Способ лечения ожирения
Изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии, и касается лечения инсулининдуцированного ожирения. Для этого предлагается человеку, использующему инсулин, в частности, при диабете, дополнительно вводить амилин или агонист амилина. Способ обеспечивает снижение веса пациента, что значительно облегчает течение заболевания. 5 з.п. ф-лы, 8 табл.
Настоящая заявка является заявкой в частичное продолжение патентной заявки США 08/870762, поданной 6 июня 1997 г., содержание которой полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Настоящее изобретение относится к способам лечения ожирения. Более конкретно изобретение относится к использованию амилина или агониста амилина при лечении ожирения. Амилин В настоящее время имеются обзоры, посвященные структуре и биологическому действию амилина. (См. , например. Rink et al.. Trends in Pharmaceutical Sciences, 14: 113-118 (1993); Gaeta and Rink, Med. Chem. Res., 3:483-490 (1994); and Pittner et al. , J. Cell Biochem., 553:19-28 (1994)). Амилин представляет собой гормон белковой природы, состоящий из 37 аминокислот. Он был выделен, очищен и охарактеризован, как основной компонент амилоидных отложений в панкреатических островках умерших людей с диабетом типа 2 (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8628-8632 (1987)). Молекула амилина имеет две важных посттрансляционных модификации: С-конец ее амидирован (например, 37-ой аминокислотный остаток представлен тирозинамидом), и цистеины в положении 2 и 7 сшиты поперечными связями с образованием N-концевой петли (через цистиновый остаток). Последовательность в открытой рамке считывания гена человеческого амилина демонстрирует наличие сигнала для протеолитического расщепления в области сайта двухосновных аминокислот Lys-Arg, расположенного перед N-концевым кодоном для Lys, и при Gly, расположенного перед Lys-Arg протеолитическим сигналом в С-концевом положении, что характерно для последовательности, распознаваемой протеинамидазным ферментом ПАМ (РАМ) (Cooper et al., Biochem. Biophys. Acta, 1014:247-258 (1989)). Амилин описан и заявлен в патенте США 5367052, выданном 22 ноября 1994 г. Было показано, что при диабете типа 1 имеется дефицит амилина, в связи с чем было предложено перейти на комбинированное лечение, включающее инсулин, как предпочтительный способ лечения всех форм диабета в сравнении с применением только одного инсулина. Использование амилина и других амилиновых агонистов при лечении сахарного диабета является объектом изобретения в патенте США 5175145, выданном 29 декабря 1992 г. Фармацевтические композиции, содержащие амилин и амилин плюс инсулин, описаны и заявлены в патенте США 5124314, выданном 23 июня 1992 г. Отмечалось, что действие амилина при его избытке имитирует ключевые признаки диабета типа 2, и поэтому блокада амилина была предложена в качестве новой терапевтической стратегии. В патенте США 5266561, выданном 30 ноября 1993 г., раскрывается, что амилин вызывает снижение как базового, так и инсулинстимулированного включения меченой глюкозы в гликоген скелетной мышцы. Последний эффект был раскрыт также в контексте пептида, связанного с геном кальцитонина (КГСП (CGRP)) (см. также Leighton and Cooper, Nature, 335: 632-635 (1988)). Имеются также данные о том, что амилин снижает инсулинстимулированное поступление глюкозы в скелетную мышцу и снижает содержание гликогена (Young et al., Amer. J. Physiol., 259:45746-1 (1990)). Раскрывается также лечение диабета типа 2 и инсулинрезистентности амилиновыми агонистами. Последовательность амилина примерно на 50% гомологична последовательности КГСП, белков, состоящих также из 37 аминокислот, которые, будучи широко распространены в качестве нейротрансмиттеров, характеризуются многообразной мощной биологической активностью, включая вазодилатацию. Амилин и КГСП имеют 2Cys-7Cys дисульфидный мостик и С-концевой остаток в виде амида аминокислоты, оба из которых важны для проявления полной биологической активности (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 857763-7766 (1988)). Как сообщалось, амилин может быть одним из членов семейства родственных пептидов, включающих КГСП, инсулин, инсулинподобные ростовые факторы и релаксины, и которые характеризуются общими генетическими корнями (Cooper et al., Prog. Growth Factor Research, 1:99-105 (1989)). Амилин синтезируется в основном в панкреатических бета-клетках и затем секретируется в ответ на пищевые раздражители, такие как глюкоза и аргинин. Исследования на линиях клонированных опухолевых бета-клеток (Moore еt al., Biochem. Biophys. Res. Commun. , 179 (1) (1991)) показали, что пищевые средства, усиливающие секрецию, такие как глюкоза и аргинин, стимулируют высвобождение амилина и инсулина. Коэффициент молярного отношения амилин:инсулин в секретируемых белках варьирует в препаратах от примерно 0,01 до 0,4, но, по всей видимости, не варьирует в значительной мере в ответ на острые стимулы в пределах любого одного препарата. Однако, в ходе продолжительной стимуляции повышенными уровнями глюкозы коэффициент отношения амилин:инсулин может прогрессивно возрастать (Gedulin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. , 180(1), 782-789 (1991)). Таким образом, амилин и инсулин не всегда секретируются с постоянной скоростью. Было показано, что некоторые действия амилина имеют сходство с некоторыми неметаболическими функциями КГСП и кальцитонина; однако метаболические функции амилина, обнаруженные в процессе изучения указанного нового идентифицированного белка, по всей