Способ прогнозирования течения дифтерийной инфекции у детей

 

Изобретение относится к медицине. Способ основан на определении микробной резистентности слизистой фарингеального эпителия. Определение проводят на эпителиоцитах в брашбиоптатах слизистой. Эпителиоциты суспензируют в фосфатно-солевом буфере при рН 7,2-7,4 с добавлением 0,5-0,7 млрд. клеточной суточной культуры Corynebacterium diphtheriae. После выдерживания в термостате при 37^oС в течение 30 мин и промывания смесь наносят на два предметных стекла. Затем на одном стекле определяют показатель адгезии как процент резистентных эпителиоцитов к адгезии микроорганизмов и индекс адгезии как среднее количество прикрепившихся микробных клеток к одному эпителиоциту. На другом стекле выявляют специфическое свечение, свидетельствующее о наличии секреторного IgA. При показателе адгезии, большем 10, индексе адгезии, меньшем 50, и наличии IgA прогнозируют благоприятное течение и исход инфекционного процесса. Способ позволяет сократить сроки обследования, не требует дорогостоящего оборудования, прост и доступен. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням, и может быть использовано для повышения точности и сокращения сроков прогнозирования течения инфекционного процесса.

Проблема дифтерийной инфекции (ДИ) сохраняет свою актуальность. Эпидемиологическая ситуация последних лет (1996-1998 гг.), характеризующаяся регистрацией локализованных, клинически легких, стертых форм и увеличением частоты бактерионосительства среди населения (особенно по уровню токсинообразования), требует разработки стратегии, обеспечивающей прогнозирование инфекционного процесса на качественно новом уровне [Иванова В.В., Радионова О.В., Курбатова Г. П. Патогенетические механизмы дифтерийной инфекции у детей // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1997 - N 5. - С. 33-36, Онищенко Г. Г. Эпидемиологическая обстановка и основные направления борьбы с инфекционными болезнями в Российской федерации за период 1991-1996 гг. // Там же. - 1997 - N 3. - С. 4-13].

С рассматриваемых позиций разработка методологических подходов раннего прогнозирования течения ДИ является актуальной задачей здравоохранения.

Известны способы прогнозирования течения инфекционного процесса при ряде бактериальных инфекций. Так, описан способ прогнозирования течения гонококковой инфекции на основе изучения персистентной характеристики Neisseria gonorrhoeae - антилизоцимной активности (АЛА) -, обеспечивающей патогену селективные преимущества при его взаимодействии с факторами противоинфекционной защиты организма хозяина и, в частности, лизоцима. Так, высокий уровень АЛА гонококков явился прогностически неблагоприятным признаком, позволяющим при свежей гонорее (3-4 мкг) ожидать хронизации процесса, а при хронической форме инфекции (8-12) - упорного течения инициируемого им воспалительного процесса [Воронина Л.Г. Антилизоцимная активность возбудителя в диагностике и прогнозировании течения гонококковой инфекции // Ж. микробиол. - 1997. - N 4. - С. 96-98]. Однако предложенный метод прогнозирования "Способ диагностики и прогнозирования течения гонококковой инфекции" основан только на определении характеристики возбудителя (персистентной характеристики - АЛА) без оценки резистентности "хозяина".

Способ прогнозирования течения хронической дизентерии, основанный на исследовании слизистой толстой кишки на наличие шигелл, а также эпителиальных клеток, в которых определяют содержание бактерий, адгезированных на клетках и находящихся внутри клеток. При содержании клеток возбудителя до 59% и менее на препарате диагносцируют хроническую дизентерию [Шувалова Е.П. , Полоцкий И. П. Способ диагностики хронической дизентерии: Авт. свид. N 4395773/14, 1991]. Наряду с этим изучение только адгезивной активности возбудителя не дает полной оценки течения инфекционного процесса в связи с тем, что не отражается характер резистентности макроорганизма.

