Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболеваний, вызываемых образованием il-6

 

Изобретение может быть использовано для приготовления препаратов, пригодных для лечения заболеваний, обусловленных нарушением состояния крови, иммунологических заболеваний, а также противоопухолевого действия и др. заболеваний, вызываемых образованием IL-6. Фармацевтическая композиция содержит антитело к рецептору интерлейкина-6. В частности, заболеваниями, для профилактики и лечения которых предназначена композиция, являются: плазмацитоз, гипериммуноглобулинемия, анемия, нефрит, кахексия, ревматизм, болезнь Кастлмана, мезангиальный пролиферирующий нефрит. Антителом в композиции может быть моноклональное антитело, антитело РМ-1, химерное антитело, человеческое антитело, видоизмененное человеческое антитело РМ-1. Композиция является эффективной против множества заболеваний, вызываемых образованием IL-6. При этом в случае нормального уровня IL-6 она не оказывает никакого воздействия. 13 з.п. ф-лы, 4 табл., 18 ил.

Изобретение относится к фармацевтическим композициям, пригодным для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых образованием интерлейкина-6 (IL-6), включающим антитело (антитело к IL-6R) к рецептору интерлейкина-6 (IL-6R).

IL-6 представляет собой полуфункциональный цитокин, который, как полагают, принимает участие в различных имму- нологических, гематологических и острых реакциях (Taga, T. et al., Critical Reviews in Immunol., 1992, 11, 265-280), а также выполняет роль фактора роста в развитии множественной миеломы и заболеваний, сопровождающихся плазмацитозом, таких как ревматизм (Hirano, Т. et al., Eur.J. Immunol., 1988, 18, 1797-1801; Houssiau, F.A.et al. , Arth, Rheum., 1988, 31 784-788), болезнь Кастлмана [Yoshizaki, К. et al. , Blood, 1989, 74, 1360-1367; Brant, S.J. et al., J.Clin. Invest., 1990, 86 592-599), пролиферирующий мезангиальный нефрит (Ohta, К. et al., Clin. Nephrol. (Germany), 1992, 38, 185-189; Fukatsu, A. et al., Lab. Invest., 1991, 65, 61-66; Horii, Y. et al., J. Immunol., 1989, 143, 3949-3955), и состояние кахексии, сопровождающееся ростом опухоли (Strassmann, G. et al., J. Clin. Jnvest.,1992, 89, 1681-1684) и др.

У трансгенных мышей H-2L^d hIL-6 (IL-6Tgm), которые за счет генноинженерных манипуляций экспрессируют высокий уровень человеческого IL-6(hIL-6), были отмечены IgG1 плазмацитоз, нефрит за счет пролиферации клеток мезангия, анемия, тромбоцитопения, появление аутоантител и др. (Miyai, T. et al., доклад на 21 съезде Японского Иммунологического Общества "Гематологические изменения у Н-2L^d hIL-6 трансгенных мышей при старении", 1991), что дает основание предположить участие IL-6 в патогенезе многих заболеваний. Однако ничего неизвестно относительно эффективности антитела к рецептору интерлейкина-6 против заболеваний, вызываемых образованием интерлейкина.

Раскрытие изобретения Так, в настоящем изобретении представлена фармацевтическая композиция, пригодная для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых образованием интерлейкина-6. Для решения приведенных выше проблем в настоящем изобретении предлагаются фармацевтические композиции, пригодные для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых образованием интерлейкина-6, которые включают антитело к рецептору интерлейкина-6.

На фиг. 1 изображен график, показывающий увеличение веса тела животных в каждой группе.

На фиг. 2 изображен график, показывающий изменение в содержании (в %) белка в моче. Указанная характеристика составляет нуль во всех группах, кроме группы 1 и группы 3.

На фиг. 3 изображен график, показывающий изменения в уровне гемоглобина в каждой группе животных.

На фиг. 4 изображен график, показывающий изменения в количестве эритроцитов в каждой группе животных.

На фиг. 5 изображен график, показывающий изменение числа тромбоцитов в каждой группе животных.

На фиг. 6 изображен график, показывающий изменение в количестве лейкоцитов для каждой группы животных.

На фиг. 7 изображен график, показывающий изменение концентрации IgG1 в сыворотке крови в каждой группе животных.

На фиг. 8 изображен график, показывающий изменение концентрации человеческого IL-6 в группах 1-5.

На фиг. 9 показан результат сортировки клеток с использованием контрольного антитела IgG и Gr-I антитела у животных в группах 1 и 2 с помощью метода флюоресцирующих антител.

На фиг. 10 показан результат сортировки клеток с использованием контрольного антитела IgG и Gr-I антитела у животных в группах 6 и 7 с помощью метода флюоресцирующих антител.

На фиг. 11 изображен график, показывающий вес селезенки у животных в каждой группе в конце эксперимента.

На фиг. 12 изображен график, показывающий изменение в весе тела животных в каждой группе.

На фиг. 13 изображен график, показывающий концентрацию триглицерида в крови мышей на 11 день эксперимента.

На фиг. 14 изображен график, показывающий концентрацию глюкозы в крови мышей на 15-й день эксперимента.

На фиг. 15 изображен график, показывающий концентрацию ионизированного кальция в крови мышей на 11-й день эксперимента.

На фиг. 16 изображен график, показывающий уровень выживания контрольных мышей, имеющих опухоль.

На фиг. 17 изображен график, показывающий вес тела мышей на 10 и 12 день от момента начала эксперимента.

На фиг. 18 изображен график, показывающий концентрацию ионизированного кальция в крови мышей на 10-й и 12-й день от начала эксперимента.

Заболевания, вызываемые образованием интерлейкина-6, включают, в частности, плазмацитоз, например ревматизм и болезнь Кастлмана, гипериммуноглобулинемию, анемию, нефрит, в частности пролиферирующий мезангиальный нефрит, кахексия и т.д.