видимости, отражают его преимущественную биологическую роль. При этом по меньшей мере некоторые из этих метаболических функций имитируются КГСП, хотя и в дозах, которые обладают выраженным вазодилатационным эффектом (см. также Leighton et al., Nature, 335:632-635 (1988)); Molina et al., Diabetes, 39:260-265 (1990)). Первым обнаруженным действием амилина было снижение стимулируемого инсулином включения глюкозы в гликоген скелетной мышцы крысы (Leighton et al.. Nature, 335:632-635 (1988)), при этом мышца становится "инсулинрезистентной". Последующая работа с камбаловидной мышцей крысы ex-vivo и in vitro указывают на то, что амилин снижает гликогенсинтазную активность, ускоряет превращение гликогенфосфорилазы из неактивной b формы в активную а форму, способствует итоговой потере гликогена (в присутствии или в отсутствие инсулина), повышает уровень глюкоза-6-фосфатазы и может повышать общий выход лактазы (см., например, Deems et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. , 181 (1):116-120 (1991); Young et al., FEBS Letts, 281 (1,2):149-151 (1991)). Амилин, по всей видимости, не влияет на транспорт глюкозы per se (см., например, Pittner et al., FEBS Letts, 365 (1):98-100 (1995)). Изучение зависимости доза-ответ на амилине и инсулине показывают, что амилин действует в скелетной мышце как неконкурентный или функциональный антагонист инсулина (Young et al., Am. J. Physiol, 263 (2):Е274-Е281 (1992)). Нет доказательств того, что амилин препятствует связыванию инсулина с его рецепторами или последующей активации инсулинового рецептора тирозинкиназой (Follet et al., Clinical Research. 39 (1):39А (1991); Koopmans et al., Diabetologia, 34:218-224 (1991)). Считается, что амилин действует с вовлечением рецепторов, имеющихся на плазменных мембранах. Изучение амилина и КГСП, а также влияния селективных антагонистов позволяют предположить, что амилин действует через свой собственный рецептор (Beaumont et al., Br. J. Pharmacol, 115 (5):713-715 (1995); Wang et al., FEBS Letts., 219:195-198 (1991 b)), что не совпадает с выводом других исследователей о том, что амилин может действовать в основном на рецепторах КГСП (например, Chantry et al., Biochem. J., 277:139-143 (1991); Galeazza et al., Peptides, 12:585-591 (1991); Zhu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 177 (2):771-776 (1991)). Рецепторы амилина и их использование в методах скрининга и тестирования соединений - агонистов и антагонистов амилина - описаны в Патенте США 5264372, выданном 23 ноября 1993 г. Хотя известно, что амилин проявляет выраженное воздействие на энергетический метаболизм в печени in vivo, отсутствует общее согласие по вопросу о том, как он действует в изолированных гепатоцитах или перфузированной печени. Имеющиеся данные не поддерживают представление о том, что амилин способствует гликогенолизу в печени, иными словами, он не действует подобно глюкагону (например, Stephens et al., Diabetes, 40:395-400 (1991); Gomez-Foix et al., Biochem. J., 276:607-610 (1991)). Было высказано предположение о том, что амилин может воздействовать на печень, способствуя превращению лактата в гликоген и повышая количество глюкозы, способной высвободиться под действием глюкагона (см. Roden et al., Diabetologia, 35:116-120 (1992)). Таким образом, амилин может действовать в печени как анаболический партнер инсулина, в отличие от механизма его функционирования в мышце, носящего катаболический характер. В жировых клетках действие амилина, в отличие от мышц, не сказывается заметным образом на инсулинстимулированном поглощении глюкозы, включении глюкозы в триглицерид, образовании CO2 (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 85:7763-7766 (1988)), стимулируемом эпинефрином липолизе или ингибировании липолиза инсулином (Lupien and Young, "Diabetes Nutrition and Metabolism - Clinical and Experimental", Vol. 6 (1), pages 1318 (February 1993)). Амилин, таким образом, проявляет тканеспецифические действия, при этом отмечается прямое воздействие его на скелетную мышцу, выраженное опосредованное воздействие (через снабжение субстратом) и, возможно, прямое воздействие на печень, тогда как адипоциты остаются, по всей видимости, слепыми к наличию или отсутствию амилина. Имеются данные о том, что амилин может проявлять выраженный эффект на секрецию инсулина. Эксперименты на интактных крысах (Young et al., Mol. Cell. Endocrinol. , 84:R1-R5 (1992)) указывают на то, что амилин ингибирует секрецию инсулина. Другие исследователи, однако, не смогли обнаружить эффект амилина на изолированных![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/946.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/945.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/945.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/945.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/945.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/945.gif)
то один или более из A1-K1 обозначает D-аминокислоту, и Z выбирают из группы, состоящей из алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси. 3. Аналог агониста амилина, имеющий аминокислотную последовательность
1A1-X-Asn-Thr-5Ala-Thr-Y-Ala-Thr-10Gln-Arg-Leu-B1-Asn-15Phe-Leu-C1-D1-E1-20F1-G1-Asn-H1-Gly-25I1-J1-Leu-Pro-Pro-30Thr-K1-Val-Gly-Ser-35Asn-Thr-Tyr-Z,
где A1 - Lys, Ala, Ser или водород; B1 - Ala, Ser или Thr; C1 - Val, Leu или Ilе; D1 - His или Arg; E1 - Ser или Thr; F1 - Ser, Thr, Gln или Asn; G1 - Asn, Gln или His; H1 - Phe, Leu или Туr; I1 - Ala или Pro; J1 - Ilе, Val, Ala или Leu; K1 - Asn, Asp или Gln;