В процессе первичного специфического взаимодействия возбудителя и "хозяина" на первый план выходят колонизационные характеристики микроорганизма и факторы, определяющие резистентность макроорганизма, то есть уровень секреторного иммуноглобулина класса A (S Ig A), который является основным иммуноглобулином секретов слизистых, блокирующий адгезию микроорганизмов к эпителиальным клеткам слизистых оболочек. Наиболее близким к данному способу является реакция непрямой иммунофлюоресценции для диагностики хламидийной инфекции. Сущность метода заключается в определении специфических иммуноглобулинов в сыворотке, слезе и других секретах против Chlamydia trachomatis. Это доступный и простой способ. [Панкратова В.Н., Шаткин А.А. Выявление хламидийных антител реакцией непрямой иммунофлюоресценции: Методические рекомендации. М. , 1983. 10 с.]. Однако этот и вышеперечисленные способы дают одностороннюю оценку характера взаимоотношений возбудителя и макроорганизма. В свете современных представлений инфекционный процесс представляет взаимодействие двух систем возбудителя и "хозяина". Следовательно, для наиболее объективной оценки этих взаимоотношений и, соответственно, более точного прогнозирования течения инфекционного процесса целесообразна комплексная оценка резистентности макроорганизма и свойств возбудителя.

С целью устранения вышеуказанных недостатков - повышения точности и сокращения сроков прогнозирования течения ДИ у детей - авторы предлагают комплексный способ прогнозирования течения инфекционного процесса. Поставленная цель достигается тем, что в известном способе прогнозирования используются эпителиоциты в брашбиоптатах слизистой, предварительно суспензированные в фосфатно-солевом буфере (pH 7,2-7,4) с добавлением 0,5-0,7 млрд. клеточной суточной культуры Corynebacterium diphtheriae, после выдерживания в термостате при 37^oC в течение 30 минут и промывания, смесь наносят на два предметных стекла, одно окрашивают по Романовскому-Гимзе, а на другое последовательно наносят диагностическую моноспецифическую сыворотку против иммуноглобулина A, антивидовую люминесцентную сыворотку против глобулинов барана и бычий альбумин меченый родамином, а затем определяют показатель адгезии - процент резистентных эпителиоцитов к адгезии микроорганизмов, индекс адгезии - среднее количество прикрепившихся микробных клеток к одному эпителиоциту и по наличию специфического свечения вокруг клеток тест-микроба, показателю адгезии 10, индексу адгезии 50 судят о благоприятном течении и исходе инфекционного процесса.

Анализ известных способов на дату подачи заявки показывает, что не существует подобных способов прогнозирования течения ДИ на основе изучения характеристик как микро- так и макроорганизма одновременно.

Это позволяет сделать нам вывод о существенности отличий заявляемого способа. Впервые сделана комплексная оценка взаимодействия "паразита" и "хозяина", благодаря которой можно прогнозировать течение инфекционного процесса.

Основные этапы проведения предлагаемого способа заключаются в следующем: Получение биоптата слизистой ротоглотки с помощью щеточки от эндоскопа, монтированной на держателе для бактериологических петель. Суспензирование в ФСБ (pH 7,2-7,4) с добавлением 0,5-0,7 млрд. клеточной суточной культуры в термостате при 37^oC в течение 30 мин. Результаты опытов, проведенных нами, показали, что время инкубации 30 мин является оптимальным, так как при более длительной инкубации показатель и индекс адгезии не увеличивались. Впервые предложены условия моделирования взаимодействия эпителиоцита с тест-культурой, наиболее приближенные к процессам, происходящим in vivo. Затем промывание в ФСБ (pH 7,2-7,4) в течение 5 мин, заданная pH обеспечивает физиологическую кислотность. Впервые нанесение отмытых эпителиоцитов производили на два предметных стекла, для одновременной оценки адгезивной возбудителя (колонизационной активности) и выявления SIg A, фактора резистентности макроорганизма. Фиксация одного из них в холодном ацетоне (t +4^oC) - 20 мин, а другого над пламенем спиртовки. На фиксированный в ацетоне мазок наносили диагностическую моноспецифическую сыворотку против Ig A, а другой окрашивали по Романовскому-Гимзе (краситель, применяемый для окраски клеток C.diphtheriae). Мазок с нанесенной сывороткой против Ig A инкубировали во влажной камере при 37^oC в течение 20 мин. Влажная камера необходима для лучшего взаимодействия S Ig A с анти Ig A. Далее промывание в ФСБ 2-кратное в течение 20 мин, для того чтобы смыть непровзаимодействованные анти Ig A. Нанесение сыворотки люминесцентной против глобулинов барана для придания мазку флюоресценции. Инкубация во влажной камере в течение 20 мин, при 37^oC. Промывание в ФСБ 2-кратное - 20 мин. Нанесение бычьего альбумина меченого родамином, который связывает неспецифические иммуноглобулины и придает розовую (неспецифическую) окраску. Инкубация во влажной камере в течение 20 мин. Промывание в ФСБ 2-кратное - 20 мин. Выявление специфического свечения в режиме люминесцентной микроскопии. Подсчет в мазке окрашенного по Романовскому - Гимзе индекса адгезии (среднее количество прикрепившихся микробных клеток к одной эпителиальной клетке при просмотре 50 эпителиоцитов) и показателя адгезии (% эпителиальных клеток, не пораженных микробом) в световом микроскопе.

