Способ повышения устойчивости к гемолизу эритроцитов и восстановления их поврежденной формы

 

Изобретение относится к медицине и может использоваться при стабилизации донорской крови, защите эритроцитов в аппаратах искусственного кровообращения, а также при любых патологиях, сопровождающихся повреждением эритроцитов. Способ осуществляют путем введения в кровь природного гидрофильного антиоксиданта карнозина или его N-ацетильного производного. Технический результат: повышение устойчивости к гемолизу эритроцитов и восстановления их поврежденной формы без нарушения нативной структуры биомембран. 2 ил., 2 табл.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при стабилизации донорской крови, защите эритроцитов в аппаратах искусственного кровообращения, а также при любых патологиях, сопровождающихся повреждением эритроцитов.

Известен способ защиты мембран эритроцитов от перекисного окисления с помощью биосинтетических инсулинов [1].

Этот способ применяется при сахарном диабете, но даже в рамках данной патологии у пациентов с ангиопатиями он не является эффективным.

Известен также способ повышения гемолитической устойчивости (защиты) эритроцитов, который осуществляют добавлением в кровь производных гетероциклов [2]. Как повреждающий фактор в данных исследованиях использован метод ультразвукового гемолиза. При данном способе наиболее эффективными препаратами, повышающими гемолитическую устойчивость эритроцитов, являются алкилзамещенные пиримидины и бензимидазол.

Недостатком данного способа является использование для повышения гемолитической устойчивости эритроцитов не природных соединений, а синтетических препаратов, которые нарушают функциональные свойства эритроцитов - обладают ингибирующим действием в отношении мембраносвязанных ферментов.

Прототипом предлагаемого изобретения, наиболее близким ему по совокупности существенных признаков, является способ повышения гемолитической устойчивости эритроцитов путем введения природного антиоксиданта, а именно - токоферола [3] . В качестве повреждающего фактора использована термическая травма лабораторных животных. Способ осуществляют введением лабораторным животным интраперитонеально -токоферола однократно в дозе 20 мг/кг массы тела до термической травмы, что снижает спонтанный гемолиз эритроцитов и уменьшает содержание внеэритроцитарного гемоглобина в плазме при последующей термической травме.

Недостатками прототипа является повышение устойчивости к гемолизу эритроцитов без восстановления их поврежденной формы и при нарушении нативной структуры биомембран эритроцитов.

Целью предлагаемого изобретения является повышение устойчивости к гемолизу эритроцитов и восстановление их поврежденной формы без нарушения нативной структуры биомембран эритроцитов.

Поставленную цель осуществляют путем введения в кровь гидрофильного природного антиоксиданта карнозина или его N-ацетильного производного в определенном диапазоне концентраций.

Способ осуществляют следующим образом.

В кровь, имеющую поврежденные эритроциты (пойкилоциты, акантоциты), вводят раствор карнозина или его N-ацетильного производного (N-ацетил-карнозина) в физиологическом растворе в определенном диапазоне концентраций, составляющем 2-10 мМ, что приводит к повышению устойчивости эритроцитов к кислотному гемолизу и восстановлению поврежденной формы эритроцитов без нарушения нативной структуры их мембран.

Устойчивость эритроцитов к кислотному гемолизу оценивают в физиологическом растворе (pH 5,5) при (23+0,5)^oC через 1 ч после забора крови. За динамикой гемолиза под действием 2 мМ соляной кислоты наблюдают по изменению оптической плотности при 670 нм. Общее изменение оптической плотности принимают за 100% гемолизированных эритроцитов. Затем исходя из данных изменения оптической плотности в каждые 30-секундные промежутки времени гемолиза рассчитывают % гемолиза в каждый 30-секундный промежуток времени.

Далее строят кривую распределения эритроцитов в % по устойчивости к кислоте во времени (эритрограмму), на которой определяют следующие параметры: T_н - время начала гемолиза, мин; T_к - время окончания гемолиза, мин; T_max - время максимума на эритрограмме, мин; % max - количество гемолизированных эритроцитов в процентах за время T_max.

Кислотная эритрограмма для нормальных эритроцитов хорошо воспроизводима, ее основные параметры: T_н=(1,70,2) мин; T_к, (7,40,4) мин; T_max (3,50,1) мин; % max (1,32,3) % (приведены среднестатистические данные 11 наблюдений). Увеличение или T_н, и/или T_к и/или T_max и/или снижение % max свидетельствует о повышении устойчивости эритроцитов к гемолизирующему действию кислоты. Соответственно снижение или T_н, и/или T_к и/или T_max и/или увеличение % max свидетельствует о падении устойчивости эритроцитов к гемолизирующему действию кислоты.

Оценку формы эритроцитов проводят микроскопическим методом после окраски мазков крови по методу Романовского-Гимза [4].

Пример 1. Кровь больного Б., 43 года. Диагноз: алкоголизмом 2 стадии, абстинентный синдром. Количество эритроцитов, имеющих нормальную форму двояковогутого диска не превышает 20%. Остальные 80% эритроцитов имеют форму акантоцитов, пойкилоцитов, умеренный анизоцитоз, что хорошо видно на фиг. 1 (А), где представлена микрофотография эритроцитов (увеличение в 1400 раз) больного Б. без добавления карнозина или его N-ацетильного производного. На фиг. 2 (кривая А) показана эритрограмма этого больного без добавления карнозина или его N-ацетильногоо производного. Она имеет следующие основные параметры: T_н=1,0 мин, T_к=7,0 мин, T_max=3,5 мин, % max=23,5%, то есть устойчивость эритроцитов к гемолизу по сравнению с нормой снижена.

