Птг-соединения и способ их получения, содержащая их фармацевтическая композиция, фрагмент днк и слитый белок

 

Изобретение касается вариантов паратироидного гормона (ПТГ), проявляющего сходную с ПТГ активность и содержащее по меньшей мере одну модификацию, выбранную из группы, включающей в себя [Leu⁸, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]чПТГ (1-34)ОН, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]ПТГ (1-34)ОН и другие, указанные в п.1 формулы изобретения. Слитый белок представляет собой N-концевой полипептид, кодируемый геном 55 бактериофага Т4, и присоединенное к его С-концу соединение по п.1, и при необходимости расположенный между ними химически расщепляемый линкер. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество соединения по п.1, регулирует метоболизм кальция. 5 с. и 1 з.п. ф-лы.

Изобретение касается вариантов паратироидного гормона (ПТГ), способа их получения, фармацевтических препаратов, содержащих указанные варианты, а также их использования в качестве фармацевтических средств.

Используемый здесь термин "ПТГ" соответствует любой генетически кодируемой форме паратироидного гормона, включая зрелую форму, содержащую 84 аминокислоты, входящие в состав ПТГ определенных видов позвоночных, в том числе человека, свиньи, крысы, быка, цыпленка, и ее фрагменты, а также их аналоги и производные, проявляющие сходную с ПТГ активность. Положение каждой аминокислоты, входящей в состав последовательности ПТГ, нумеруется в соответствии с международно принятым способом. В целях преемственности, а также для соблюдения традиционных подходов, в нижеследующем описании применяется та же система нумерации аминокислот последовательности ПТГ, вне зависимости от характера производимых в молекуле замен.

Конкретно, настоящее изобретение предусматривает ПТГ-соединение, проявляющее сходную с ПТГ активность и содержащее по меньшей мере одну модификацию, выбранную из группы, включающей в себя [Leu⁸, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]чПТГ(1-34)OH, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]чПТГ(1-34)OH, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]чПТГ(1-34)OH.

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]чПТГ(1-36)ОН, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]чПТГ(1-34)ОН, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]чПТГ(1-36)ОН, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]чПТГ(1-34)ОН, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸]чПТГ(1-36)ОН и [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]чПТГ(1-36)ОН.

Согласно изобретению также предложены фрагмент ДНК, кодирующий слитый белок, имеющий нуклеотидную последовательность, соответствующую N-концевому полипептиду, кодируемому геном 55 бактериофага T4, и присоединенное к его C-концу указанное выше соединение.

Также предложен слитый белок, представляющий собой N-концевой полипептид, кодируемый геном 55 бактериофага T4, и присоединенное к его C-концу соединение, выбранное из указанной выше группы, и при необходимости расположенный между ними химически расщепляемый линкер. Предпочтительно, чтобы этот линкер имел аминокислотную последовательность Asp-Pro-Pro или Asn-Gly-Pro.

Также предложен способ получения соединения, выбранного из указанной выше группы, заключающийся в том, что культивируют рекомбинантный штамм E. coli, трансформированный вектором экспрессии, содержащим описанный выше фрагмент ДНК, выделяют частицы включений, растворяют их в кислотных условиях и расщепляют, отделяют и очищают целевое соединение.

Предложена также фармацевтическая композиция, регулирующая метаболизм кальция, содержащая активный ингредиент и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель, содержащая в качестве активного ингредиента выбранное из указанной выше группы ПТГ-соединение.