Используемое по способу настоящего изобретения антитело к рецептору интерлейкина-6 может быть любого происхождения и любого типа (моноклональное, поликлональное), важна лишь его способность блокировать сигнальную трансдукцию под действием IL-6 и ингибировать биологическую активность IL-6. Предпочтительно, чтобы это было моноклональное антитело, полученное из млекопитающего. Антитело блокирует сигнальную трансдукцию, возникающую под влиянием IL-6, и ингибирует биологическую активность IL-6 за счет ингибирования связывания IL-6 с IL-6R.

Клетки животных, пригодные для продуцирования моноклонального антитела, могут относиться к клеткам млекопитающих, при этом упомянутое антитело может быть антителом человека или антителом, происходящим от другого животного, отличного от человека. Предпочтительно, в случае моноклональных антител, полученных из животного, отличного от человека, чтобы это был кролик или грызун в связи с легкостью продуцирования в этих животных. В предпочтительном варианте грызуны включают, не ограничиваясь ими, мышей, крыс, хомяков и т.д.

Упомянутое антитело к рецептору интерлейкина включает, в частности, антитело MR16-1 (Tamura, Т. , et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 11924-11928), антитело PM-1 (Hirata, Y. et al., J.Immunol., 1989, 143, 2900-2906) и др.

Моноклональные антитела могут быть получены известным в технике методом. Так, их можно получить с использованием IL-6R в качестве иммунизирующего антигена, который уже применяется в традиционной технике иммунизации, а затем провести слияние полученных таким образом иммуноцитов с родительской клеткой с помощью известного метода клеточного слияния с последующим скринингом обычным для этого случая методом антитело-продуцирующих клеток.

Более специфично, моноклональные антитела получают следующим способом. Так, например, упомянутый иммунизирующий антиген может быть получен с использованием генной последовательности человеческого IL-6R, описанной в заявке на Европейский патент ЕР 325474. Затем генную последовательность человеческого IL-6R вставляют в систему вектора экспрессии в подходящей хозяйской клетке для ее трансформации, после чего нужный белок IL-6R выделяют из хозяйских клеток или культурального супернатанта и очищают с последующим использованием такого очищенного белка IL-6R в качестве иммунизирующего антигена.

Кроме того, упомянутый иммунизирующий антиген может быть выделен из мышей с применением мышиной генной последовательности IL-6R, которая была описана в выложенной Японской заявке, не прошедшей экспертизу, 3(1991)-155795, с помощью метода, аналогичного тому, что был описан выше применительно к человеческому IL-6R.

В качестве антигена, как и IL-6R, экспрессируемый на клеточной мембране, могут использоваться также и те последовательности (sIL-6R), которые, по всей видимости, отделяются от клеточной мембраны, sIL-6R включает в основном внеклеточный домен IL-6R, связанный с клеточной мембраной, отличаясь от мембраносвязанного IL-6R тем, что он не содержит трансмембранного домена или не содержит ни трансмембранного домена, ни внутриклеточного домена.

Относительно млекопитающих, которые подвергаются иммунизации с применением упомянутого иммунизирующего антигена, хотя и не обязательно, но предпочтительно учитывать их совместимость с родительской клеткой, используемой для слияния, при этом обычно они включают мышей, крыс, хомяков, кроликов и др.

Иммунизация животного описываемым иммунизирующим антигеном осуществляется известным в технике методом. Так, общий метод включает внутрибрюшинное или подкожное введение упомянутого антигена в организм млекопитающего. Более конкретно, иммунизирующий антиген, разбавленный или суспендированный в ФБР (фосфатно-буферном растворе), физиологическом растворе и т.д., до соответствующего объема, перемешивают, при необходимости, с нужным количеством соответствующего адъюванта, например полного адъюванта Фрейнда, эмульгируют, и затем, предпочтительно, эту эмульсию вводят млекопитающему несколько раз, каждые 4-21 день. Кроме того, при иммунизации упомянутым иммунизирующим антигеном может использоваться соответствующий носитель.

После иммунизации животного вышеописанным способом проводят определение содержания антитела в сыворотке крови для подтверждения повышения его уровня до нужного значения, выделяют из животного иммуноциты и проводят клеточное слияние. В качестве предпочтительного иммуноцита следует отметить клетку селезенки.

Миеломная клетка, применяемая в настоящем изобретении в качестве родительской клетки для слияния с иммуноцитом, является предпочтительно одной из известных клеточных линий, например Р3 (Р3х63Ag8.653) (J.Immunol., 1978, 123, 1548), p3-Ul (Current Topics in Microbiology and Immunology, 1978, 81, 1-7), NS-1 (Eur. J.Immunol., 1976,6, 511-519), MPC-11 (Cell.,1976, 8, 405-415), SP2/0 (Nature, 1978, 276, 269-270), FO [J. Immunol. Meth., 1980, 35, 1-21), S194 (J. Exp. Med. , 1978, 148, 313-323), R210 [Nature, 1979, 277, 131-133) и др.

Клеточное слияние упомянутого иммуноцита с миеломной клеткой осуществляют по существу в соответствии с известной методикой, описанной Мильштейном с coaвт. (Milstein et al., Methods Enzymol., 1981, 73, 3-46).

Более конкретно, рассматриваемое клеточное слияние может быть проведено в присутствии, например, агента, ускоряющего клеточное слияние, проводимое в обычной питательной среде. В качестве такого агента, ускоряющего клеточное слияние, может использоваться полиэтиленгликоль (ПЭГ), Сендаи вирус (HVJ) и др., а при желании для повышения эффективности клеточного слияния может быть непосредственно в среду внесен адъювант, такой, например, как диметилсульфоксид и др.

