагмент ДНК размером около 5 т.п.н. с сайтами рестрикции MluI на концах. Этот продукт ПЦР был обработан MluI с последующим лигированием с получением кольцевой плазмиды pILVIH2, содержащей только заданную мутацию. Это было подтверждено также и анализом нуклеотидной последовательности.

Для получения мутантного гена ilvH, содержащего только одну мутацию ¹⁷Ser на Phe, были синтезированы две затравки с нуклеотидными последовательностями SEQ IN No.7 и 8 (фиг.2).

С использованием этих затравок была подвергнута амплификации плазмида pILVIH, содержащая нативный оперон ilvIH. Полученный продукт ПЦР содержал сайты рестрикции StuI на концах, образованные в результате замены кодона АТА, кодирующего изолейцин, на адекватный ему кодон АТТ. Фрагмент был обработан StuI и лигирован с образованием кольцевой плазмиды pILVIPH1', содержащей заново введенную точечную мутацию ¹⁷Ser на Phe. Это было подтверждено анализом нуклеотидной последовательности гена ilvHl в плазмиде.

<7> Выявление других мутаций, придающих устойчивость к L-валину.

Гены ilvH из двух полученных описанным выше способом из Е. coli W3350 мутантов, устойчивых к L-валину, были клонированы, и их нуклеотидная последовательность определена. В результате было выявлено, что в одном мутанте причиной является замена Т на А в позиции 85 последовательности SEQ ID No. 1 и замена А на С в позиции 87 последовательности SEQ ID No. 1 в другом. Эти мутации вызывают замену ²⁹Asn на Туг и Lys соответственно. Мутации ²⁹Asn на Туг и ²⁹Asn на Lys могут быть названы как ilvIH3 и ilvIH4 соответственно. Опероны ilvIH с этими мутациями были клонированы в pUC19 для получения pILVIH3 и pILVIH4 соответственно.

Подобным методом был клонирован в pUC19 оперон pILVIH из E.coli MI262 (IlvI^-, IlvB^-, IlvG^-), полученной из E.coli Genetic Stock Center, которая имеет известные мутации в AHAS III, ilvH612 (Guardiola et al., J.Bacteriol., 120, 536-538(1974); De Felice et al., J.Bacteriol., 120, 1068-1077 (1974)) с целью получения pILVIH262. Ген ilvH в опероне в pILVIH262 содержит мутации (ilvH612): С на А в позиции 87 последовательности SEQ ID No.l и С на Т в позиции 274 последовательности SEQ ID No.l. Вследствие этих мутаций происходит замена ²⁹Asn на Lys, a ⁹²Gin на стоп-кодон (TAG) соответственно. Кстати, ген ilvI в опероне ilvIH из MI262 содержит мутацию (ilvl614), вследствие которой продукт экспрессии гена ilvI не обладает энзиматической активностью. BamHI фрагмент плазмиды pILVIH262, содержащий мутировавший ген ilvl, был замещен BamHI фрагментом, содержащим нативный ген ilvI из pILVIH, для получения pILVIH612.

<8> Введение гена ilvH1 в нативный штамм E.coli.

Мутантный ген ilvH1 был введен в хромосому штамма E.coli W3350 с использованием описанного выше метода (Parker and Marinus, Gene, 73, 531-535 (1998)). Так был получен штамм W3350 ilvH1. Доказано, что этот штамм обладает устойчивостью к L-валину в концентрации до 1 мг/мл, что соответствует такому же уровню устойчивости, как и для штамма W3350 Val_0.1 ^R.

Таким образом, анализ последовательности гена ilvHl и мутации ilvHI, которая была отделена от мутации ilvH2 в мутанте ilvHl,2 методом сайт-направленного мутагенеза, подтвердил точечную мутацию ¹⁷Ser на Phe, вызывающую у клеток устойчивость низкого уровня к L-валину.

<9> Влияние различных мутаций в ilvH на устойчивость AHAS III к ингибированию L-валином.

Мутации ilvHl (¹⁷Ser на Phe), ilvH2 (¹⁴Gly на Asp), ilvH3 (²⁹Asn на Lys), ilvH4 (²⁹Asn на Туr) и ilvH612 (²⁹Asn на Lys ⁹²Gln на стоп-кодон TAG) придают ферменту AHAS III устойчивость к ингибированию L-валином следующим образом. А именно штамм E.coli MI262, лишенный активности AHAS, после введения плазмид, содержащих различные гены ilvH, проявлял активность с различным уровнем устойчивости к L-валину (таблица 1). Видно, что AHAS из штаммов, содержащих плазмиды pILVIH2 и pILVIH612, проявляет наивысший уровень устойчивости к L-валину.

<10> Влияние различных мутаций ilvH на продукцию L-валина.

Было изучено влияние различных мутаций ilvH на продукцию L-валина. Мутации были введены в хромосому штаммов VL1970 и VL1999/pVL715. Кстати, штамм W3350 - родительский по отношению к штаммам VL1970 и VL1999 - не экспрессирует активную синтетазу II ацетогидроксикислот ввиду того, что родительский штамм содержит мутацию, приводящую к сдвигу рамки считывания в гене ilvG. С другой стороны, штаммы VL1970 и VL1999 экспрессируют активную AHAS II.