Указанная модификация может заключаться в том, что либо 1. по меньшей мере один радикал представляет собой группу, присоединенную к концевой аминогруппе ПТГ-соединения и выбранную из числа следующих: L- или D--аминокислота, C_2-6-алкоксикарбонильная, а также возможно замещенная C_1-8-алкильная, С_2-8-алкенильная, С_2-8-алкинильная, аралкильная, аралкенильная или C_3-6-циклоалкил-C_1-4-алкильная группа; и/или по меньшей мере один радикал представляет собой группу, присоединенную к одной или более боковым аминогруппам ПТГ-соединения и выбранную из числа следующих: С_2-6-алкоксикарбонильная, а также возможно замещенная C_1-8-алкильная, C_2-8-алкенильная, С_2-8-алкинильная, аралкильная, аралкенильная или С_3-6-циклоалкил-C_1-4-алкильная группа, либо
2. по меньшей мере один -аминокислотный остаток в положении 1-38 нативной последовательности ПТГ заменен остатком природной или искусственной аминокислоты, возможно в защищенной форме, причем остатки -аминокислот, находящиеся в положениях 1 и 2 аминоконцевой части последовательности ПТГ, вместе могут быть заменены псевдопептидом,
либо имеет место комбинация указанных модификаций, причем ПТГ-соединение, лишенное L- или D--аминокислоты, присоединенной к N-концу, или С_2-6-алкоксикарбонильной или возможно замещенной С_1-8-алкильной, С_2-8-алкенильной, C_2-8-алкинильной, аралкильной, аралкенильной или С_3-6-циклоалкил-C_1-4-алкильной группы, отличается от ПТГ-соединения, имеющего встречающуюся в природе последовательность -аминокислот; либо ПТГ-соединение отличается от ПТГ (1-34), в котором
I. -аминокислота, находящаяся в положении 1, представляет собой Gly, D-Ser, D-Ala, или Tyr; либо
II. -аминокислота, находящаяся в положении 2, представляет собой Ala, D-Val, Lys, Arg или Cit, а -аминокислота, находящаяся в положении 34, является Tyr; либо -аминокислота, находящаяся в положении 2, представляет собой D-Val, -аминокислота, находящаяся в положении 34, является D-Tyr, а каждая из -аминокислот, находящихся в положениях 8 и 18, возможно представляют собой Nle; либо
III. -аминокислота, находящаяся в положении 3 и/или 6 и/или , 9, заменена на природную или искусственную аминокислоту; либо
IV. -аминокислота, находящаяся в положении 23, заменена на Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, или Thr; либо
V. -аминокислота, находящаяся в положении 25 и/или 26 и/или 27, заменена на Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Туг или Val, либо
VI. каждая из -аминокислот, находящихся в положениях 8 и 18, представляет собой Nle или Met(О), а -аминокислота, находящаяся в положении 34, возможно является Туг; либо каждая из -аминокислот, находящихся в положениях 8 и 18, представляет собой Nle, -аминокислота, находящаяся в положении 34, является Tyr, а также либо -аминокислота, находящаяся в положении 12, представляет собой L- или D-Pro, L- или D-Ala, Aib или NMeGly, либо -аминокислота, находящаяся в положении 23, является Phe, Leu, Nle, Val, Tyr, -Nal или -Nal; либо
VII. -аминокислота, находящаяся в положении 28, является Lys, а -аминокислота, находящаяся в положении 30, представляет собой Leu; либо
VIII. -аминокислота, находящаяся в положении 1, является Aib; и/или -аминокислота, находящаяся в положении 8 и/или 18, представляет собой Leu, Ile, Val, Phe или Trp; и/или -аминокислота, находящаяся в положении 11, является Ser, Lys, Phe, -Nal, Trp или Туг, и/или -аминокислота, находящаяся в положении 12, представляет собой D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser, D-Ser(Butyl), D-Abu, D-Thr, D-Nva, D-Met, D --Nal, D-Trp, D-Lys, D-Tyr, D-Lys (Fmoc), D-Phe или D-Asn; и/или -аминокислота, находящаяся в положении 13, представляет собой Leu и/или -аминокислота, находящаяся в положении 19 и/или в положении 21, является Arg, Lys, Asn или His; и/или -аминокислота, находящаяся в положении 23, представляет собой 2-(1,3-дитиолан-2-ил)Trp; и/или -аминокислота, находящаяся в положении 25 и/или в положении 26, является His; и/или -аминокислота, находящаяся в положении 27, представляет собой Gln или Leu; либо
IX. -аминокислота, находящаяся в положении 8 и/или 18, является Ala или Ser; либо -аминокислота, находящаяся в положении 8 и/или 18, представляет собой Ala, Val, Leu, Ile, Ser или Trp, a -аминокислота, находящаяся в положении 34, является Tyr; либо ПТГ-соединение отличается от ПТГ(1-84) тем, что
I. -аминокислота, находящаяся в положении 1, представляет собой Туг, Val, Pro, Asp или Cys; либо
II. -аминокислота, находящаяся в положении 2, представляет собой Ala, Glu, Leu, Ser или Arg; либо
III. -аминокислоты, находящиеся в положениях 3 и/или 6, и/или 9, заменены на природные или искусственные аминокислоты; либо
IV. -аминокислота, находящаяся в положении 23, заменена на Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser или Thr; либо
V. -аминокислота, находящаяся в положении 25 и/или 26, и/или 27, заменена на Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val; либо
VI. -аминокислота, находящаяся в положении 8, представляет собой Met, Met(O), Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Trp, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, Tyr или Gly, а -аминокислота, находящаяся в положении 18, представляет собой Leu; либо -аминокислота, находящаяся в положении 8 и/или 18, представляет собой Ala, Val, Leu, Ile, Ser или Trp, а -аминокислота, находящаяся в положении 34, возможно представляет собой Tyr; либо каждая из -аминокислот, находящихся в положении 8 и в положении 18, представляет собой Met(O); либо -аминокислота, находящаяся в положении 8, представляет собой Leu, а -аминокислота, находящаяся в положении 18, представляет собой Met(O); либо
VII. -аминокислота, находящаяся в положении 26, представляет собой Gln;
указанное соединение отличается от Pro⁰ ПТГ(1-84) или [Met⁰, Leu⁸, Leu¹⁸] ПТГ (1-84); либо ПТГ-соединение отличается от гПТГ (1-36) тем, что -аминокислота, находящаяся в положении 36, представляет собой Leu;
в свободной форме, в форме соли или в форме комплексного соединения.