Коэффициент соотношения используемых иммуноцитов и миеломных клеток составляет предпочтительно от 1 до 10 раз больше иммуноцитов чем миеломных клеток. В качестве жидких культуральных сред, которые могут использоваться для осуществления вышеприведенного клеточного слияния, можно упомянуть такие, как жидкая среда RPMI 1640 и жидкая среда MEM, которые наиболее благоприятны для роста миеломной клеточной линии, а для роста клеточной культуры могут быть использованы обычные культуральные бульоны, кроме того, могут быть внесены сывороточные добавки, такие как околоплодная сыворотка теленка (FCS) и др.

Нужные слитые клетки (гибридомы) могут быть получены при смешивании заданного количества вышеупомянутых иммуноцитов с миеломными клетками в указанном питательном бульоне, при сопутствующем добавлении раствора ПЭГ, предварительно нагретого до температуры 37^oC, в частности раствора ПЭГ, имеющего средний молекулярный вес в диапазоне от 1000 до 6000 при концентрации от 30 до 60% (вес/объем). Далее проводят последовательное добавление подходящих куль- туральных сред, которые затем центрифугируют для удаления супернатанта, а также агентов, внесенных ранее для проведения клеточного слияния и которые нежелательны для роста гибридомы.

Описываемые гибридомы могут быть далее отобраны в ходе культивирования на обычной для целей селекции среде, такой, например, как жидкая культуральная среда HAT (жидкая культуральная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование в среде HAT осуществляется в течение времени, достаточного для того, чтобы клетки, отличные от гибридомы (т.е. не слитые клетки), погибли, обычно это занимает от нескольких дней до нескольких недель. Затем проводится скрининг с применением традиционного метода предельных разведений для выявления гибридомы, продуцирующей нужное антитело и получения на ее основе моноклональной линии.

Гибридомы, продуцирующие нужные моноклональные антитела, могут быть подвергнуты субкультивированию в традиционной жидкой среде, после чего их можно хранить в жидком азоте в течение длительного периода времени.

Для получения на основе указанной гибридомы моноклонального антитела применяют различные методы, в частности, такой, в котором упомянутую гибридому культивируют по традиционной методике, применяемой для получения культурального супернатанта, или такой, в соответствии с которым гибридому имплантируют в организм совместимого с ней млекопитающего и выращивают в нем до получения антител из образующейся асцитной жидкости и т.п. Первый из упомянутых методов применим для получения высокоочищенного антитела, тогда как второй метод пригоден для продуцирования большого количества антител.

Далее моноклональные антитела, получаемые с применением вышеупомянутых методов, могут быть очищены с помощью традиционных процедур, таких как высаливание, гель-фильтрация, аффинная хроматография и т.д.

Способность приготовленных таким способом антител узнавать антиген с высоким сродством и высокой точностью подтверждается обычными иммунологическими методами, такими как радиоиммуноанализ, иммуноферментный анализ (EIA, ELISA), метод измерения флуоресценции антител (иммунофлуоресцентный анализ) и др.

Моноклональное антитело, используемое согласно настоящему изобретению, не ограничивается только антителом, продуцируемым гибридомой, а может представлять собой искусственное антитело с целью снижения его гетероантигенности для человека. Так, например, могут использоваться химерные антитела, включающие вариабельные участки мышиного моноклонального антитела и константные участки человеческого антитела. Такие химерные антитела могут быть получены с помощью известного метода, используемого для получения химерных антител, и прежде всего, генноинженерного метода.

Кроме того, в настоящем изобретении может использоваться человеческое антитело с измененной формой. Оно представляет собой такое антитело, в котором комплементарные участки, определяющие регионы человеческого антитела, замещены комплементарными участками, характерными для регионов в антителе другого млекопитающего, отличного от человека, например мышиного антитела, при этом основной метод генетической инженерии, применяемый для такого манипулирования, известен из предшествующего уровня техники. С помощью такого метода можно получить человеческое антитело с измененной формой, пригодное для настоящего изобретения.

При необходимости аминокислоты в каркасных областях (FS) вариабельного участка антитела могут подвергаться замещению, так что на комлементарных участках, определяющих регион восстановленного человеческого антитела, может образовываться сайт связывания для соответствующего антигена (Sato et al., Cancer Res., 1993, 53, 1-6). В качестве предпочтительного примера такого измененного человеческого антитела можно отметить полученное из организма человека антитело РМ-1 (hPM-1) (см. Международную патентную заявку 9219759).

Гены, кодирующие фрагменты антитела, например Fab или Fv у одинарной цепи Fv (scFv), на которой участки Fv от H цепи или L цепи соединяются с помощью подходящего линкера, могут быть сконструированы и далее экспрессированы в подходящих клетках хозяина, что позволяет использовать их для вышеуказанных целей, поскольку такие фрагменты связываются с антигеном и ингибируют активность IL-6 (см. , например, Bird et al., TIBTECH, 1991, 9, 132-137); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 5879-5883). Кроме того, упомянутый измененный V регион антитела может быть использован геном Fv на H цепи и на L цепи для получения scFv.

Фармацевтические композиции, применяемые для профилактики или лечения заболеваний, вызываемых образованием IL-6, которые включают в качестве активного ингредиента антитело к рецептору IL-6 настоящего изобретения, могут использоваться по методу настоящего изобретения, поскольку они обладают способностью блокировать сигнальную трансмиссию IL-6 и эффективны против заболеваний, вызываемых образованием IL-6.

Фармацевтические композиции, применяемые для профилактики или лечения заболеваний, вызываемых образованием IL-6, предпочтительно вводятся парентерально, в частности посредством внутривенной, внутримышечной, внутрибрюшинной или подкожной инъекций и др., причем как системно, так и местно. Кроме того, они могут представлять собой фармацевтическую композицию или набор, применяемые в сочетании по меньшей мере с одним носителем или разбавителем.