В присутствии карнозина происходит улучшение морфологии эритроцитов (восстановление их поврежденной формы: существенно уменьшается количество пойкилоцитов, исчезают акантоциты, нет анизоцитоза), что хорошо видно на фиг. 1 (Б), где представлена микрофотография эритроцитов (увеличение в 1400 раз) больного Б. после добавления к ним карнозина. При проведении гемолиза в присутствии карнозина основные параметры эритрограммы: T_н=1,5 мин, T_к=9,5 мин, T_max=4,5 мин, % max=13,6% (см. кривую Б на фиг. 2), что свидетельствует о повышении устойчивости к гемолизу эритроцитов в присутствии данного соединения.

Проведение гемолиза эритроцитов в присутствии N-ацетильного производного карнозина также приводит к повышению устойчивости эритроцитов к гемолизирующему действию кислоты. Основные параметры эритрограммы в присутствие N-ацетил-карнозина для эритроцитов больного Б: _н=1,5 мин, T_к=10,0 мин, T_max= 5,0 мин;, % max=14,9% (см. кривую В на фиг. 2). Микроскопические исследования показывают, что в присутствии N-ацетил-карнозина также происходит нормализация формы эритроцитов: акантоциты исчезают, клетки крови имеют одинаковый размер и форму, близкую к нормальной.

Пример 2. Кровь больного Г., 57 лет. Диагноз: алкоголизм 2 стадии, абстинентный синдром. Количество эритроцитов, имеющих нормальную форму, не превышает 20%. 80% эритроцитов имеют патологическую форму. Без добавления в кровь карнозина или N-ацетил-карнозина параметры эритрограммы следующие: T_н= 1,0 мин, T_к=7,0 мин, T_max=3,0 мин, % max=21,3%.

В присутствии карнозина параметры меняются: T_н=1,0 мин, T_к=8,5 мин, T_max= 4,0 мин, % max=14,1%, то есть устойчивость эритроцитов повышается. В присутствии N-ацетильного производного карнозина основные параметры эритрограммы были следующими: _н=1,5 мин, T_к=8,0 мин, T_max=4,0 мин, %max=15,2%. То есть устойчивость эритроцитов с данным аналогом карнозина также повышается. По данным микроскопических исследований форма эритроцитов в присутствии карнозина или N-ацетил-карнозина улучшается - количество клеток с нормальной формой увеличивается до 70-80%, акантоциты исчезают, количество пойкилоцитов не превышает 30%.

В Таблице 1 суммированы статистически обработанные параметры эритрограмм 12 больных алкоголизмом 2 стадии в состоянии абстиненции, в крови которых количество эритроцитов с нормальной формой не превышало 20%. Приведены среднестатистические величины основных параметров эритрограмм, полученных без препаратов (контроль), в присутствии карнозина, а также N-ацетил-карнозина.

T_к и T_max в присутствии как карнозина, так и N-ацетил-карнозина достоверно повышены, а % max достоверно снижен по сравнению с контролем в присутствии N-ацетил-карнозина, в присутствии карнозина снижение % max было не достоверным. Эти данные свидетельствуют о повышении устойчивости к гемолизу эритроцитов в присутствии как карнозина, так и N-ацетил-карнозина.

Микроскопические исследования влияния карнозина и его N-ацетильного производного на форму эритроцитов проведены у 30 больных алкоголизмом. Улучшение формы эритроцитов наблюдали в 12 случаях с карнозином и в 17 случаях с N-ацетил-карнозином из 30 случаев соответственно, что свидетельствует о том, что карнозин и его N-ацетильное производное способны не только повышать устойчивость эритроцитов к гемолизирующим факторам, но и восстанавливать поврежденную форму эритроцитов. При этом карнозин и N-ацетил- карнозин взаимозаменяемы.

В Таблице 2 представлено сравнение основных существенных признаков прототипа и предлагаемого изобретения, из которого видны преимущества использования карнозина или N-ацетил-карнозина для повышения устойчивости эритроцитов к гемолизу по сравнению с - токоферолом.

- Карнозин и N-ацетил-карнозин способны не только защищать эритроциты, но и восстанавливать их поврежденную форму.

- Карнозин и N-ацетил-карнозин - это гидрофильные соединения, которые не встраиваются в нативные мембраны и, следовательно, не нарушают их структуру и функции.

- Гидрофильная природа карнозина и N-ацетил-карнозина может облегчить их использование на практике: в аппаратах искусственного кровообращения, в перфузионных растворах и растворах для инъекций.

Список использованной литературы.

1. Балашова Т.С., Голега Е.Н., Рудько И.А., Балаболкин М.И., Кубатиев А. А. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная защита эритроцитов у больных сахарным диабетом. Терапевтический архив. 1993, т. 65, N 10, С. 23- 27.

2. Брагинская Ф.И., Круглякова К.Е., Смирнов Л.Д., Зорина О.М. Жумабаева Т. Т. Повышение гемолитической устойчивости эритроцитов производными азотистых гетероциклов. Известия АН СССР, серия биологическая, 1987, N 1, с. 154-160.

3. Бекярова Г.И., Маркова М.П. Каган В.Г. Защита - токоферолом эритроцитов от гемолиза, индуцированного термической травмой. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1989, т. 107, N 4, с. 413-415. (Прототип).

4. Неменова Ю.М. Методы лабораторных клинических исследований. М.: Медицина. 1972. С. 213-214.

Формула изобретения

Способ повышения устойчивости к гемолизу эритроцитов и восстановления их поврежденной формы без нарушения нативной структуры биомембран, включающий введение в кровь гидрофильного природного антиоксиданта карнозина или его N-ацетильного производного.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4