В том случае, если последовательность ПТГ является производной от фрагмента ПТГ, она представляет собой фрагмент ПТГ, проявляющий сходную с ПТГ активность и включающий в себя по меньшей мере первые 27 N-концевых аминокислотных остатков ПТГ, в предпочтительном случае - вплоть до 38 N-концевых аминокислотных остатков ПТГ, в том числе от 1-34 до 1-38, например 1-34, 1-36, 1-37 или 1-38 ПТГ, причем по меньшей мере одна из -аминокислот заменена в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, могут быть пропущены один или более аминокислотных остатков, в норме присутствующих в последовательности ПТГ. Предпочтительными являются фрагменты гПТГ, особенно гПТГ(1-34) и гПТГ(1-36).

C-конец ПТГ-соединения может быть представлен группой -COOH, этерифицированной группой COOH, в том числе группой -COOR_a, в которой R_a обозначает низший алкильный радикал, например, C_1-4-алкильный, -CONH₂ либо моно- или дизамещенный амидный радикал, например радикал -CONF_bR_c, в котором одна из групп R_b или R_c представляет собой атом водорода, а другая является алифатическим остатком, например, C_1-6-алкильной группой, или каждая из них обозначает алифатические остатки, или R_b и R_c вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероциклический остаток, например пирролидиновый или пиперидиниловый остаток.

В дальнейшем указанные соединения будут упоминаться как "предусмотренные настоящим изобретением соединения".

Понятие" природные аминокислоты" подразумевает хорошо известные аминокислоты. Их список, а также их стандартные обозначения опубликованы [1]. Именно эти аминокислоты и их обозначения используются в настоящем описании.

Ниже приводится список природных аминокислот:
A Ala аланин
D Asp аспарагиновая кислота
E Glu глутаминовая кислота
F Phe фенилаланин
G Gly глицин
H His гистидин
I Ile изолейцин
K Lys лизин
L Leu лейцин
M Met метионин
N Asn аспарагин
Q Gln глутамин
R Arg аргинин
S Ser серин
T Thr треонин
V Val валин
W Trp триптофан
Y Tyr тирозин
Понятие остаток "искусственной аминокислоты" обозначает остаток генетически некодируемой аминокислоты. К числу искусственных аминокислот принадлежат, например, D-изомеры перечисленных выше природных -аминокислот, Aib (амино-изобутировая кислота), bAib (3-аминоизобутировая кислота), Nva (норвалин), Ala, Aad (2-амино-адипиновая кислота), bAad (3-аминоадипиновая кислота), Abu (2-аминобутировая кислота), Gaba -аминобутировая кислота), Acp (6-аминокапроновая кислота), Dbu (2,4-диаминобутировая кислота), TMSA (триметилсилил-Ala), alle (аллоизолейцин), Nle (норлейцин), трет-Leu, Cit (цитруллин), Orn (орнитин), Dpm (2,2'-диаминопимеловая кислота), Dpr (2,3- диаминопропионовая кислота), - или -Nal, Cha (циклогексил-Ala), гидроксипролин, Sar (саркозин) и т.п., остатки циклических аминокислот, а также остатки N-алкилированных аминокислот, например, MeGly ( N-метил-глицин), EtGly ( N-этил-глицин), EtAsn ( N-этил-аспарагин).