Несмотря на то, что дозировка фармацевтической композиции настоящего изобретения зависит от состояния пациента, его возраста или от способа введения препарата, необходимо тем не менее выбрать соответствующее количество для применения. Так, например, количество в диапазоне от 1 до 1000 мг на одного пациента может быть введено в виде четырех раздельных доз. Альтернативно, они могут быть введены в количестве от 1 до 10 мг/кг/неделю. При этом применение фармацевтических композиций настоящего изобретения для профилактики или лечения не ограничивается вышеупомянутыми дозами.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть приготовлены с применением известных обычных методов. Так, например, парентеральные препараты могут быть получены при растворении очищенного антитела IL-6R в растворителе, таком как физиологический раствор, буферный раствор и др., к которому добавляют антиадсорбент, т.е. Твин 80, желатин, человеческий сывороточный альбумин (HSA) и др., или указанные композиции могут быть в лиофилизированной форме, которые непосредственно перед применением разбавляют. В качестве наполнителей для лиофилизации может использоваться сахарный спирт, такой как маннит, глюкоза и др. или сахариды.

Примеры Ниже даны примеры, в том числе справочные, для более детального пояснения настоящего изобретения, однако их никоим образом не следует рассматривать как ограничивающие в каком-либо аспекте описываемое изобретение.

Пример композиции Антитело к рецептору интерлейкина-6 - 2,5 мг/мл Полисорбат 80 - 0,005% D-манит - 0,5% Натрия фосфат - 19 мМ (pH 6,5) Натрия хлорид - 120 мМ Справочный пример 1 Конструирование B6L^d-IL-6' трансгенной мыши
Фрагмент Sphl-Xhol (L^d-IL-6) размером 3,3 кбайта, несущий человеческую IL-6 кДНК, которая соединена с H-2L^d промотором (Suematsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 7547), инъецируют в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши C57BL/6J (В6) (Nihon Clea) посредством микроинъекционной техники по методам, описанным (Yamamura et al., J. Biochem., 1984, 96, 357).

Оплодотворенную яйцеклетку имплантируют в яйцевод самки мыши линии ICR, которую перед этим подвергли обработке, имитирующей беременность. После этого у новорожденных мышей провели исследование факта интеграции hiL-6 кДНК в геном посредством Саузерн-блоттинг-анализа, используя в качестве источника EcoRl-расщепленную хвостовую ДНК, а в качестве зонда Tagl-Banll фрагмент кДНК человеческого IL-6, меченный ³²Р. Животных, которым было показано интегрирование, выращивали вместе с мышами В6 для установления линии, имеющей одинаковый генотип.

Справочный пример 2
Получение у крыс антитела к IL-6R
По методу, описанному Саито с соавт. (Saito et al., J. Immunol., 1991, 147, 168-173), были получены клетки СНО, продуцирующие растворимый IL-6. Клетки инкубируют при 37^oC в среде MEM, содержащей 5% околоплодной сыворотки теленка (FBS) в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО₂. Кондиционированную среду регенерируют и используют в качестве препарата мышиного slL-6. Концентрацию мышиного sIL-6 в среде определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа (sandwich ELISA) с использованием моноклонального антитела RS15 к мышиному IL-6R (Saito et al., J. Immunol., 1991, 147, 168-173) и поликлонального антитела кролика к мышиному IL-6R.

Мышиный sIL-6R чистят, используя в качестве источника мышиный препарат sIL-6R и применяя для этого колонку для аффинной хроматографии, на которой абсорбировано моноклональное антитело к мышиному IL-6R (RS12). Пятьдесят микрограмм очищенного мышиного sIL-6R в полном адъюванте Фрейнда инъецируют подкожно крысе Вистар, после чего спустя две недели крысу повторно иммунизируют четыре раза подкожными инъекциями по 50 мкг мышиного sIL-6R в неполном адъюванте Фрейнда с частотой один раз в неделю. Через неделю после первой бустер-инъекции крысам вводят внутривенно 50 мкг мышиного sIL-6R в 100 мкл фосфатно-буферного раствора (ФБР).

Через три дня у крыс отбирают селезенку и проводят процедуру слияния спленоцитов крыс с миеломными клетками мышей p3U1 в соотношении 10:1. Клетки инкубируют в ячейках на 96 ячеечной пластине (Фалькон 3075) в течение ночи при температуре 37^oC в 100 мкл среды RPM1 1640, содержащей 10% околоплодной сыворотки теленка, а затем добавляют по 100 мкл среды, содержащей гипоксантин/аминоптерин/тимидин (HAT). В течение четырех дней проводят ежедневное замещение половины среды на HAT среду.

Спустя семь дней с помощью теста на связывание с мышиным sIL-6R (ТИФА) отбирают гибридому, продуцирующую антитело к мышиному sIL-6R. В общих чертах процедура заключается в следующем: инкубируют 100 мкл культурального супернатанта на плато, в ячейки которого предварительно было внесено в концентрации 1 мкг/мл поликлональное антитело кролика к IgG крысы. Пластину промывают и затем инкубируют с 100 мкг/мл мышиного sIL-6R. После промывания добавляют до концентрации 2 мкг/мл поликлональное антитело кролика к мышиному IL-6R, пластину промывают, после чего в течение 60 минут проводят инкубацию с комплексом, включающим щелочную фосфотазу, конъюгированную с поликлональным козлиным антителом к IgG кролика (Тадо).