После введения различных мутаций ilvH в штамм VL1970 были получены новые штаммы VL1970 ilvH1, VL1970 ilvH1,2, VL1970 ilvH3, VL1970 ilvH4, VL1970 ilvH612. Кроме того, после введения различных мутаций ilvH в штамм VL1999/pVL715 были получены новые штаммы VL1999 ilvHl,2/pVL715, VL1999 ilvH3/pVL715, VL1999 ilvH612/pVL715. Каждый из этих штаммов вместе с соответствующими родительскими штаммами выращивался при 37^oС в течение 18 часов в питательном бульоне, затем 0.3 мл полученной культуры были пересажены в 3 мл среды для ферментации следующего состава в пробирках (20200 мм) и выращивались при 37^oС в течение 72 часов в качалке (250 об/мин). После выращивания количество накопленного в среде L-валина и поглощение среды при 560 нм определялись с помощью известных методов.

Результаты представлены в таблице 2 и таблице 3. В этих таблицах ilvH⁺ обозначает нативный ген ilvH.

Состав среды для ферментации, г/л:
Глюкоза - 80
(NH₄)₂SO₄ - 22
K₂HPO₄ - 2
NaCl - 0,8
MgSO₄7H₂O - 0,8
FeSO₄7H₂O - 0,02
MnSO₄5H₂O - 0,02
Тиамин гидрохлорид - 0,2
Дрожжевой экстракт (Sigma) - 1,0
СаСО₃ - 30
(СаСО₃ был предварительно отдельно стерилизован)
Из таблиц 2 и 3 видно, что введение описанных выше мутаций в ilvH повышает продукцию L-валина соответствующих штаммов - продуцентов валина. Также, комбинация мутаций ilvH1 и ilvH2 дает лучший результат.

Производные плазмиды pUC19 с опероном ilvIH, содержащим различные мутации в гене ilvH, были введены в штамм W3350. Штамм W3350 не экспрессирует активный AHAS II ввиду того, что в нем присутствует мутация, вызывающая сдвиг рамки считывания в гене ilvG. Из таблицы 4 видно, что полученные трансформанты продуцируют L-валин, а наиболее продуктивен штамм, содержащий плазмиду pILVIH1,2.

Ранее авторы настоящего изобретения заметили, что в течение ферментации с целью получения L-валина активность AHAS в клетках-продуцентах постепенно уменьшается. Было показано, что период полураспада для AHAS III при 45^oС составляет 144 мин, а для AHAS II - 44 мин (Alexander-Caudle et al., J.Bacteriol. 172, 3060-3065 (1990)). Можно предположить, что такая увеличенная термостабильность AHAS III отражает общую повышенную стабильность фермента. Вследствие этого можно полагать, что AHAS III, устойчивая к L-валину, дает положительный эффект в продукции L-валина из-за повышенной стабильности в сравнении с AHAS II.

Список последовательностей нуклеотидов приведен в конце описания.

Формула изобретения

1. Малая субъединица изозима III синтетазы ацетогидроксикислот из Escherichia coli, содержащая мутацию, приводящую к замене аминокислотного остатка, соответствующего сериновому остатку в положении 17, на остаток фенилаланина в последовательности, приведенной в списке последовательностей под 2 (SEQ ID No: 2), или одновременно две мутации, приводящие к замене аминокислотного остатка, соответствующего сериновому остатку в положении 17, на остаток фенилаланина и к замене аминокислотного остатка, соответствующего, глициновому остатку в положении 14, на остаток аспарагиновой кислоты в последовательности, приведенной в списке последовательностей под 2 (SEQ ID No:2).

2. Фрагмент ДНК, кодирующий малую субъединицу изозима III синтетазы ацетогидроксикислот по п.1.

3. Изозим III синтетазы ацетогидроксикислот из Escherichia coli, который не ингибируется L-валином и обладает каталитической активностью в двух реакциях: реакции синтеза -ацетолактата из пирувата и реакции синтеза -ацето--гидроксибутирата из -кетобутирата и пирувата; и в котором малая субъединица содержит мутацию, приводящую к замене аминокислотного остатка, соответствующего сериновому остатку в положении 17, на остаток фенилаланина, или мутацию, приводящую к замене аминокислотного остатка, соответствующего аспарагиновому остатку в положении 29, на остаток лизина или тирозина, или мутацию, приводящую к делеции С-концевого участка, начиная с аминокислоты в положении 91 в последовательности, приведенной в списке последовательностей под 2 (SEQ ID No:2), или комбинацию двух или более мутаций, выбранных из группы описанных выше мутаций, и мутации, приводящей к замене аминокислотного остатка, соответствующего глициновому остатку в положении 14, на остаток аспарагиновой кислоты в последовательности, приведенной в списке последовательностей под 2 (SEQ ID No:2).

4. Фрагмент ДНК, кодирующий изозим III синтетазы ацетогидроксикислот по п.3.

5. Способ получения L-валина, включающий в себя стадии выращивания штамма бактерии Escherichia coli, содержащего фрагмент ДНК по п.2 или 4 в хромосомной ДНК или на плазмиде, находящейся в штамме указанной бактерии, и обладающего способностью к продукции L-валина, в питательной среде, обеспечивающей продукцию и накопление L-валина, и выделения L-валина из питательной среды.

6. Штамм бактерии Escherichia coli VL1999ilvHl, 2/pVL715, содержащий фрагмент ДНК по п.2 в хромосомной ДНК и обладающий способностью к продукции L-валина.

7. Штамм бактерии Escherichia coli VL1999ilvH3/pVL715, содержащий фрагмент ДНК по п.4 в хромосомной ДНК и обладающий способностью к продукции L-валина.

8. Штамм бактерии Escherichia coli W3350/pILV1999ilvIHl,2, содержащий фрагмент ДНК по п.2 на плазмиде и обладающий способностью к продукции L-валина.

9. Штамм бактерии Escherichia coli W3350/pILV1999ilvH3, содержащий фрагмент ДНК по п.4 на плазмиде и обладающий способностью к продукции L-валина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9