Под аминокислотами, находящимися в защищенной форме, подразумевают природные или искусственные аминокислоты, имеющие, например, боковую цепь, содержащую гетероатом, такой как О, S или N, который может быть защищен О-, S- или N-защитным радикалом. N-конец предусмотренных настоящим изобретением ПТГ-соединений также может находиться в защищенной форме.

К числу N-защитных радикалов, которые могут находиться на N-концевых или боковых аминогруппах аминокислотных остатков, принадлежат радикалы, в том числе перечисленные в [2], например, ацильные радикалы, такие как формильный, ацетильный, трифторацетильный, метоксисукцинильный, гидроксисукцинильный или бензоильный радикал, возможно замещенный по фенильному кольцу, например п-метоксикарбонильной, п-метокси-, п-нитро- или п-фенилсульфонамидокарбонильной группой; алкоксикарбонильный радикал, такой как т-бутилоксикарбонильный, изобутилоксикарбонильный или метоксикарбонильный радикал; аллилоксикарбонильный радикал; тритильный радикал; 2,2,5,7,8-пентаметил-хроман-6-сульфонильный радикал; арилметоксикарбонильный радикал, такой как 9-фторенилметоксикарбонильный или бензилокси карбонильный радикал, возможно замещенный по фенильному кольцу п-метокси-, п-нитро, o- или п-хлорной, м-фенильной или 3,4-диметильной группой; арилметильный радикал, такой как бензильный радикал, возможно замещенный по кольцу п-метокси-, п-нитро- или п-хлорной группой; или арилсульфонильный радикал, такой как фенилсульфонильный радикал, возможно замещенный по кольцу п-метильной или п-метоксигруппой, или нафтилсульфонильный радикал, возможно замещенный по кольцу, например, амино- или ди(C_1-4)-алкил)аминогруппой.

O-защитными радикалами боковых цепей, содержащих атом кислорода, являются, например, радикалы, перечисленные в [3]. В случае алифатических гидроксильных функциональных групп удобными O-защитными радикалами являются, например, радикалы, перечисленные в [4], в том числе бензильная, т-бутильная, метильная группы. Для ароматических гидроксильных функциональных групп удобными O-защитными радикалами являются, например бензильная, т-бутильная, метильная, тозильная и бензилоксикарбонильная группы. В случае карбоксильных функциональных групп, входящих в состав боковых цепей аминокислот, O-защитными радикалами служат хорошо известные эфирные группы, а также группы, например, перечисленные в [5], в том числе метильная, этильная, т-бутильная и бензильная группы. В случае тиольных функциональных групп, входящих в состав боковых цепей аминокислот, S-защитными радикалами являются известные группы, например, перечисленные в [6]. Примерами таких радикалов служат метильная, т-бутильная, бензильная, п-метоксифенилметильная, этиламинокарбонильная и бензилоксикарбонильная группы.