И наконец, после отмывания, проводят инкубацию с субстратом щелочной фосфотазы (Сигма 104: п-нитрофенилфосфат) и измеряют при длине волны 405 нм с использованием регистра тора для пластины (Toso). Гибридому, распознающую мышиный sIL-6R, дважды клонируют, применяя метод предельных разведений. Для получения асцитов в мышей BALB/c nu/nu два раза инъецируют по 0,5 мл пристана, а через три дня проводят внутрибрюшинную инъекцию установленных клеток гибридомы в количестве 310⁶. Спустя 10-20 дней собирают асциты, из которых выделяют и затем чистят моноклональное антитело MR16-1 с применением колонки с протеином G (Oncogene Science).

Нейтрализующее воздействие IL-6 на антитело, продуцируемое MR16-1, исследовали при включении ³Н-тимидина МН60. BSF2 клетками (Matsuda et al., Eur. J. Immunol. , 1988, 18, 951-956). Из клеток МН60. BSF2 отбирают аликвоту в количестве 110⁴ клеток/200 мкл/ячейку 96-гнездового плато, после этого к каждой ячейке добавляют мышиный IL-6 (10 пг/мл) и антитело MR16-1 или RS12, и затем проводят инкубацию клеток при температуре 37^oC в течение 44 часов в атмосфере, содержащей 5% СO₂. Спустя 4 часа добавляют к каждой ячейке ³Н-тимидин (1..mCi/ячейку) и исследуют включение ³H-тимидина.

Пример 1
В соответствии с методикой справочного примера 1 подготавливают и далее обрабатывают 31 трансгенную мышь, которая содержит кДНК человеческого IL-6, репродуцированную на основе (В6 IL-6) трансгенной мыши (В6 IL-6 Tgm), и вместе с ними используют 11 нормальных животных, не несущих кДНК человеческого IL-6 (все животные были 4-х недельного возраста; самцы). В6 IL-6 Tgm разделяют на пять групп (от группы 1 до группы 5) по шесть животных в каждой группе, за исключением группы 1, которая включает семь животных. Нормальные животные из выводка также распределяются на несколько групп: группу 6 из 5 мышей и группу 7, состоящую из шести мышей.

Применялся следующий режим введения:
Группа 1 (В6 IL-6 Tgm): в 4-х недельном возрасте, т.е. (в первый день эксперимента) вводят внутривенно крысиное антитело IgGI (КН5) (контрольное антитело) в дозе 2 мг/0,2 мл, а в возрасте 5 недель (8-ой день эксперимента) и позже инъецируют подкожно дважды в неделю 100 мкг антитела КН5 (инъекцию проводят каждые 3-4 дня).

Группа 2 (В6 IL-6 Tgm): В 4-х недельном возрасте животным вводят внутривенно в дозе 2 мг/0,2 мл MR16-1 антитело, а в 5-ти недельном возрасте и позже - 100 мкг MR16-1 инъецируют подкожно 2 раза в неделю.

Группа 3 (В6 IL-6 Tgm): В 4-х недельном возрасте животным вводят внутривенно 0,2 мл фосфатно-буферного раствора, а в 5-ти недельном возрасте и позже дважды в неделю инъецируют подкожно 100 мкг МR16-1.

Группа 4 (В6 IL-6 Tgm): В 4-х недельном возрасте животным инъецируют внутривенно 2 мг/0,2 мл MR16-1, а в возрасте 5 недель и позже подкожно инъецируют раз в неделю по 400 мкг MR16-1.

Группа 5 (В6 IL-6 Tgm): В 4-х недельном возрасте животным инъецируют внутривенно 2 мг/0,2 мл MR16-1 и 5-ти недельном возрасте и позже инъецируют подкожно 1 мг MR16-1, каждую вторую неделю.

Группа 6 (В6 нормальные животные): В 4-х недельном возрасте животным инъецируют внутривенно 2 мг/0,2 мл контрольного антитела КН5, а в 5-ти недельном возрасте и позже дважды в неделю им инъецируют подкожно по 100 мкг КН5.

Группа 7 (В6 нормальные животные): В 4-х недельном возрасте животным инъецируют внутривенно 2 мг/0,2 мл MR16-1, в а 5-ти недельном возрасте и позже им вводят подкожно дважды в неделю по 100 мкг MR16-1.

Тестирование проводят следующим образом.

Определение веса тела и определение белка в моче: ежедневно проводят взвешивание и определение белка в моче с помощью индикаторной бумаги на белок мочи (Combistics San-kyo). Трехкратное превышение белка в моче (от 100 до 300 мг/дл) было принято в качестве положительного значения в данном тесте.

Отбор образцов крови: из задне-глазничного синуса образцы крови отбирали регулярно, через неделю, с момента начала эксперимента (4-х недельный возраст), а в конце эксперимента (18 недель) была отобрана вся кровь через нижнюю полую вену.

Анализ крови: с помощью микросчетчика клеток (Sysmex F-800) определяют количество лейкоцитов (Л), эритроцитов (Э) и тромбоцитов (Т), а также уровень гемоглобина (Hb). К концу эксперимента для ряда групп (группы 1, 2, 6 и 7) подготавливают мазки крови и вычисляют на их основе процентное содержание лейкоцитов.

Определение концентрации IgG в крови: измерение проводят по методу ИФТФА с применением в качестве стандартного миеломного белка мышиного IgG.

Определение концентрации IL-6 в крови: измерение проводят по методу ТИФА с применением hIL-6.

Определение в крови титра антител к крысиным IgG (IgG класс): поскольку вводимое антитело является для мыши гетерогенным, образование антитела на вводимое гетерогенное антитело определяют по методу ТИФА с применением в качестве антигена крысиного IgG. Полученный результат выражают в единицах с использованием в качестве стандарта IL-6 Tgm сыворотки взрослого животного, которому давали крысиное антитело.