X и Y выбирают независимо из остатков, имеющих боковые цепи, химически связанные друг с другом с образованием внутримолекулярной связи, при этом указанная внутримолекулярная связь включаeт дисульфидную, лактамную или тиоэфирную связь; и Z - амино, алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси, и при условии, что когда A1 - Lys, B1 - Ala, C1 - Val, D1 - Arg, E1 - Ser, F1 - Ser, G1 - Asn, H1 - Leu, I1 - Pro, J1 - Val и K1 - Asn, то один или более из A1-K1 обозначает D-аминокислоту, и Z выбирают из группы, состоящей из алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси. 4. Аналог агониста амилина, имеющий аминокислотную последовательность
1A1-X-Asn-Thr-5Ala-Thr-Y-Ala-Thr-10Gln-Arg-Leu-B1-Asn-15Phe-Leu-C1-D1-E1-20F1-G1-Asn-H1-Gly-25Pro-I1-Leu-Pro-Pro-30Thr-J1-Val-Gly-Ser-35Asn-Thr-Tyr-Z,
где A1 - Lys, Ala, Ser или водород; B1 - Ala, Ser или Thr; C1 - Val, Leu или Ile; D1 - His или Arg; E1 - Ser или Thr; F1 - Ser, Thr, Gln или Asn; G1 - Asn, Gln или His; H1 - Phe, Leu или Туr; I1 - Ilе, Val, Ala или Leu; J1 - Asn, Asp или Gln;
Х и Y представляют собой независимо выбранные остатки, имеющие боковые цепи, которые химически связанны друг с другом с образованием внутримолекулярной связи, при этом указанная внутримолекулярная связь включает дисульфидную связь, лактамную или тиоэфирную связь; и Z обозначает амино, алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси; и при условии, что когда A1 - Lys, B1 - Ala, C1 - Val, D1 - Arg, E1 - Ser, F1 - Ser, G1 - Asn, H1 - Leu, I1 - Val и J1 - Asn, то один или более из A1-K1 обозначает D-аминокислоту, и Z выбирают из группы, состоящей из алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси. Предпочтительные аналоги агониста амилина включают: 25,28,29Рrо-h-амилин, 18Аrg25,28,29Рrо-h-амилин и 18Arg25,28Pro-h-амилин. Активность соединений в качестве агонистов амилина может быть подтверждена и количественно определена при проведении различных скрининговых тестов, которые включают тест по связыванию с рецептором прилегающего ядра, описанный ниже в Примере 7, с последующим тестом на камбаловидной мышце, описанном далее в Примере 8, тест по опустошению желудка, описанный в Примере 9 или 10, или тест, основанный на способности индуцировать гипокальциемию или снижать у млекопитающих возникающую после приема пищи гипергликемию, как приведено в настоящем описании. Тест по связыванию с рецептором или конкурентный тест, который определяет способность соединения специфически связываться с мембрансвязанными рецепторами амилина, описан и заявлен в Патенте США 5264372, выданном 23 ноября 1993 года, полное раскрытие которого включено в настоящее описание в качестве ссылки. Тест по связыванию с рецептором приведен также к настоящем описании, далее в Примере 7. Предпочтительным источником для получения мембранных препаратов, используемых в тесте, является базальное вещество переднего мозга, которое включает мембраны из прилегающих ядер и окружающих регионов. Тестируемые соединения конкурируют за связывание с указанными рецепторными препаратами с 125I амилином крысы (Bolton Hunter). Конкурентные кривые, в которых количество связанного (В) соединения наносится на график как функция log концентрации лиганда, далее подвергают компьютерному анализу нелинейной регрессии в 4-параметровом логистическом уравнении (программа Inplot; Graph-PAD Software, San Diego, California) или программы ALLFIT of DeLean et. al. (ALLFIT, Version 2.7 (NIH, Bethesda, MD 20892)). Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107:220-239 (1980). Тест на биологическую активность агонистов амилина в камбаловидной мышце может быть проведен с использованием описанных ранее методов (Leighton, В. and Cooper, Nature, 335:632-635 (1988); Cooper, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7763-7766 (1988)), в которых активность агониста амилина оценивают по измерению ингибирования инсулинстимулируемого синтеза гликогена. Тест на камбаловидной мышце описан также в Примере 8 ниже. Методы измерения скорости опустошения желудка описаны, например, в работе Янга с соавт. (Young et. al., Diabetologia, 38 (6):642-648 (1995)). В рамках метода с использованием фенолового красного, который описан далее в Примере 9, находящиеся в сознании крысы получают через зонд неокрашенный гель, содержащий метилцеллюлозу, и феноловый красный индикатор. Через двадцать минут после введения зонда животных анестезируют с использованием галотана, обнажают желудок и, зафиксировав его на пилорическом сфинктере и сфинктере нижнего пищевода, вынимают и опустошают в щелочной раствор. Содержимое кишечника может быть оценено по интенсивности окраски фенолового красного в щелочном растворе, которую измеряют по поглощению при длине волны 560 нМ. По методу, включающему использование тритированной глюкозы, который описан ниже в Примере 10, находящимся в сознании крысам вводят зондом тритированную глюкозу в воде. Крыс осторожно придерживают за хвост, кончик которого анестезируют с помощью лидокаина. Для определения уровня трития в плазме ее, отделяя от хвостовой крови, отбирают в различные временные точки и анализируют на бета-счетчике. Исследуемые соединения обычно вводят за одну минуту до зондирования. Действие амилина или агонистов амилина на вес тела может быть идентифицировано, оценено или отслежено при использовании методов, описанных ниже в Примерах 1-3, или с помощью других известных в технике эквивалентных методов для определения воздействия соединения на вес тела. Предпочтительные соединения агонистов амилина проявляют активность в тесте по связыванию с рецептором, на порядок меньшую, чем примерно 1-5 нМ, предпочтительно меньше, чем примерно 1 нМ, и более предпочтительно меньше, чем примерно 50 пМ. В тесте с камбаловидной мышцей предпочтительные соединения агониста амилина демонстрируют значение ЭК50 на порядок меньше, чем примерно 1-10 мкмоль. В тесте по опустошению желудка предпочтительные соединения агониста демонстрируют значения ЭК50 на порядок меньше, чем 100 мкг/крысу. Амилин и пептидные агонисты амилина могут быть получены с помощью стандартной техники твердофазного пептидного синтеза и предпочтительно с использованием автоматизированного или полуавтоматизированного устройства для синтеза пептидов. В типичном случае, с использованием указанной техники
