Фрагмент днк rhtb, кодирующий синтез белка rhtb, придающего устойчивость к l-гомосерину бактериям escherichia coli, и способ получения l-аминокислот

 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии. Фрагмент ДНК rhtB кодирует синтез белка RhtB, который придает повышенную устойчивость к L-гомосерину бактериям Escherichia coli. На основе мультикопийной плазмиды pRhtB, содержащей этот фрагмент, сконструированы штаммы Escherichia coli, способные к повышенной продукции L-аминокислот по сравнению со штаммами, не содержащими плазмиду pRhtB. Аминокислоты получают путем культивирования соответствующих штаммов в подходящих питательных средах с последующим выделением и очисткой целевой аминокислоты. Изобретение позволяет увеличить выход L-аминокислот. 2 с. и 5 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и, в частности, касается способа получения аминокислот, а именно L-гомосерина, L-треонина, L-аланина, L-валина или L-изолейцина, с помощью бактерий, принадлежащих к роду Escherichia.

В качестве ближайшего аналога может быть рассмотрен фрагмент ДНК, кодирующий ген rhtA, связанный с устойчивостью бактерий к L-гомосерину и L-треонину на минимальной среде, а также полученные на основе использования мутации этого гена rhtA23 (ранее обозначавшийся как thrR) штаммы Escherichia coli, продуцирующие L-треонин (Авторское свидетельство СССР N 974817; Астаурова и др. Прикладная биохимия и микробиология, т. 21, стр. 611 - 616, 1985), или L-гомосерин и L-глутаминовую кислоту (Астаурова и др. Прикладная биохимия и микробиология, т. 27, стр. 556 - 561, 1991).

Ген rhtA дикого типа обеспечивает устойчивость к L-гомосерину и L-треонину, если он клонирован в мультикопийной плазмиде, и повышение его экспрессии повышает продукцию аминокислот бактериями, принадлежащими к роду Escherihia и способными продуцировать L-треонин, L-лизин, L-валин или L-аргинин. Было обнаружено, что мутация rhtA 23 расположена на 18 минуте карты хромосомы E.coli, а ген rhtA идентифицирован как orf1, открытая рамка считывания, локализующаяся между генами pexB и ompX. Генетическая структура, экспрессирующая белок, кодируемый orf1, была обозначена как ген rhtA (rht-resistance to homoserine and threonine - устойчивость к гомосерину и треонину). Ген rhtA включает 5'-некодирующую область, в том числе SD-последовательность, саму открытую рамку считывания, orf1, и терминатор. Мутация rhtA23 изменяет нуклеотид, непосредственно предшествующий инициаторному кодону ATG и повышает экспрессию гена rhtA (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francicco, California August 24-29, 1997, N 457).

В процессе клонирования гена rhtA обнаружено, что существуют, по крайне мере, два гена, которые в мультикопийном состоянии сообщают клеткам устойчивость к L-гомосерину. Один из них - это rhtA, в то время как другой ген оставался неизвестным.

Задачей настоящего изобретения является повышение уровня накопления аминокислот клетками бактерий рода Escherichia, продуцирующими L-гомосерин, L-треонин, L-аланин, L-валин или L-изолейцин.

Поставленная задача решается получением фрагмента ДНК rhtB, кодирующего синтез белка RhtB, придающего устойчивость к L-гомосерину бактериям Е. coli, и конструированием на его основе штаммов, позволяющих разработать способ получения аминокислот с повышенным выходом целевой аминокислоты.

Предметом настоящего изобретения являются: 1. ДНК, кодирующая белок, характеризующийся одним из двух свойств (А или Б): А - белок, который состоит из аминокислотной последовательности N 2 (фиг. 2).

Б - белок, который состоит из аминокислотной последовательности, включающей также делеции, замены, вставки или добавки из одной или нескольких аминокислот к последовательности N 2, и который имеет активность, обеспечивающую бактериям, содержащим этот белок, устойчивость к L-гомосерину.