Определение химических характеристик крови: в конце эксперимента у мышей в группах 1, 2, 3, 6 и 7 с помощью автоматизированного анализатора (COBAS FARA 11, Roche) измеряют уровень общего белка (ТР), альбумина (Alb), глюкозы (Glu), триглицерида (TG), креатинина [кре (Cre)], азота крови и мочи (BUN), кальция (Са), щелочной фосфотазы (ALP), глутаминпируваттрансаминазы [гнт (GOT)] и глутаматпируваттрансаминазы [гпт (GPT)].

Флоуресцентный анализ (FACS анализ) костного мозга и спленоцитов: в конце эксперимента от животных в группах 1, 2, 6 и 7 получают костный мозг и спленоциты, которые анализируют на наличие антигенов клеточной поверхности с помощью активируемого флуоресценцией анализатора FACScan (Beckton Dickensian). Действие используемых антител (Pha-rmingen) направлено непосредственно на клетки Gr-I (клетки костного мозга), CD4, CD8 и B220 (спленоциты).

Аутопсия: в конце эксперимента проводят аутопсию и измеряют вес селезенки, а другие основные органы визуально обследуют.

Вес тела: на фиг. 1 показаны изменения в весе тела животных в группах 1 и 3. Между группами не было обнаружено разницы в изменении веса тел.

Белок мочи: в группе 1 животные, оцениваемые положительно по наличию белка в моче, начинают появляться с 13-недельного возраста (фиг. 2), при этом из семи бывших в этой группе животных 4 животных (2 в 16-недельном возрасте и 2 в 17-недельном возрасте) умерли во время аутопсии. Тогда как в других группах не было отмечено летальных исходов. В группе 3 к концу эксперимента двое из шести животных стали положительными на наличие белка в моче, однако в других группах положительных по этому критерию животных не было выявлено.

Гематологические показатели: в группе 1 отмечены снижение уровня гемоглобина (фиг. 3) и количества Э (фиг. 4), причем выраженность этих изменений усиливается с возрастом. Количество тромбоцитов (фиг. 5) временно увеличивается, но затем быстро снижается. В группе 3 была отмечена аналогичная тенденция, хотя и с некоторым запозданием в сравнении с группой 1. С другой стороны, в группах 2, 4 и 5 не было отмечено ни снижения уровня гемоглобина и числа эритроцитов, ни увеличения уровня тромбоцитов с последующим снижением их числа. При дифференциальном подсчете форменных элементов крови в мазках крови в группе 1 было выявлено повышение уровня нейтрофилов и моноцитов и соответствующее снижение фракции лимфоцитов, но для группы 2 были получены нормальные значения (таблица 1). При этом между группами 6 и 7 также не было выявлено значимых различий.

Концентрация IgGI в крови: в группе 1 для концентрации IgGI в крови было показано значительное повышение сразу же после начала эксперимента, которое достигало почти 100-кратного превышения над его концентрацией у нормальных мышей (фиг. 7). В группе 3 повышение концентрации IgGI происходит несколько позже, чем в группе 1. В отличие от них, в группах 2,4 и 5 не отмечается повышения концентрации IgGI, которая остается в течение всего эксперимента практически на одном и том же уровне. С другой стороны, у нормальных мышей не отмечается изменений, связанных с введением антитела.

Концентрация hIL-6: концентрация hIL-6 в крови (фиг. 8) варьирует таким же образом, что и концентрация IgGI, демонстрируя повышение в группах 1 и 3, но оставаясь практически на одном и том же уровне в ходе всего эксперимента в других группах.

Титр антител к крысиному IgG в крови: антитела к крысиному IgG были обнаружены в группах 1, 3 и 6 (таблица 2). У всех животных в группах 1 и 3 было выявлено повышение титра, тогда как в группе 6 только у двух из пяти животных показано повышение титра. С другой стороны, в остальных группах не отмечается значимого увеличения.

Определение химических параметров крови: в группах 1 и 3 отмечается повышение числа тромбоцитов и снижение уровня альбумина. Уровень тромбоцитов и щелочной фосфотазы снижается в группах 1 и 3, при этом в группе 1 снижается также содержание глюкозы. Тогда как в группе 2 не выявлено таких изменений.

Флуоресцентный анализ (FACS анализ): Анализ клеток костного мозга (КМ) и спленоцитов (сп) в группах 1,2,6 и 7 выявил очень сильное увеличение доли Gr-I положительных клеток, которые являются предшественниками гранулоцитов, в клетках костного мозга у животных в группе 1 (фиг. 9 и фиг. 10), однако значения аналогичной характеристики для группы 2 близки к результатам, полученным для нормальных животных. При этом не отмечалось существенной разницы между группами 6 и 7. Относительно доли CD4-, CD8- и В220-положительных клеток в спленоцитах было показано, что между группами отсутствуют какие-либо различия, за исключением группы 1, для которой выявлено снижение доли CD8- и В220-положительных клеток в связи с увеличением числа плазматических клеток (таблица 4).

Результаты аутопсии: в группах 1 и 3 происходит, скорее всего, набухание системных лимфатических узлов и увеличение селезенки (фиг. 11), что ведет к обесцвечиванию почки. Было отмечено также некоторое увеличение печени. В других группах таких изменений не было выявлено, единственным заметным изменением было небольшое увеличение размеров селезенки в сравнении с нормальными животными, и отмечалось оно в группах 2, 4 и 5.

Ниже будет дано объяснение результатов эксперимента. В группе IL-6 Tgm (группа 1), в которой проводилось введение контрольного антитела, отмечается множество симптомов, таких как IgGI плазмацитоз, анемия, тромбоцитоз, тромбоцитопения, почечная недостаточность, аномалии химических характеристик крови и др. Однако стало очевидно, что все эти симптомы полностью подавляет MR16-1.