В соответствии с настоящим изобретением, ПТГ-соединения могут нести на своей концевой аминогруппе по меньшей мере один радикал, выбранный из числа следующих: L- или D--аминокислота, C_2-6-aлкoкcикapбoнильнaя, а также возможно замещенная C_1-8-алкильная, C_2-8-алкенильная, C_2-8-алкинильная, аралкильная, аралкенильная или C_3-6-циклоалкил-С_1-4-алкильная группа, и/или содержать на одной или более боковых аминогруппах по меньшей мере один радикал, выбранный из числа следующих: C_2-6-алкоксикарбонильная, а также возможно замещенная C_1-8-алкильная, С_2-8-алкенильная, C_2-8-алкинильная, аралкильная, аралкенильная или C_3-6-циклоалкил-С_1-4-алкильная группа. В том случае, если указанная группа присоединена к боковой аминогруппе, предпочтительным является ее расположение на -аминогруппе остатка лизина. Приемлемыми заместителями алкильного, алкенильного, аралкильного, аралкенильного или циклоалкилалкильного радикала являются гидроксильная и аминогруппа, в то время как заместителем арильной части радикала могут служить также атом галогена и/или С_1-4-алкоксильная группа. Алкильный радикал или алкильная часть радикала могут быть линейными или разветвленными, а также возможно содержащими в своем составе атомы О, S или N. В предпочтительном случае любая С_1-8-алкильная, С_2-8-алкенильная, аралкильная, аралкенильная или С_3-6-циклоалкил-С_1-4-алкильная группа, присоединенная к аминогруппе ПТГ-соединения, является незамещенной. Примерами С_1-8-алкильных групп служат C_1-6-алкильные, предпочтительно метильная, этильная, пропильная, изопропильная, бутильная, изобутильная и т-бутильная группы; примерами С_2-8-алкенильных групп - C_2-4-алкенильные, предпочтительно аллильные группы, примерами С_2-8-алкинильных групп - С_2-4-алкинильные, предпочтительно проп-2-инильные группы, примерами аралкильных групп - фенильная или бензильная группы, примером аралкенильных групп - стирильная группа, примером C_3-6-циклоалкил-C_1-4-алкильных групп - циклогексил-метильная группа. В качестве С_2-6-алкоксикарбонильных групп предпочтительными являются формильная или ацетильная группы. К числу приемлемых D- или L--аминокислот, присоединенных к N-концу, относятся, например, D- или LPro и Ala. В случае наличия заместителя предпочтительными являются алкильная, алкинильная, алкоксикарбонильная группа либо D- или L--аминокислота, присоединенная к N-концу ПТГ-соединения, и/или по меньшей мере одна алкильная или алкоксикарбонильная группа, присоединенная к одной или более боковых аминогрупп.

Предпочтительными ПТГ-соединениями, предусмотренными настоящим изобретением, являются соединения, содержащие по меньшей мере один замененный остаток аминокислоты в одном из следующих положений последовательности ПТГ: 1, 2, 3, 8-11, 13-19, 21, 22, 29-34, особенно в положениях 8-11, 16-19, 33 и/или 34. Более предпочтительными ПТГ-соединениями, предусмотренными настоящим изобретением, являются соединения, содержащие более одного замененного остатка аминокислоты, преимущественно - более двух остатков аминокислот, в особенности - более трех остатков аминокислот, в наилучшем случае - 5-7 замененных остатков аминокислот; в предпочтительном случае заменяют любую комбинацию из вышеперечисленных положений последовательности ПТГ.

В ряду своих специфических или альтернативных воплощений настоящее изобретение предусматривает описанное выше ПТГ-соединение, в котором, в частности, -аминокислоты, находящиеся в положениях 1 и 2 N-конца последовательности ПТГ, заменены на псевдодипептид.

Понятие "псевдодипептид" используется в настоящем описании для обозначения изостерического дипептида, в котором пептидная связь между входящими в его состав аминокислотами, как природными, так и искусственными, замещена на любую изостерическую группу, в том числе -CH₂-NH-, -С(галоген)=CH или -С(алкил)=CH-.

К числу примеров, предусмотренных настоящим изобретением соединений, в которых -аминокислоты, находящиеся в положениях 1 и 2, заменены на псевдодипептид, относятся, например, соединения формулы (I)
X-P₁
в которой X - остаток, описываемый формулой (a)

или (б)

в которых каждый из радикалов Z и Z' независимо друг от друга представляет собой атом водорода, возможно замещенную C_1-8-алкильную, C_2-8-алкенильную, аралкильную, аралкенильную или C_3-6-циклоалкил-C_1-4-алкильную группу или защитную группу, причем не более одной групп из числа Z и Z' являются защитными группами,
Z'' обозначает атом водорода С_1-8-алкильную или защитную группу,
Y и Y' каждый независимо представляет собой возможно защищенную боковую цепь природной или искусственной -аминокислоты,
Y_a или Y_b - один является атомом водорода, а другой - возможно защищенной боковой цепью природной или искусственной -аминокислоты или Y_a и Y_b вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют C_3-6-циклоалкильную группу;
W представляет собой атом галогена или C_1-4-алкильную группу или
W и Y' вместе с группой

к которой они присоединены, образуют возможно замещенный ароматический циклический или гетероциклический остаток;
P₁ обозначает описанную последовательность ПТГ, в которой отсутствуют остатки аминокислот, соответствующие N-концевым положениям 1 и 2,
находящиеся в свободной форме, либо в форме соли или комплексного соединения.