2. ДНК по п. 1, которая определена как ДНК, имеющая одну из следующих характеристик (А или Б), А - ДНК, которая состоит из нуклеотидной последовательности, соответствующей нуклеотидам под номерами от 557 по 1171 в нуклотидной последовательности, представленной в формуле изобретения и обозначенной как последовательность N 1.

Б - ДНК, которая в жестких условиях гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, соответствующей нуклеотидам под номерами от 557 по 1171 в нуклеотидной последовательности N 1, и которая кодирует белок, имеющий активность, сообщающую бактериям, содержащим этот белок, устойчивость к L-гомосерину.

3. Бактерии, принадлежащие к роду Escherihia, у которых устойчивость к L-гомосерину повышена путем амплификации числа копий ДНК по п. 1 - 2 в клетках бактерий.

4. Бактерии по п. 3, где ДНК по п. 1 - 2 расположена в мультикопийном векторе в клетках бактерий.

5. Способ получения аминокислот, включающий этап культивирования бактерий, соответствующих любому из пунктов с 3 по 4 и обладающих способностью к продукции аминокислот, в культуральной среде, обеспечивающей продукцию и накопление соответствующей аминокислоты в этой среде, и выделения накопившейся аминокислоты из этой среды.

7. Способ по п. 6, где аминокислота является одной из аминокислот в группе, состоящей из L-гомосерина, L-треонина, L-аланина, L-валина и L-изолейцина.

Фрагмент ДНК rhtB в настоящем изобретении представляет собой "ген rhtB", а белок, кодируемый этим геном, - "белок RhtB". Этот белок участвует в обеспечении устойчивости бактерий к L-гомосерину (то есть бактерии, содержащие этот белок, устойчивы к L-гомосерину), а его активность обозначена как "Rh-активность". Структурный ген, кодирующий белок RhtB, обозначен как ген rhtB. Термин "повышение Rh- активности" означает придание клеткам устойчивости к L-гомосерину либо путем увеличения числа молекул RhtB белка, или увеличением специфической активности этого белка, или нарушением негативной регуляции экспрессии или активности RhtB белка и т.п. Термин "ДНК, кодирующая белок", обозначает двунитевую ДНК, одна из нитей которой кодирует белок. Устойчивость к L-гомосерину означает свойство бактерий расти на минимальной среде, содержащей L-гомосерин в концентрации, при которой штамм дикого типа, несущий природный аллель гена rhtB, не может расти, обычно это 10 мг/мл. Способность продуцировать аминокислоту означает свойство бактерий синтезировать и накапливать аминокислоту в культуральной среде.

Настоящее изобретение представляет собой фрагмент ДНК, включающий нуклеотидную последовательность от 557 по 1171 нуклеотид в нуклеотидной последовательности N 1 (см. формулу изобретения). Этот фрагмент кодирует белок с Rh-активностью, имеющий аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2 ("Аминокислотная последовательность белка RhtB").

ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, указанную в формуле изобретения (Последовательность N 1), соответствует части последовательности, которая комплементарна последовательности M87049 в GenBank и включает известную предполагаемую открытую рамку считывания fl38 (нуклеотиды с 61959 по 61543 в последовательности М-87049), функция которой неизвестна и которая расположена на хромосоме E.coli в районе 86,8 минуты карты, а также 201 пару оснований проксимальнее fl38. Следовательно, рамки считывания в последовательности, которая приведена в формуле изобретения, и в M87049 различаются между собой. Таким образом, белок RhtB и ген rhtB, кодирующий этот белок, являются новыми, не известными ранее.

Ген rhtB получают либо путем инфицирования лизогенного по Mucts штамма E. coli лизатом фазмиды миниMu d50005, как это описано Гройсманом с соавт. (Groisman et al. J. Bacteriol., 158, 357-364, 1986) с последующим выделением плазмидной ДНК из колоний, выросших на минимальной среде, содержащей 40 мкг/мл канамицина и 10 мг/мл L-гомосерина, как это показано в примере 1, либо из хромосомы E.coli путем гибридизации колоний или с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (White et al. Trends Genet., 5, 185, 1989), используя олигонуклеотиды, имеющие последовательность, соответствующую участку в районе 86 минуты хромосомы E.coli.