Известно, что IL-6 ведет к тому, что В клетки дифференцируются на конечном этапе в плазматические клетки (Muraguchi A. et al., J.Exp. Med. 1988, 167, 332-344), при этом в случае IL-6 Tgm образование IL-6 вызывает повышение концентрации IgGI в крови, а также увеличение концентрации тромбоцитов и уменьшение концентрации альбумина в сыворотке. Эти данные указывают на начало IgGI плазмацитоза.

Сильное разрастание системных лимфатических тканей, таких как лимфатические узлы и селезенка, отмечаемое в этом случае, приводит к увеличению веса тела, тогда как в группах 1 и 3 ухудшение общего состояния ведет к прогрессированию заболевания. MR16-1 не только полностью подавляет такие проявления болезни, но также подавляет повышение в крови концентрации IL-6. Таким образом, подтверждается, что связанное с возрастом, как в случае IL-б Tgm, повышение концентрации IL-6 имеет прямое отношение к развития плазмацитоза. Поэтому пролиферирующие плазматические клетки, скорее всего, сами активно продуцируют IL-6, который затем, в свою очередь, усиливает рост плазматических клеток, что и приводит в результате к тому, что IL-6 продуцируется в больших количествах.

Так же, как и действие IL-6 на форменные элементы крови, хорошо известно влияние его на увеличение числа тромбоцитов (Ishibashi Т. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 1989, 86, 5953-5957; Ishibashi Т. et al., Blood, 1989, 74, 1241-1244), а также его индуцирующее воздействие на развитие макроцитарной анемии (Hawley, R.G. et al., J. Exp.Med., 1992, 176, 1149-1163). Кроме того, в группе IL-6 Tgm наблюдается тромбоцитопения, связанная со старением, которая, по всей видимости, имеет отношение к аутоиммунитету, определяемому активацией В клеток (Miyai, Tatsuya et al., ibid).

MR16-1 полностью подавляет прямое и опосредованное воздействия IL-6 на форменные элементы крови, но никак не влияет на число форменных элементов крови у нормальных животных. Таким образом, подтверждается, что антитело к рецептору IL-6 совсем не воздействует на гематоцитоз. В группе IL-6 Tgm наблюдается повышение доли Gr-I положительных клеток, которые рассматриваются как предшественники гранулоцитов, а также доли периферических нейтрофилов, механизм которого до сих пор полностью не понятен. Было также обнаружено в этом исследовании, что указанный эффект имеет место в костном мозге на уровне клеток-предшественниц. Кроме того, в этом же исследовании было обнаружено, что MR16-1 полностью подавляет влияние IL-6, но не воздействует на уровень нейтрофилов в костном мозге и в периферической крови.

MR16-6 подавляет также развитие нефрита, наблюдаемое в группе IL-6 Tqm. В литературе имеется сообщение о том, что IL-6 тесно связан с запуском пролиферации мезангия при нефрите как аутокринный фактор роста клеток мезангия. Несмотря на то, что нефрит в группе IL-6 Tgm представляет собой нефрит, связанный с пролиферацией мезангия, нельзя исключать участие в этом процессе иммунной системы, усиливаемой под действием IL-6 (Katsumo, Asao et al. , доклад на 21-м Съезде Японского Общества иммунологов "Characterization of SCID х (SCID x H-2L^d hIL-6 transgenic mice"), 1991]. В любом случае, поскольку наблюдается подавление появления белка в моче и отсутствие летальных случаев, ясно, что антитело против рецептора IL-6 эффективно, в плане подавления начала развития нефрита, вызываемого образованием IL-6.

В группе IL-6 Tgm наблюдается значительное снижение концентраций глюкозы и тромбоцитов, что является индикатором развития кахексии. В настоящем эксперименте была продемонстрирована эффективность MR16-6 по ослаблению кахексии, поскольку в группе 1 происходит снижение значений концентраций глюкозы и тромбоцитов, тогда как в группе 2 эти параметры изменяются, принимая значения практически на том же уровне, что у нормальных животных.

Поскольку MR16-6 представляет собой крысиный IgGI, который является для мышей чужеродным белком, следует ожидать образование антител против введенного антитела, которые могут сделать введенное антитело неэффективным.

С целью индуцирования в рамках эксперимента иммунологической толерантности посредством введения при первой сенсибилизации большого количества антигена группы организовали таким образом, чтобы при первом введении внутривенно давать по 2 мг/мышь. Среди групп, получивших MR16-6 (группы 1, 4 и 5), не обнаружено продуцирования заметных количеств антитела против крысиного IgG, независимо от вводимой дозы и от величины интервала между инъекциями, что приводит к полному подавлению развития заболевания в самом начале. Однако группа 3, которая представляет собой группу введения контрольного антитела, демонстрирует постепенное появление тех же самых симптомов, что и в группе 1, хотя в ней показано повышение уровня антитела против крысиного IgG, а развитие признаков заболевания несколько запаздывает в сравнении с группой 1.

Исходя из этого, можно считать, что рассматриваемая обработка является эффективной с точки зрения индуцирования иммунологической толерантности, однако антитело против крысиного IgG обнаруживалось также у всех животных в группе 1 и у 2/5 животных в группе 6, которая получала в том же режиме контрольное антитело. Поскольку развитие плазмацитоза в IL-6 Tgm индуцирует активацию поликлональных В клеток, нельзя сделать вывод о том, что обнаруживаемые в группах 1 и 3 антитела против крысиного IgG специфичны именно для данного введенного антитела. Однако было заключено, что иммунологическая толерантность, создаваемая при воздействии большого количества антигена в первой сенсибилизации групп 2, 4 и 5, обладает индуцирующим воздействием, которое, соединяясь с ингибирующим эффектом от образования в ответ на введение большого количества MR16-6 специфичных антител, приводят к индуцированию полной толерантности.

Настоящий эксперимент показал, что антитело против рецептора IL-6 является весьма эффективным против множества заболеваний, вызываемых образованием IL-6, при этом в случае нормального уровня оно не оказывает никакого воздействия.