Практическая реализация способа не требует дорогостоящего оборудования, сокращает сроки обследования, является простым и доступным методологическим приемом прогнозирования.

Пример. Больная Р., 13 лет, поступила в клинику НИИ детских инфекций на 3 день болезни с диагнозом "Дифтерия зева, локализованная форма". Диагноз подтвержден бактериологически, положительный высев токсигенной C.diphtheriae. В 1 день госпитализации был взят и изучен материал для исследования по вышеизложенной методике, а также сыворотка крови для обнаружения дифтерийного токсина методом латекс-агглютинации (разработанным в НИИДИ). В слайд-препаратах отсутствовало специфическое свечение, ПА=2, а ИА=128. Таким образом, отсутствие Ig A и ПА=2, в остром периоде болезни, интегрально отражающие резистентность слизистой фарингеального эпителия, с одной стороны, и ИА= 128, свидетельствующий о высокой колонизационной активности возбудителя, с другой, давали основание предполагать длительное течение дифтерийной инфекции. После проведенной этиологической и симптоматической терапии больная была выписана через 12 дней с диагнозом "Выздоровление". Однако через две недели она вновь поступила в клинику НИИДИ с диагнозом "Реконвалесцентное бактерионосительство", подтвержденным положительным высевом токсигенной C. diphtheriae. При обследовании: отсутствие специфического свечения, ПА=3, ИА= 112, что свидетельствовало о длительном бактериовыделении. И только после проведения курса соответствующей терапии, к 24 дню, была достигнута полная санация пациентки.

Больной Д. , 2,4 лет поступил в клинику НИИДИ на 2 день болезни с диагнозом "Локализованная форма дифтерии ротоглотки". При исследовании материала по вышеописанной методике было выявлено специфическое свечение, ПА=42, ИА= 86, что говорило о благоприятном течении ДИ. После курса этиотропной и симптоматической терапии через 14 дней ребенок выписан с диагнозом "Выздоровление".

Сводные данные зависимости персистенции токсигенных C.diphtheriae на слизистой фарингеального эпителия от показателей резистентности эпителиоцитов и колонизационной активности возбудителя приведены в таблице 1.

Таким образом, приведенные примеры и сводные данные свидетельствуют о корреляционной зависимости (p<0,7) между показателями, характеризующими резистентность слизистой фарингеального эпителия и колонизационной активностью возбудителя при ДИ у детей, что дает основания для использования разработанного нами методического приема в качестве прогностического критерия течения дифтерийной инфекции.

Формула изобретения

Способ прогнозирования течения дифтерийной инфекции у детей путем определения микробной резистентности слизистой фарингеального эпителия с помощью выявления секреторных иммуноглобулинов класса А на основе реакции иммунофлюоресценции и определения чувствительности эпителиоцитов к адгезии микробных клеток, отличающийся тем, что определение проводят на эпителиоцитах в брашбиоптатах слизистой, предварительно суспензированных в фосфатно-солевом буфере (рН 7,2 - 7,4) с добавлением 0,5 - 0,7 млрд.клеточной суточной культуры Corynebacterium diphtheriae, после выдерживания в термостате при 37^oC в течение 30 мин и промывки смесь наносят на два предметных стекла, затем на одном определяют показатель адгезии - процент резистентных эпителиоцитов к адгезии микроорганизмов и индекс адгезии - среднее количество прикрепившихся микробных клеток к одному эпителиоциту, а на другом выявляют специфическое свечение, свидетельствующее о наличии секреторного иммуноглобулина А, при обнаружении которого, а также показателю адгезии > 10 и индексу адгезии < 50 судят о благоприятном течении и исходе инфекционного процесса.

РИСУНКИ

Рисунок 1