Другой подход предполагает синтез олигонуклеотида в на основе последовательности N 1. Используя олигонуклеотиды, имеющие последовательность, соответствующую участку ДНК, который расположен проксимальнее нуклеотида 557, и участку ДНК, который расположен дистальнее нуклеотида 1171 в последовательности N 1 в качестве праймеров для ПЦР, можно амплифицировать всю кодирующую область.

Синтез олигонуклеотидов осуществляют обычным методом, например, с помощью фосфоамидитного метода (см. Tetrahedron Letters, 22, 1859, 1981) с использованием коммерческого ДНК-синтезатора (например, ДНК синтезатора модели 380В, производимого Applied Biosystems). ПЦР осуществляют с использованием коммерчески доступных аппаратов для ПЦР (например, ДНК-термоциклера, модель PG 2000, производимого компанией Takara Shuzo Co., Ltd) с применением Taq ДНК полимеразы в соответствии с методикой, описанной поставщиком фермента.

ДНК, кодирующая белок RhtB по настоящему изобретению, может кодировать белок RhtB, включая делеции, замены, инсерции или добавки одной или нескольких аминокислот в одной или нескольких позициях, не нарушающих при этом активность RhtB белка. ДНК, кодирующая тот же белок, что и RhtB, описанный выше, может быть получена, например, путем модификации нуклеотидной последовательности, в частности при помощи сайт-направленного мутагенеза, так что один или более аминокислотный остаток будет делетирован, заменен, вставлен или добавлен. ДНК, модифицированная описанным выше способом, может быть получена известными методами с помощью мутационных воздействий. Мутационная обработка включает методы обработки ДНК, кодирующей RhtB белок, in vitro, например, при помощи гидроксиламина, или методы обработки микроорганизма, в частности бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и несущих ДНК, кодирующую RhtB, УФ-облучением или мутагенными агентами, такими как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (НГ) или азотистая кислота, которые обычно используются для индукции мутаций.

ДНК, кодирующую указанные варианты белка RhtB, отбирают путем экспрессии ДНК, подвергнутой in vitro мутагенному воздействию, как описано выше, в соответствующих клетках с последующим определением их устойчивости к L-гомосерину и отбором ДНК, которая обеспечивает эту устойчивость. Изобретение относится также к вариантам белка RhtB, которые встречаются в разных видах, штаммах и вариантах бактерий рода Escherichia и обусловлены природным разнообразием. ДНК, кодирующие эти варианты, гибридизуются в жестких условиях с ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида 557 по 1171 нуклеотид в последовательности N 1.

Термин "жесткие условия" означает здесь условия, при которых так называемая специфическая гибридизация происходит, а неспецифическая не происходит. Трудно четко выразить эти условия с помощью каких-то цифровых значений, однако, например, жесткие условия включают условия, при которых ДНК, имеющие высокую гомологию, например, не менее 70% гомологии по отношению друг к другу, гибридизуются, а ДНК, имеющие гомологию ниже указанной - нет.

В настоящем изобретении рассматривают бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, представленные здесь E.coli, у которых Rh-активность повышена. Это повышение Rh-активности происходит, например, за счет амплификации числа копий структурного гена rhtB в клетках при трансформации их рекомбинантной ДНК, в которую включен фрагмент, содержащий структурный ген rhtB, кодирующий RhtB белок, лигированный с промоторной последовательностью, которая эффективно функционирует в бактериях рода Echerichia. Rh-активность может быть также повышена в результате замены промоторной последовательности гена rhtB на хромосоме промоторной последовательностью, которая более эффективно функционирует в бактериях рода Escherichia.