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/945.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/945.gif)
для инъекции или инфузии, могут быть, например, суспендированы в инертном масле, приемлемыми являются кунжутное, арахисовое, оливковое масло или другой приемлемый носитель. Предпочтительно их суспендируют в водном носителе, например в изотоническом буферном растворе при рН примерно 5,6-7,4. Указанные композиции могут быть затем простерилизованы с использованием традиционной техники стерилизации или могут быть подвергнуты стерильному фильтрованию. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые дополнительные вещества, которые требуются для того, чтобы приблизить их к физиологическим условиям, такие как рН-забуферивающие агенты. Используемые буферы включают, например, буферы на основе ацетата натрия/уксусной кислоты. Препараты с замедленным высвобождением в пролонгированной форме или в форме "депо" также могут быть использованы, с тем чтобы доставлять терапевтически эффективные количества препарата в кровяное русло в течение многих часов или дней после трансдермальной инъекции или иного способа доставки. Предпочтительно указанные парентеральные дозированные формы готовят в соответствии со способом совместной патентной заявки, которая озаглавлена: "Parenteral, Liquid Formulations for Amylin Agonist Peptides", серийный 60/035140, поданной 8 января 1997 года, и в заявке на Патент США, серийный 09/005262, поданной 8 января 1998 года, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки, и которые включают примерно от 0,01 до 0,5% (вес/объем) соответственно амилина или агониста амилина в водной системе вместе с примерно 0,02-0,5% (вес/объем) ацетатного, фосфатного, цитратного или глютоматного буфера с целью поддержания рН в готовой композиции на уровне примерно от 3,0 до 6,0 (более предпочтительно от 3,0 до 5,5), а также примерно от 1,0 до 10% (вес/объем) углевода или многоатомного спирта, в качестве тонизирующего средства, в водной непрерывной фазе. В предпочтительной композиции продукта, направленной на то, чтобы позволить пациенту отказаться от многократного приема доз препарата, также присутствует противомикробный консервант в количестве примерно от 0,005 до 1,0% (вес/объем), отобранный из группы, состоящей из м-крезола, бензилового спирта, метил-, этил-, пропил- и бутилпарабена и фенола. Стабилизатор не требуется. Для получения желательной концентрации раствора используют некоторое достаточное количество воды для инъекций. Могут, кроме того, присутствовать хлорид натрия, а также другие наполнители, если желательно. Такие наполнители, однако, должны способствовать поддержанию общей стабильности амилина или пептидного агониста амилина. Жидкие композиции должны быть по существу изотоническими, что означает, что они находятся в диапазоне
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/177.gif)
Измерение веса тела: 4-недельное исследование с больными диабетом типа 2, нуждающимися в инсулине. Участниками исследования были мужчины и женщины в возрасте от 25 до 78 лет, которые имели в истории болезни запись о наличии сахарного диабета типа 2 и которые нуждались в лечении инсулином по меньшей мере в течение 6 месяцев до визита накануне скрининга. В исследование включают пациентов, которые имеют вес тела, отличающийся не более чем на 45%, от желательного веса перед самим исследованием (на основании таблиц жизненных показателей Metropolitan). В исследовании использованы методы, описанные в работе Томпсона с соавт. (Thompson et al.. Diabetes 46:632-636 (1997)). После подготовительного периода приема плацебо пациентов распределяют случайным образом на группы, получающие плацебо или одну из трех дозировок 25,28,29Рrо-h-амилина (прамлинтида) в течение 4 недель: 30 мкг четыре раза в день (перед завтраком, вторым завтраком, обедом и ужином), 60 мкг три раза в день (перед завтраком, вторым завтраком и обедом) или 60 мкг четыре раза в день (перед завтраком, вторым завтраком, обедом и вечерним приемом пищи). В течение всего периода исследования препарата пациенты вводят себе сами четыре инъекции исследуемого средства в день в течение 15 минут при каждом приеме пищи и во время вечерней закуски. В ходе периода двойного слепого исследования пациентов распределяют случайным образом в группы приема прамлинтида по 60 мкг трижды в день и приема плацебо перед вечерней закуской. Обе группы, принимающие прамлинтид и плацебо, применяют указанные средства в качестве отдельных инъекций в подкожную ткань передней брюшной стенки; после каждой инъекции чередуют конкретное место введения. Пациентов инструктируют о необходимости сохранять в течение всего исследования свою обычную диету, курс приема инсулина и выполнение упражнений, если особо исследователем не указывается иное, и воздержаться от приема алкогольных