В соединениях, соответствующих формуле (I), P₁ может представлять собой фрагмент (3-z) ПТГ, где z = 84 или целому числу, находящемуся в пределах от 27 до 38, в предпочтительном случае - от 34 до 38, преимущественно 34, 36, 37 или 38, в особенности - 34 или 36. Представленная в виде P₁ последовательность ПТГ может соответствовать либо существующей в природе последовательности ПТГ, либо существующей в природе последовательности ПТГ, в которой по меньшей мере один остаток -аминокислоты, был заменен на природную или искусственную аминокислоту, возможно находящуюся в защищенной форме, и/или один или более остатков -аминокислот также удалены. Кроме того, P₁ может включать в себя по меньшей мере одну боковую аминогруппу, защищенную в соответствии с приведенным выше описанием.

В предпочтительном случае атом галогена представляет собой атом фтора или хлора.

В соединении, соответствующем формуле (а), двойная связь предпочтительно находится в транс-конфигурации (E).

В качестве остатков, присоединенных к -углеродному атому -аминокислоты, радикалы Y, Y', Y_a или Y_b могут представлять собой боковую цепь, входящую в состав перечисленных выше природных -аминокислот, в частности, входящую в состав Gly (например, Н), Ala, Val, Ser, Leu, Ile, Phe, Trp. Кроме того, радикалы Y, Y', Y_a или Y_b могут являться остатками, присоединенными к -углеродному атому вышеупомянутых искусственных -аминокислот, в том числе Nva, Orn, Abu, Aib, Nle. В том случае, если радикалом Y, Y', Y_a или Y_b служит боковая цепь природной или искусственной аминокислоты, содержащая гетероатомы, такие как О, S или N, указанные гетероатомы, входящие в состав боковой цепи, могут быть защищены вышеперечисленными О-, S- или N-защитными группами.

Защитные группы, используемые в качестве радикалов Z или Z' или Z'', могут соответствовать вышеперечисленным.

С_1-8-алкильные группы, используемые в качестве радикалов Z или Z' или Z'', могут соответствовать вышеперечисленным.

В предпочтительном случае Z или Z' представляет собой атом водорода или С_1-4-алкильную группу, преимущественно атом водорода или метильную группу.

В предпочтительном случае Y соответствует атому водорода или CH₃-группе.

В том случае, если W представляет собой С_1-4-алкильную группу, она предпочтительно является CH₃-группой.

В том случае, если радикалы W и Y' вместе с группировкой, к которой они присоединены, образуют возможно замещенный ароматический циклический или гетероциклический остаток, он может представлять собой ароматический 5- или 6-членный остаток, возможно включающий в себя 1 или 2 гетероатома, выбранные из числа N, S и О, например, фенильный, имидазолильный, пиридильный, оксазолильный или тиазолильный остаток. Предпочтительными заместителями являются гидроксильная и метоксигруппа, особенно в случае фенильного кольца.

В предпочтительном случае Y' соответствует атому водорода, метильной, изопропильной или бензильной группе.

В том случае, если Z'' представляет собой C_1-8-алкильную группу, она предпочтительно является CH₃-, С₂H₅- или изопропильной группой.

С_3-6-циклоалкильной группой, совместно образованной радикалами Y_a и Y_b, предпочтительно является циклопропильная или циклопентильная группа.

В том случае, если Z'' представляет собой защитную группу, она предпочтительно является ацильной, в особенности - ацетильной группой.