Амплификация числа копий структурного гена rhtB в клетках может быть осуществлена также путем введения мультикопийного вектора, который несет структурный rhtB ген, в клетки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia. В частности, число копий может быть увеличено путем введения плазмиды, фага или транспозона (Berg, D. E. and Berg, С.М., Bio/Technol., 1, 417, 1983), содержащих структурный ген rhtB, в клетки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia. Мультикопийные вектора могут быть представлены плазмидными векторами, такими как pBR322, pMW118, pUC19 или подобными, или фаговыми векторами, такими как 1059, BF 101, m13MP9 или подобными. Транспозоны могут быть представлены фагом Mu, транспозонами Tn10, Tn5 или подобными. Введение ДНК в бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, может быть осуществлено, например, с помощью метода Моррисона (Methods in Enzymology., 68, 326, 1979) или метода, в котором реципиентные клетки бактерий подвергают воздействию хлористого кальция для увеличения их проницаемости по отношению к ДНК (Mandel and Higa, J. Mol. Biol., 53, 159, 1970) или другими подобными методами.

Обнаруженную связь между повышенной Rh-активностью и способностью бактерий рода Escherichia увеличивать продукцию L-аминокислот изобретатели используют для получения штаммов, обладающих повышенной продуктивностью аминокислот. При этом возможны два варианта: - Признак повышенной Rh-активности вводят в штаммы, уже способные продуцировать желаемые аминокислоты.

- Способность к продукции аминокислот придается штаммам, у которых Rh-активность повышена.

Сконструированные на основе фрагмента ДНК rhtB штаммы Е.coli NZ10/pAL4, pRhtB, Е. coli MG442/pVIC40, pRhtB и Е.coli MG442/pRhtB используют для получения аминокислот микробиологическим синтезом.

Новые штаммы депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Штамм Е. coli NZ10/pAL4, pRhtB депонирован под номером ВКПМ В-7658; штамм Е.coli MG442/pRhtB депонирован под номером ВКПМ В-7659; штамм Е.coli MG442/pVIC40, pRhtB депонирован под номером ВКПМ В- 7660.

Штамм Е. coli NZ10/pAL4, pRhtB (ВКПМ В-7658) имеет следующие культурально-морфологические и биохимические признаки.

Морфология клеток. Грамотрицательные слабоподвижные палочки с закругленными концами, 1,5-2,0 мкм в длину.

Культуральные признаки.

Мясо-пептонный агар. Через 24 часа роста при 37^oC образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 - 3,0 мм; поверхность колоний гладкая, края ровные или слегка волнистые, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется.

Агар Лурия. Через 24 ч роста при 37^oC образует беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 - 2,5 мм; поверхность колоний гладкая, края ровные, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется.

Агаризованная Среда Адамса.

Через 40-48 ч роста в присутствии L-треонина (0,1 - 0,5 г/л) при 37^oC образует колонии диаметром 0,5 - 1,5 мм; серовато-белые полупрозрачные, слегка выпуклые с блестящей поверхностью.

Рост в мясо-пептонном бульоне. После 24 ч роста - сильное равномерное помутнение, характерный запах.

Физиолого-биохимические признаки.

Рост по уколу в мясо-пептонном агаре. Хороший рост по всему уколу. Микроорганизм является факультативным анаэробом.

Желатину не разжижает.

Рост на молоке хороший с коагуляцией молока.

Индол не образует.

Отношение к температуре. Растет на мясо-пептонном бульоне при температурах 20 - 42^oC. Оптимальной температурой для роста является температура 33 - 37^oC.

Отношение к pH среды. Растет на средах с pH от 6,0 до 8,0. Оптимальное значение pH - 7,2.

Отношение к источникам углерода. Хорошо растет на глюкозе, фруктозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, глицерине, манните с образованием кислоты и газа.

Отношение к источникам азота. Усваивает азот в форме аммония, нитратов, а также азот некоторых органических соединений.

Устойчив к ампициллину и канамицину.

Содержание плазмид. Клетки содержат многокопийную гибридную плазмиду pAL4, обеспечивающую устойчивость к ампициллину и несущую ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I и обеспечивающий тем самым повышенный синтез L-гомосерина, а также многокопийную гибридную плазмиду pRhtB, несущую ген rhtB, сообщающий клеткам устойчивость к L-гомосерину (до 10 мг/мл) и детерминант устойчивости к канамицину.