напитков перед посещениями клиники. Как показано в табл. I, отмечается статистически значимое снижение веса тела относительно базового уровня к 4 неделе приема прамлинтида в дозе 60 мкг трижды в день (среднее значение составляет -0,89 кг, р = 0,0056) и прамлинтида в дозе 60 мкг четыре раза в день (среднее значение составляет -0,72 кг, р = 0,0014), в соответствующих группах. При проведении корректировки по Хохбергу (Hochberg adjustment) для целей множественных сравнений, ни в одной из трех групп приема прамлинтида в сравнении с группой приема плацебо не отмечается статистически значимого изменения веса тела относительно базового уровня к моменту 4 недели. Таким образом, введение прамлинтида на фоне приема инсулина улучшает гликемический контроль при снижении веса тела, которое достигает статистической значимости при использовании дозы 60 мкг в группах, принимающих его трижды в день и четыре раза в день. Факт такого снижения резко отличается от результатов по увеличению веса, который обычно сопровождает улучшение контроля глюкозы и который возникает при применении только инсулина пациентами с диабетом типа 2. ПРИМЕР 2
Измерение веса тела: 52-недельное исследование с больными диабетом типа 1. Указанное исследование представляет собой многоцентровое, двойное слепое исследование и с контролем в виде параллельной группы, принимающей плацебо, испытание с возможностью повышения дозы. В исследовании приняли участие мужчины и женщины в возрасте от 16 до 70 лет, больные сахарным диабетом типа 1. Пациенты ежедневно делали сами себе подкожные инъекции 30 мкг прамлинтида или плацебо, перед каждым приемом пищи и легкой закуской перед сном. Некоторых пациентов (тех из них в группе прамлинтида, которые характеризуются снижением HbAlc от базового уровня менее чем 1,0% после 13 недель лечения) на 20 неделе вновь распределяют случайным образом в группу приема дозы либо 30 мкг, либо 60 мкг четыре раза в день в течение оставшегося периода исследования. В указанном испытании пациенты принимают исследуемое средство с рН 4,0 в концентрации, позволяющей инъекцию 0,1 мл на дозу. 477 пациентов получают по меньшей мере одну дозу исследуемого лекарственного средства (прамлинтида или плацебо). Из 477 пациентов, которые были случайным образом распределены и принимали соответствующие дозы, 341 закончили 52-недельное исследование. Пациенты, которые принимали прамлинтид, продемонстрировали клинически выраженное и статистически значимое снижение веса тела в сравнении с группой приема плацебо - к 13, 26 и 52 неделям (табл. II). Наибольшее отличие от плацебо было отмечено к 26 и 52 неделям (снижение по меньшей мере на 1,2 кг в сравнении с группой приема плацебо в указанные временные точки). Потеря веса имела место в особенности у тех пациентов, которые имели на базовом уровне индекс массы тела (ИМТ) по меньшей мере 27,0 кг/м2, показывая наибольшую отдачу у таких тучных пациентов (табл. III). Пациенты, принимавшие прамлинтид в подгруппе пациентов с базовым уровнем HbAlc, составляющим по меньшей мере 8,0%, и на стабильном фоне инсулина, продемонстрировали среднее значение снижения веса тела, в сравнении с группой плацебо во всех трех временных точках (табл. IV). Указанное наблюдение согласуется с хорошо известным действием инсулина, способствующим прибавлению веса тела. Таким образом, прамлинтид, по всей видимости, снижает инсулининдуцированное увеличение веса. Нормально распределенные данные проанализировали с использованием двухходового анализа вариантов. В тех случаях, где было показано, что данные не следуют нормальному режиму распределения, использовались непараметрические методы (тест Крускала-Валлиса (Kruskal-Wallis test)), основанный на анализе рядов. В этих случаях вместо среднего значения дана оценка Ходжеса-Лемана (Hodges-Lehman) для указания отличий от плацебо. ПРИМЕР 3
Измерение веса тела: 52-недельное исследование с больными диабетом типа 2, нуждающимися в инсулине. Указанное исследование представляет собой многоцентровое, двойное слепое и с контролем в виде параллельной группы, принимающей плацебо, испытание с возможностью варьирования дозы. В испытании приняли участие мужчины и женщины в возрасте от 18 до 75 лет, больные сахарным диабетом типа 2 и нуждающиеся в инсулине. Пациенты ежедневно вводили сами себе три подкожных инъекции прамлинтида (30, 75 или 150 мкг, трижды в день) или плацебо (трижды в день), перед каждым приемом пищи в течение 52 недель. В указанном исследовании пациенты принимают испытуемое лекарственное средство с рН 4,7 в концентрации, необходимой для инъекции 0,3 мл в расчете на дозу. Проведению двойного слепого испытания предшествовал 3-10-дневный вводный период приема плацебо с одной слепой меткой. Из 539 пациентов, которые были распределены случайным образом на группы и принимали соответствующие дозы, 381 пациент закончил 52-недельное исследование. Пациенты, которые принимали любую из трех доз прамлинтида, продемонстрировали клинически выраженное и статистически значимое снижение веса тела в сравнении с группой приема плацебо к 13, 26 и 52 неделям (табл. V). Наибольшее отличие от уровня плацебо отмечалось к 26 неделе и 52 неделе (снижение на 2,3 и 2,7 кг в сравнении с плацебо в указанные временные точки). Вес пациентов, принимавших плацебо, увеличивался относительно базового уровня во всех трех временных точках, в отличие от результатов в трех группах приема прамлинтида, где отмечалось снижение веса тела во всех временных точках. Потеря веса имела место у тех пациентов, которые имели значение индекса массы тела (ИМТ) на базовом уровне по меньшей мере 27,0 кг/м2, и у тех, кто имел на базовом уровне значением ИМТ менее чем 27,0 кг/м2 (табл. VI). Пациенты, которые принимали прамлинтид во всех трех группах с базовым значением HdAlc, равным, по меньшей мере, 8,0%, и на фоне стабильного приема инсулина, продемонстрировали снижение веса тела в сравнении с группой приема плацебо во все временные точки (Таблица VII). Выраженность ответа была в целом сравнимой для всех пациентов, что предполагает независимость эффекта от изменений в дозе инсулина. Нормально распределенные данные проанализировали с использованием двухходового анализа вариантов (с использованием корректировки по Хохбергу (Hochberg) в процедуре Бонферрони (Bonferroni) для проведения множественных сравнений). В тех случаях, когда представленные данные не подчинялись нормальному распределению, были использованы непараметрические методы анализа (тест Крускала-Валлиса (Kruskal-Wallis)), основанные на анализе рядов. В этих случаях вместо среднего значения представлена оценка по Ходжесу-Леману (Hodges-Lehman) для указания отличий от данных, полученных в группе приема плацебо. ПРИМЕР 4
Получение 25,28,29Рrо-h-амилина. Твердофазный синтез 25,28,29Рrо-h-амилина с использованием смолы, связанной с метилбензилгидриламиновым якорем, и защиты боковой цепи Na-Бoк/бeнзилoм проводят в рамках стандартной техники синтеза пептидов. 2,7-[дисульфид] амилин-МБГА-смолу получают при обработке Асm-защищенных цистеинов трифторацетатом таллия(III) в трифторуксусной кислоте. После проведения циклизации смолу и защищающую группу боковой цепи расщепляют жидкой HF в присутствии диметилсульфида и анизола. 25,28,29Рrо-h-амилин очищают препаративной ВЭЖХ с обращением фаз. С использованием аналитической ВЭЖХ и капиллярного электрофореза было показано, что пептид является гомогенным, при этом его структура была подтверждена аминокислотным анализом и анализом последовательности. Продукт характеризовался желательным масс-ионом. FAB масс-характеристики: (M+H)+=3,949. ПРИМЕР 5
Получение 18Аrg25,28,29Рrо-h-амилина. Твердофазный синтез 18Аrg25,28,29Рrо-h-амилина с использованием смолы, связанной с метилбензилгидриламиновым якорем, и защиты боковой цепи Na-Бoк/бeнзилoм проводят в рамках стандартной техники синтеза пептидов. 2,7-[дисульфид] амилин-МБГА-смолу получают при обработке Асm-защищенных цистеинов трифторацетатом таллия(III) в трифторуксусной кислоте. После проведения циклизации смолу и защищающую группу боковой цепи расщепляют жидким HF в присутствии диметилсульфида и анизола. 18Аrg25,28,29Рrо-h-амилин очищают препаративной ВЭЖХ с обращением фаз. Методами аналитической ВЭЖХ и капиллярного электрофореза было показано, что пептид является гомогенным, при этом его структура была подтверждена аминокислотным анализом и анализом последовательности. Продукт характеризуется наличием желательного масс-иона. FAB масс-характеристики: (М+Н)+ = 3,971. ПРИМЕР 6
Получение 18Аrg25,28Рrо-h-амилина. Твердофазный синтез 18Аrg25,28Рrо-h-амилина с использованием смолы, связанной с метилбензилгидриламиновым якорем, и защиты боковой цепи Na-Бoк/бeнзилoм проводят в рамках стандартной техники синтеза пептидов. 2,7-[дисульфид] амилин-МБГА-смолу получают при обработке Асm-защищенных цистеинов трифторацетатом таллия(III) в трифторуксусной кислоте. После проведения циклизации смолу и защищающую группу боковой цепи расщепляют жидким HF в присутствии диметилсульфида и анизола. 18Аrg25,28Рrо-h-амилин очищают препаративной ВЭЖХ с обращением фаз. Методами аналитической ВЭЖХ и капиллярного электрофореза было показано, что пептид является гомогенным, при этом его структура была подтверждена аминокислотным анализом и анализом последовательности. Продукт характеризуется наличием желательного масс-иона. FAB масс-характеристики: (М+Н)+ = 3,959. ПРИМЕР 7
Тест на связывание с рецептором. Оценку связывания соединений с рецепторами амилина проводят следующим образом. 125I-амилин крыс (меченый на N-концевом лизине по методу Болтона-Хантера (Bolton-Hunter)) получают от Amersham Corporation (Arlington Heights, IL). К моменту использования удельная активность варьирует в диапазоне от 1950 до 2000 Ci/ммоль. Немеченные пептиды получают от Bachem Inc. (Torrance, CA) и Peninsula Laboratories (Belmont, CA). Самцов крыс линии Спрэг Доли (Sprague-Dawley) (весом 200-250 г) умерщвляют декапитацией. Мозг крыс удаляют и помещают в холодный фосфатно-буферный раствор (ФБР). От брюшной поверхности делают ростральный надрез к гипоталамусу, связанному латерально с обонятельными путями, и расширяют под углом 45o, в медиальном направлении от этих путей. Указанную базальную ткань переднего мозга, содержащую прилежащие ядра и окружающие участки, взвешивают и гомогенизируют в холодном 20 мМ HEPES буфере (20 мМ HEPES кислота со значением рН, доведенным до 7,4 с помощью NaOH при 23oС). Мембраны промывают три раза в свежем буфере с использованием центрифугирования в течение 15 мин при 48000хg. Конечный мембранный осадок ресуспендируют в 20 мМ HEPES буфере, содержащем 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ). Для измерения уровня связывания 125I-амилина инкубируют мембраны из 4 мг исходного сырого веса ткани с 125I-амилином в. концентрации 12-16 пМ в 20 мМ HEPES буфере, содержащем 0,5 мг/мл бацитрацина, 0,5 мг/мл бычьего сывороточного албумина и 0,2 мМ ФМСФ. Раствор инкубируют в течение 60 мин при температуре 23oС. По завершении инкубации проводят фильтрование через стекловолокнистый фильтр GF/B (Whatman Inc., Clifton, NJ), который предварительно вымачивался