В ряду своих специфических или альтернативных воплощений настоящее изобретение предусматривает описанное выше ПТГ-соединение, в котором остаток -аминокислоты, находящийся в положении 1, и/или остаток -аминокислоты, находящийся в положении 2 N-конца последовательности ПТГ, заменен на возможно защищенный остаток природной или искусственной аминокислоты, в результате чего в том случае, если ПТГ-соединение лишено L- или D--аминокислоты, присоединенной к N-концу, либо С_2-6-алкоксикарбонильной или возможно замещенной C_1-8-алкильной, C_2-8-алкенильной, C_2-8-алкинильной, аралкильной, аралкенильной или C_3-6-циклоалкил-C_1-4-алкильной группы, оно отличается от ПТГ-соединения, имеющего встречающуюся в природе последовательность -аминокислот; либо ПТГ-соединение отличается от ПТГ(1-34), в котором
I. -аминокислота, находящаяся в положении 1, представляет собой Aib, Gly, D-Ser, D-Ala, или Tyr; либо
II. -аминокислота, находящаяся в положении 2, представляет собой Ala, D-Val, Lys, Cit или Arg, а -аминокислота, находящаяся в положении 34, является Tyr; либо -аминокислота, находящаяся в положении 2, представляет собой D-Val, -аминокислота, находящаяся в положении 34, является D-Tyr, а каждая из -аминокислот, находящихся в положениях 8 и 18, возможно представляют собой Nle; либо
III. -аминокислота, находящаяся в положении 1, является Aib и по меньшей мере еще один остаток -аминокислоты заменен таким образом, что -аминокислота, находящаяся в положении 8 и/или 18, представляет собой Leu, Ile, Val, Phe или Trp, и/или -аминокислота, находящаяся в положении 11, является Ser, Lys, Phe, -Nal, Trp или Tyr, и/или -аминокислота, находящаяся в положении 12, представляет собой D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser, D-Ser(Butyl), D-Abu, D-Thr, D-Nva, D-Met, D--Nal,
D-Trp, D-Lys, D-Tyr, D-Lys (Fmoc), D-Phe или D-Asn; и/или -аминокислота, находящаяся в положении 13, представляет собой Leu, и/или -аминокислота, находящаяся в положении 19 и/или в положении 21, является Arg, Lys, Asn и/или His; и/или -аминокислота, находящаяся в положении 23, представляет собой 2-(1,3-дитиолан-2-ил)Trp; и/или аминокислота, находящаяся в положении 25 и/или в положении 26, является His; и/или -аминокислота, находящаяся в положении 27, представляет собой Gln или Leu; либо ПТГ-соединение отличается от ПТГ(1-84), в котором
I. -аминокислота, находящаяся в положении 1, представляет собой Tyr, Val, Pro, Asp или Cys; либо
II. -аминокислота, находящаяся в положении 2, представляет собой Ala, Glu, Leu, Ser или Arg.

К числу предусмотренных настоящим изобретением соединений, в которых -аминокислоты, находящиеся в положении 1 и/или в положении 2, заменены вышеупомянутым образом, относятся, например, соединения формулы (II)
X_1a-Y_2a-P₂,
в которой X_1a представляет собой остаток возможно защищенной природной -аминокислоты или остаток, соответствующий формуле (IIa)

в которой каждый из радикалов Z_a и Z'_a независимо друг от друга обозначает атом водорода, C_1-6-алкильную или защитную группу, причем не более одного радикала из числа Z_a и Z'_a представляет собой защитную группу, а также
либо n=1, а
I. каждый их радикалов R₁ и R₂ является C_1-6-алкильной группой, либо
II. один из радикалов R₁ или R₂ представляет собой метильную или этильную группу, в то время как другой обозначает возможно защищенный остаток, присоединенный к -углеродному атому природной -аминокислоты, отличающейся от Ala, Leu, Ile или Val, либо
III. один из радикалов R₁ или R₂ является атомом водорода, метильной или этильной группой, в то время как другой представляет собой возможно защищенный остаток, присоединенный к -углеродному атому искусственной -аминокислоты, либо
IV. R₁ и R₂ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют C_3-6-циклоалкильную группу, либо
V. остаток

представляет собой гетероциклический остаток, возможно сконденсированный с бензольным кольцом,
либо n = 2, 3, 4 или 5, а каждый из радикалов R₁ и R₂ обозначает атом водорода или CH₃-группу,
Y_2a представляет собой остаток возможно защищенной природной _аминокислоты или остаток формулы (IIб),