Штамм Е. coli MG442/pRhtB (ВКПМ В-7659) имеет те же культурально-морфологические и биохимические признаки, что и штамм ВКПМ В-7658 (NZ10/pAL4, pRhtB), за исключением того, что он не нуждается для роста в треонине, рост его стимулируется изолейцином, и он содержит только плазмиду pRhtB, несущую ген rhtB и детерминант устойчивости к канамицину. Штамм устойчив к канамицину.

Штамм Е. coli MG442/pVIC40, pRhtB (ВКПМ В-7660) имеет те же культурально-морфологические и биохимические признаки что и штамм ВКПМ В-7659 (MG442/pRhtB), за исключением того, что он наряду с плазмидой pRhtB содержит многокопийную гибридную плазмиду pVIC40, несущую гены треонинового оперона и детерминант устойчивости к стрептомицину. Штамм устойчив к канамицину и стрептомицину.

Способ получения аминокислот культивированием штаммов-продуцентов осуществляют следующим образом.

Аминокислоту получают путем культивирования бактерий, у которых Rh активность повышена путем амплификации числа копий гена rhtB, как описано выше, и которые обладают способностью к продукции аминокислоты при культивировании их в культуральной среде, где происходит накопление аминокислоты, с последующим выделением этой аминокислоты из среды (культуральной жидкости). Аминокислота представлена преимущественно L-гомосерином, L-треонином, L-аланином, L-валином или L-изолейцином. В соответствии с настоящим изобретением культивирование бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, выделение и очистку аминокислоты из культуральной жидкости осуществляют известными методами. Для культивирования используют синтетическую или натуральную среду. Такая среда включает источник углерода, азота, минеральные соли и необходимые добавки в количествах, оптимальных для роста и биосинтеза. В качестве источника углерода используют различные углеводы, такие как глюкоза, сахароза, различные органические кислоты. В зависимости от ассимилирующих способностей можно применять спирты, включая этанол или глицерол. В качестве источника азота используют аммиак, различные соли аммония, такие как сульфат аммония, или другие азотсодержащие соединения, такие как амины, а также природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, или гидролизат микробных клеток. В качестве минеральных компонентов используются фосфат калия однозамещенный, сульфат магнезии, хлористый натрий, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция. Культивирование преимущественно осуществляют в аэробных условиях, таких как культивирование на мешалке, или с аэрацией и перемешиванием культуры. Температура культивирования - от 30 до 40^oC, преимущественно 30 - 38^oC. pH культуры - 5 - 9, преимущественно 6,5 - 7,2. pH культуры доводят до желаемых значений с помощью аммония, карбоната кальция, различных кислот, оснований или буферов. Культивирование осуществляют в течение 1 - 3 дней. После завершения культивирования выделение аминокислоты осуществляют путем удаления твердых частиц, таких как клетки, из среды с помощью центрифугирования или фильтрации через мембранные фильтры с последующим выделением и очисткой целевой аминокислоты с помощью ионообменника, фракционирования с помощью концентрации и кристаллизации.

Перечень фигур.

Фиг. 1. Клонирование и идентификация гена rhtB.

Фиг. 2. Аминокислотная последовательность белка RhtB (последовательность N 2).

Настоящее изобретение более конкретно поясняют нижеследующие примеры.

Пример 1. Получение фрагмента ДНК rhtB Этап 1. Клонирование гена rhtB на фазмиде миниMu.

Дикий аллель гена rhtB клонируют in vivo на фазмиде мини Mu (Groisman et al. J. Bacteriol., 168, 357 - 364, 1986). В качестве донора используют штамм MG442, лизогенизированный Mu cts62. Клетки заражают фагом миниMu d5005, индуцируют профаг, полученным фаголизатом инфицируют клетки штамма ВКПМ-513 Mu cts62 (Hfr K10 metB) и высевают на минимальную среду с метионином (50 мкг/мл), L-гомосерином (10 мг/мл) и канамицином (40 мкг/мл) при 30^oC. Из выросших через 48 часов колоний выделяют плазмидную ДНК, которой трансформируют штамм Е.coli ВКПМ В-513 по стандартной методике. Трансформанты отбирают на чашках с L-агаром и канамицином (40 мкг/мл). Из трансформантов, которые устойчивы к L-гомосерину, выделяют плазмидную ДНК, которую анализируют с помощью рестриктного анализа. Из донорного штамма были отклонированы вставки (фрагменты ДНК), принадлежащие к двум разным областям хромосомы. Таким образом, на хромосоме Е.coli обнаружено, по крайней мере, два гена, которые при амплификации сообщают штаммам Е.coli устойчивость к L-гомосерину. Один тип вставок содержит ген rhtA, о котором уже сообщалось (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francicco, California August 24-29, 1997). Второй тип вставок содержит минимальный фрагмент длиной 0,8 kb, сообщающий устойчивость к L-гомосерину (фиг. 1), обозначенный как rhtB.