в течение 4-х ч в 3% полиэтиленимине для снижения неспецифического связывания радиоактивно меченных пептидов. Пептиды промывают непосредственно перед фильтрованием 5 мл холодного ФБР, и сразу же после фильтрования их также промывают 15 мл холодного ФБР. Фильтры удаляют и оценивают уровень радиоактивности на гамма-счетчике с эффективностью счета 77%. Строят конкурентные кривые при измерении связывания в присутствии от 10-12 до 10-6 М немеченого исследуемого соединения и анализируют их методом нелинейной регрессии с использованием 4-параметрового логистического уравнения (Inplot program; GraphPAD Software, San Diego). В указанном тесте очищенный человеческий амилин связывается со своим рецептором со значением ИК50, равным, как показали измерения, примерно 50 пМ. Ниже, в табл. VIII, приведены результаты, полученные для исследуемых соединений, которые показывают, что каждое из этих соединений обладает значительной рецептор-связывающей активностью. ПРИМЕР 8
Тест на камбаловидной мышце. Определение агонистской активности исследуемых соединений в отношении амилинов проводят с использованием теста на камбаловидной мышце, описанного ниже. Используют самцов крыс линии Харлан Спрэг Доли (Harlan Sprague-Dawley) весом примерно 200 г, с тем чтобы иметь возможность поддерживать вес расщепленной камбаловидной мышцы на уровне менее 40 мг. Животных выдерживают без пищи в течение 4-х ч, затем умерщвляют декапитацией. С нижней конечности снимают кожу и прикалывают ее к пробковой поверхности. Ахиллово сухожилие разрезают выше пяточной кости, при этом икроножная мышца выдается из задней части большеберцовой кости. После этого осторожно отрывают камбаловидную мышцу, представляющую собой мелкую - 15-20 мм длиной, 0,5 мм толщиной плоскую мышцу на костевой поверхности икроножной мышцы и очищают ее от перимизия с использованием миниатюрных ножниц и пинцета. После этого камбаловидную мышцу расщепляют на равные части с помощью лезвия, проходя в переднезаднем направлении по брюшку мышцы, с получением в целом 4-х мышечных полосок от каждого животного. После иссечения мышцы из животного ее хранят в течение короткого времени в физиологическом растворе. Нет необходимости держать мышцу под напряжением, поскольку при этом не было показано выраженного эффекта на включение в гликоген радиоактивной меченой глюкозы. Мышцы вносят в колбы Эрленмейера на 50 мл, содержащие 10 мл газированного бикарбонатного буфера Кребса-Рингера, содержащего (на каждый литр) NaCl - 118,5 ммоль (6,93 г), КС1 - 5,94 ммоль (443 мг), CaCl2 - 2,54 ммоль (282 мг), MgS04 - 1,19 ммоль (143 мг), КН2РO4 - 1,19 ммоль (162 мг), NаНСО3 - 25 ммоль (2,1 г), глюкозы - 5,5 ммоль (1 г) и рекомбинантный человеческий инсулин (Humulin-R, Eli Lilly, IN), а также исследуемое соединение, как детально приведено ниже. Проверяют значение рН при 37oС, с тем чтобы оно держалось в диапазоне между 7,1 и 7,4. Мышцы распределяют по различным колбам, так чтобы 4 кусочка мышцы от каждого животного были равномерно распределены по различным условиям тестирования. Инкубационные среды насыщают газом при осторожном продувании над их поверхностью карбогена (95% O2, 5% СO2) при постоянном перемешивании при 37oС в колеблющейся водяной бане. После получасовой преинкубации добавляют 0/5 мкCi U-14С-глюкозы в каждую колбу и затем инкубируют их еще в течение 60 мин. Каждый кусочек мышцы после этого быстро вынимают, промакивают и замораживают в жидком N2, взвешивают и хранят с последующим определением 14С-гликогена. Определение 14С-гликогена проводят в сцинтилляционных флаконах на 7 мл. Каждый образец замороженной мышцы помещают во флакон и переваривают в 1 мл 60% гидроксида калия при 70oС в течение 45 мин при непрерывном перемешивании. Растворенный гликоген осаждают во флаконе при добавлении 3 мл абсолютного этанола и охлаждении в течение ночи при -20oС. Супернатант осторожно отсасывают, гликоген снова промывают этанолом, отсасывают и осадок высушивают под вакуумом. Весь этанол выпаривают с тем, чтобы избежать тушения при сцинтилляционном счете. Оставшийся гликоген перерастворяют в 1 мл воды и 4 мл сцинтилляционной жидкости и считают уровень 14С. Уровень включения глюкозы в гликоген (выраженный в мкмоль/г/ч) получают на основе удельной активности 14С глюкозы в инкубационной среде с содержанием 5,5 мМ глюкозы, и общий счет 14С, оставшегося в гликогене, вычитают из значений, полученных для каждой мышцы. Кривые доза-ответ соотносят с 4-параметровой логистической моделью при использовании стандартной процедуры подсчета наименьших квадратов (ALLFIT, v2,7, NIH, MD) для получения значений ЭК50. Поскольку ЭК50 демонстрирует нормальное распределение в log-варианте, его выражают в виде
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/177.gif)