Пример 2
Исследуют влияние антитела к мышиному рецептору IL-6 на модели индуцированной кахексии толстой кишки 26. В эксперименте использовали 6-ти недельных самцов мышей BALB/C, которым в бок на первый день исследования подкожно имплантировали 2-мм участок толстой кишки 26. На первый день эксперимента непосредственно перед имплантацией толстой кишки 26 животным вводили 2 мг/мышь антитело MR16-6 к мышиному рецептору IL-6 (см. справочный пример 2), а затем на день 7, 11, 14 и 18 (n = 7) его же дают в дозе 0,5 мг/мышь. В предыдущем эксперименте уже было подтверждено, что нейтрализующие антитела против чужеродного белка не так легко образуются в условиях этого метода. В том же режиме (n = 7) контрольной группе, несущей опухоль, вводят контрольное антитело к крысиному IgGI (КН5). Контрольной группе, не содержащей опухоль (n = 7), вводили ФБР. Начиная с момента старта эксперимента, каждый день взвешивают животных, а на 11 и на 15 день после начала эксперимента определяют химические показатели крови и величину ионизированного кальция.

На 10-й день и позже в группе, несущей опухоль, наблюдается выраженное снижение веса тела в сравнении с группой, не имеющей опухолей, тогда как в группе, принимавшей MR16-6, отмечается частично подавляющее снижение веса тела воздействие (фиг. 12). На фиг. 13 и фиг. 14 показаны соответственно концентрация триглицерида в крови на 11 день и концентрация глюкозы на 15 день. Эти величины демонстрируют выраженное снижение в контрольной группе, не несущей опухоли, тогда как в группе, принимавшей MR16-6, наблюдается супрессорная тенденция в отношении глюкозы и значительное супрессорное воздействие в отношении триглицерида.

Концентрация ионизированного кальция в крови на 11 день выражение повышается в контрольной группе, несущей опухоль, в сравнении с контрольной группой, не содержащей опухоль, тогда как в группе, принимавшей MR16-6, наблюдается значительный супрессорный эффект (фиг. 15).

В аналогичном режиме (n = 10) был осуществлен эксперимент, подтверждающий влияние на время выживания. Было показано, что в группе, принимающей MR16-6, время выживания испытывает воздействие со стороны вводимого антитела (фиг. 16).

Пример 3
Исследуют влияние антитела к рецептору IL-6 на модели осс-1-индуцированной кахексии, сопровождаемой гиперкальциемией. В эксперименте используют 6-ти недельных самцов голых мышей. На первый день эксперимента в бок мышам имплантируют линию сквамозных раковых клеток. Антитело MR16-6 к рецептору мышиного IL-6 (см. справочный пример 2) вводят внутривенно в дозе 2 мг/мышь непосредственно перед имплантацией осс-1 в первый день эксперимента, а затем на 7 день и на 10 (n = 6) мышам вводят его же подкожно в дозе 100 мкг/мышь. В предыдущих экспериментах уже было показано, что нейтрализующие антитела против чужеродного белка-крысиного антитела, не так легко образуются в условиях этого метода. К контрольной группе, несущей опухоль, в том же самом режиме (n = 6) вводят контрольное антитело к крысиному IgGI (КН5). Группе, не содержащей опухоли, вводили ФБР (n = 7). На 10 и 12 день с момента начала эксперимента взвешивают животных и определяют концентрацию в крови ионизированного кальция.

В группе, несущей опухоль, наблюдается снижение веса тела, а в группе, принимавшей MR16-6, продемонстрированы изменения, аналогичные тем, что выявляются в контрольной группе, не содержащей опухоли, что указывает на супрессию снижения веса тела (фиг. 17).

Концентрация ионов кальция в крови заметно повышается в контрольной группе, несущей опухоль, в сравнении с контрольной группой, не содержащей опухоли, тогда как в группе, принимавшей MR16-6, указанное повышение заметно подавляется (фиг. 18).

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболеваний, вызываемых образованием интерлейкина-6, которая включает антитело к рецептору интерлейкина-6.

2. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения по п.1, отличающаяся тем, что заболевание, вызываемое образованием указанного интерлейкина-6, представляет собой плазмацитоз.

3. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения по п.1, отличающаяся тем, что заболевание, вызываемое образованием указанного интерлейкина-6, представляет собой гипериммуноглобулинемию.

4. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения по п.1, отличающаяся тем, что заболевание, вызываемое образованием указанного интерлейкина-6, представляет собой анемию.

5. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения по п.1, отличающаяся тем, что заболевание, вызываемое образованием указанного интерлейкина-6, представляет собой нефрит.

6. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения по п.1, отличающаяся тем, что заболевание, вызываемое образованием указанного интерлейкина-6, представляет собой кахексию.

7. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения по п.2, отличающаяся тем, что указанный плазмацитоз индуцируется ревматизмом.

8 Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения. по п.1, отличающаяся тем, что указанное заболевание, вызванное образованием интерлейкина-6, является болезнью Кастилмана.

9. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения по п.5, отличающаяся тем, что указанный нефрит представляет собой мезангиальный пролиферирующий нефрит.

10. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения по любому из пп. 1 - 9, отличающаяся тем, что указанное антитело представляет собой моноклональное антитело.

11. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения по п.10, отличающаяся тем, что указанное антитело представляет собой антитело РМ-1.

12. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения по п.10, отличающаяся тем, что указанное антитело представляет собой химерное антитело.

13. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения по п.10, отличающаяся тем, что указанное антитело представляет собой видоизмененное человеческое антитело.

14. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения по п.13, отличающаяся тем, что упомянутое антитело представляет собой видоизмененное человеческое антитело РМ-1.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22