Этап 2: Идентификация гена rhtB Полученный фрагмент rhtB секвенируют по двум цепям по методу Сенгера (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977) и выясняют, что этот фрагмент включает открытую рамку считывания f138 (с 61959 по 61543 нуклеотид в последовательности M7049, GenBank) и 201 нуклеотид, расположенный перед ней. Необходимо отметить, что вставка, содержащая открытую рамку считывания f138 только со 160 5'-фланкирующими нуклеотидами не обеспечивает устойчивости к L-гомосерину. Оказалось также, что указанная последовательность выше f138 не содержит стоп-кодона в рамке f138. Кроме того, одному из ATG кодонов в этой последовательности предшествует участок связывания с рибосомами (SD-последовательность, нуклеотиды с 62171 по 62166 в M87049). Эта удлиненная открытая рамка считывания (нуклеотиды 62160-61546) представляет собой структурный ген rhtB. Кодируемый им белок RhtB (фиг. 2.) является сильно гидрофобным белком и содержит 5 потенциальных трансмембранных сегментов.

Пример 2. Конструирование L-гомосерин-продуцирующего штамма Е. coli NZ10/pAL4, pRhtB (ВКПМ В-7658) и получение с его помощью L-гомосерина.

Фрагмент ДНК rhtB клонируют в многокопийный плазмидный вектор pUK21, являющийся производным известного вектора pUC19, в котором ген устойчивости к ампициллину был замещен геном устойчивости к канамицину (Vieira, Messing, Gene, 100, 189-194, 1991). В результате получают плазмиду pRhtB.

Штамм E. coli NZ10, который является Leu⁺ ревертантом известного штамма C600 (thrB, leuB) (Appleyard, Genetics., 39, 440-452, 1954), трансформируют плазмидой pAL4, которая представляет собой вектор pBR322, несущий ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I. В результате получают штамм E.coli NZ10/pAL4, способный к продукции L-гомосерина. Полученный штамм трансформируют плазмидой pRhtB или вектором pUK21 и в результате получают штаммы Е. coli NZ10/pAL4, pRhtB (ВКПМ В-7658) и Е.coli NZ10/pAL4, pUK21. Каждый из полученных штаммов культивируют при 37^oC в течение 18 часов в бульоне LB (Миллер, Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. Москва "Мир", 1976. cтр. 395), содержащем 50 мг/л канамицина и 100 мг/мл ампицилина. По 0.3 мл полученной культуральной жидкости вносят в 3 мл ферментационной среды, имеющей состав, указанный ниже, и содержащей 50 мг/мл канамицина и 100 мг/мл ампицилина, содержащейся в пробирках 20 х 2 см, и культивируют при 37^oC 46 часов на роторной качалке.

Состав ферментационной среды (г/л): Глюкоза - 80 (NH₄)₂S0₄ - 22 K₂HP0₄ - 2
NaCl - 0.8
MgSO₄ 7H₂O - 0.8
FeSO₄ 7H₂O - 0.02
MnSO₄ 5H₂O - 0.02
Тиамин HCl - 0.2
Дрожжевой экстракт - 1.0
CaCO₃ - 30 (добавляют после стерилизации)
После культивирования определяют количество накопившегося в среде L-гомосерина и оптическую плотность культуральной жидкости при 560 нм известными методами. Как показано в табл. 1., штамм NZ10/pAL4, pRhtB накапливает гомосерин в большем количестве, чем штамм NZ10/pAL4, pUK21, в котором число копий гена rhtB не увеличено.