Тест на опустошение желудка с феноловым красным. Измерение опустошения желудка проводят с использованием модификации Плоурда с соавт. (Plourde et. al., Life Sci. 53: 857-862 (1993)) оригинального метода Скарпигнато с соавт. (Scarpignato et. al., Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 246: 286-295 (1980)). Вкратце, процедура состоит в том, что находящимся в сознании крысам дают с помощью зонда 1,5 мл неокрашенного геля, содержащего 1,5% метилцеллюлозы (М-0262, Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) и 0,05% фенолового красного в качестве индикатора. Через двадцать минут после введения зонда крыс анестезируют с использованием 5% галотана, желудок обнажают и с помощью артериального зажима фиксируют на пилорическом и нижнем пищеводном сфинктерах, вынимают его, и опустошают содержимое в щелочной раствор, который доводят до фиксированного объема. Содержимое желудка определяют по интенсивности окрашивания феноловым красным в щелочном растворе, которую измеряют по поглощению при длине волны 560 нм. В большинстве экспериментов желудок был чистым. В других экспериментах с целью последующего измерения поглощения содержимое желудка центрифугируют для просветления раствора. В тех случаях, когда и после разбавления содержимое желудка продолжает оставаться мутным, спектроскопическое поглощение, связанное с феноловым красным, определяют как разницу между таковым в щелочном растворе и в подкисленном разбавителе. В отдельном эксперименте на 7 крысах желудок и тонкий кишечник вырезают и опустошают в щелочной раствор. Количество фенолового красного, которое могло быть восстановлено из верхнего желудочно-кишечного тракта, в течение 29 мин зондирования, составляет 89
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/177.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/177.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/177.gif)
![](https://img.poleznayamodel.ru/chr/177.gif)
Тест на опустошение желудка с третированной глюкозой
С использованием 2% лидокаина у находящихся в сознании, не голодающих крыс линии Харлан Спрэг Доли (Harlan Sprague Dawley) анестезируют кончик хвоста, поддерживая за него животных. На бета-счетчике определяют уровень трития в плазме, выделенной из хвостовой крови, отобранной на момент времени 0, 15, 30, 60, 90 и 120 мин после введения зонда. Крысам инъецируют подкожно 0,1 мл солевого раствора, содержащего 0, 0,1, 0,3, 1, 10 или 100 мкг амилина крыс, за одну минуту до введения зонда (n = 8, 7, 5, 5, 5 соответственно). После введения зондом солевого раствора крысам, которым уже инъецированную глюкозу, уровень трития в плазме быстро повышается (значение t 1/2 составляет примерно 8 мин) до асимптоты и затем медленно снижается. Подкожная инъекция амилина зависимым от дозы образом снижает и/или задерживает поглощение метки. Активность трития в плазме интегрируют в течение 30 мин, получая величину площади под кривой, построенной в виде функции дозы амилина. Значение ЭК50, полученное на основе логистической модели, составляет 0,35 мкг амилина.
Формула изобретения
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9
Похожие патенты:
Полимеры, ингибирующие липазу // 2207861
Изобретение относится к медицине, в частности к терапии и эндокринологии, и касается лечения ожирения и гипертриглицеридемии
Биологически активная добавка "лактогон" // 2189830
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, производящей лекарственные средства при недостатке грудного молока у кормящих женщин, при отягощенном акушерском анамнезе и гипогалактии, при гипотрофии и анорексии у детей грудного и раннего возраста
Изобретение относится к медицине
Способ лечения ожирения // 2174835
Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и эндокринологии, и предназначено для лечения ожирения с помощью комбинированной гипокалорийной диеты со сниженным содержанием жира
Способ лечения ожирения // 2147228
Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и эндокринологии, и предназначено для лечения ожирения с помощью импульсной гипокалорийной диеты со сниженным содержанием жира
Изобретение относится к синтетическому связывающемуся с рецепторами кальцитонина соединению, имеющему молекулярную массу менее 10000 Д, которое представляет собой пептид, ковалентно соединенное с хелатором радиоактивного металла с образованием реагента, при этом упомянутый реагент проявляет аффинность по связыванию с рецептором кальцитонина, равную или превышающую аффинность связывания с упомянутым рецептором, характерную для нативного, помеченного радиоактивным йодом кальцитонина
Защищенные пептиды кальцитонина // 2193567
Изобретение относится к соединениям формулы Х1-Leu-His-Lys(R1)-Leu-Gln-Thr-Tyr(R2)-Pro-Y, где Х1 - H-, A1O-CO-, H-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-, A1O-CO-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-; Y - -OH, -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2; А1 есть трет-бутил; R1 - защитная группа формулы В1О-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys, R2 - защитная группа формулы В2О-СО- для гидроксильной группы остатка Туr, R3 - защитная группа формулы В3О-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys, В4 - защитная группа для гамма-карбоксильной группы остатка Glu, причем В1, В2, В3 и В4 могут быть одинаковыми или разными и выбираются из ряда: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(замещенный арил)сульфонилэтил
Агент для обработки чувствительной кожи, композиция на его основе и способ обработки кожи // 2180854
Изобретение относится к косметологии, в частности к агенту для обработки чувствительной кожи, к композиции, содержащей агент для обработки чувствительной кожи, а также к способу обработки кожи
Липосомная композиция человеческого кальцитонинного генного пептида и способ ее получения // 2174843
Изобретение относится к медицине
Изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии, и касается лечения сахарного диабета II типа
Изобретение относится к медицине, касается применения антагонистов CGRP в и/или для приготовления косметической или фармацевтической композиции, особенно для топического применения, с целью лечения окулярных или пальпебральных почесух (пруриго), окулярных или пальпебральных болей и окулярных или пальпебральных дизестезий
Способ получения антибиотика // 440847
Патент 423304 // 423304