Пример 3. Конструирование штамма-продуцента L-аланина, L-валина и L-изолейцина Е. coli MG442/pRhtB (ВКПМ В-7659) и получение L-аланина, L-валина и L-изолейцина с его помощью.

Известный штамм E. coli MG442 (Гусятинер и др., 1978, Генетика, 14, 947-956) трансформируют плазмидой pRhtB или вектором pUK21 и в результате получают штаммы Е.coli MG442/pRhtB (ВКПМ В-7659) и Е.coli MG442/pUK21.

Каждый из полученных таким образом штаммов культивируют при 37^oC 18 часов в LB бульоне с 50 мг/л канамицина. Затем по 0.3 мл полученной культуральной жидкости внесят в пробирки 20 х 2 см с 3 мл ферментационной среды, описанной в примере 3, содержащей 50 мг/л канамицина, и культивировали при 37^oC 40 часов на роторной качалке. После культивирования количество накопленных в среде L-аланина, L-валина и L-изолейцина, а также оптическую плотность культуральной жидкости при 560 нм измеряют известными методами. Результаты представлены в табл. 2.

Как показано в табл. 2, штамм MG442/pRhtB накапливает больше L-аланина, L-валина и L-изолейцина чем штамм MG442/pUK21, в котором число копий гена rhtB не увеличено
Пример 4. Конструирование штамма-продуцента L-треонина Е.coli MG442/pVIC40, pRhtB (ВКПМ В-7660) и получение L-треонина с его помощью.

Для получения нового штамма-продуцента L-треонина Е.coli MG442/pVIC40, pRhtB в качестве реципиента используют штамм Е.coli MG442 (см. пример 3). Этот штамм трансформируют известной плазмидой pVIC40 (U.S. Patent No 5, 75, 107, 1992). Трансформанты отбирают на чашках с LB агаром, содержащим 100 мг/л стрептомицина, и получают штамм MG442/pVIC40. Штамм MG442/pVIC40 трансформируют плазмидами pRhtB или pUK21 и получают штаммы MG442/pVIC40, pRhtB (ВКПМ В-7660) и MG442/pVIC40, pUK21.

Каждый из этих штаммов культивируют при 37^oC 18 часов в LB бульоне как в примере 2 с 50 мг/л канамицина и 100 мг/л стрептомицина. Затем 0,3 мл полученной культуральной жидкости вносят в пробирки 20 х 2 см с 3 мл ферментационной среды, описанной в примере 2, содержащей 50 мг/л канамицина и 100 мг/л стрептомицина, и культивируют при 37^oC 46 часов на роторной качалке. После культивирования количество накопившегося в среде L-треонина и оптическую плотность культур при 560 нм измеряют известными способами. Результаты представлены в табл. 3.

Как показано, в табл. 3, штамм MG442/pVIC40, pRhtB накапливает L-треонин в большем количестве чем штамм MG442/pVIC40, pUK21, у которого число копий гена rhtB не увеличено.

Формула изобретения

1. Фрагмент ДНК rhtB, кодирующий синтез белка RhtB, придающего устойчивость к гомосерину бактериям Escherichia coli, содержащий регуляторные элементы гена rhtB и структурную часть гена rhtB и имеющий нуклеотидную последовательность (последовательность N 1), приведенную в графической части.

2. Способ получения L-аминокислот путем культивирования устойчивых к L-гомосерину штаммов - продуцентов бактерий рода Escherichia в подходящей питательной среде с последующим выделением и очисткой целевой аминокислоты, отличающийся тем, что в качестве продуцентов используют бактерии E.coli с повышенной устойчивостью к L-гомосерину, которая обусловлена повышенным содержанием в клетках этих бактерий белка RhtB, кодируемого фрагментом ДНК rhtB по п.1.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что получают аминокислоту L-гомосерин.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что получают аминокислоту L-треонин.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что получают аминокислоту L-аланин.

6. Способ по п.2, отличающийся тем, что получают аминокислоту L-валин.

7. Способ по п. 2, отличающийся тем, что получают аминокислоту L-изолейцин.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7