в которой Z_b обозначает атом водорода или С_1-6-алкильную группу, и
либо m = 1, a
I. каждый их радикалов R₃ и R₄ является С_1-6-алкильной группой, либо
II. один из радикалов R₃ или R₄ представляет собой метильную или этильную группу, в то время как другой обозначает возможно защищенный остаток, присоединенный к _углеродному атому природной _аминокислоты, отличающейся от Ala, Leu, Ile или Val, либо
III. один из радикалов R₃ или R₄ является атомом водорода, метильной или этильной группой, в то время как другой представляет собой возможно защищенный остаток, присоединенный к _углеродному атому искусственной _аминокислоты,
либо n = 2, 3, 4 или 5, а каждый из радикалов R₃ и R₄ обозначает атом водорода или CH₃-группу, а P₂ представляет собой вышеописанную последовательность ПТГ, из которой удалены остатки аминокислот, в норме находящиеся в N-концевых положениях 1 и/или 2.

В том случае, если остаток

представляет собой гетероциклический остаток, возможно сконденсированный с бензольным кольцом, он может являться производным насыщенного или ненасыщенного 5- или 6-членного гетероцикла, включающего в себя один или более гетероатомов, выбранных из числа N, О и S. Примерами такого рода гетероциклических остатков являются, в частности, 2-пиридильная, 3-морфолинильная, гексагидропиридазинильная, 2- или 3-индолильная группы.

В том случае, если n или m > 1, группировка CR₁R₂ или CR₃R₄ может представлять собой -CH(CH₃)-CH₂-, пропильную, бутильную или пентильную группу.

С_3-6-циклоалкильная группа, совместно образованная радикалами R₁ и R₂, предпочтительно является циклопропильной или циклопентильной группой.

В качестве остатков, присоединенных к _углеродному атому _аминокислоты, радикалы R₁, R₂, R₃ или R₄ могут представлять собой боковую цепь, входящую в состав перечисленных выше природных _аминокислот, в частности, входящую в состав Gly, Ser или Thr. Один из радикалов R₁ и R₂ или один из радикалов R₃ и R₄ может обозначать метильную или этильную группу, в то время как другой может соответствовать CH₃-, изопропильной, изобутильной, или CH₃-CH₂-CH(CH₃)-группе. Кроме того, радикалы R₁, R₂, R₃ или R₄ могут представлять собой остатки, присоединенные к _углеродному атому вышеперечисленных искусственных _аминокислот, в том числе входящие в состав Abu, Gaba, Nva, Aib, TMSA или Nle. В том случае, если радикалами R₁, R₂, R₃ или R₄ служат боковые цепи природных или искусственных аминокислот, включающие в себя гетероатомы, такие как О, S или N, указанный гетероатом, входящий в состав боковой цепи, может быть защищенным, например, с помощью вышеперечисленных О-, S- или N-защитных групп. Защитная группа, используемая в качестве радикала Z_a или Z'_a, может соответствовать вышеперечисленным. С_1-6-алкильная группа, служащая радикалом Z_b, предпочтительно является метильной или этильной группой. В предпочтительном случае Z_b представляет собой атом водорода. C_1-6-алкильная группа, служащая радикалом Z_a или Z'_a, предпочтительно является линейной или разветвленной C_1-4алкильной группой. В предпочтительном случае один из радикалов Z_a и Z'_a обозначает атом водорода, в то время как другой соответствует атому водорода, C_1-4-алкильной или защитной группе, преимущественно - атому водорода.

В своем еще одном или альтернативном воплощении настоящее изобретение предусматривает также вышеописанное ПТГ-соединение, в котором остаток _аминокислоты, находящийся в положениях 8, и/или остаток _аминокислоты, находящийся в положении 18, заменен на возможно защищенный остаток природной или искусственной аминокислоты таким образом, что в том случае, если ПТГ-соединение лишено L-или D-_аминокислоты, присоединенной к N-концу, либо C_2-6-алкоксикарбонильной или возможно замещенной C_1-8-алкильной, C_2-8-алкенильной, C_2-8-алкинильной, аралкильной, аралкенильной или C_3-6-циклоалкил-C_1-4-алкильной группы, оно отличается от ПТГ-соединения, имеющего встречающуюся в природе последовательность _аминокислот; либо ПТГ-соединение отличается от ПТГ (1-34), в котором
I. каждая из _аминокислот, находящихся в положениях 8 и 18, представляет собой Nle или Met. (O), а _аминокислота, находящаяся в положении 34, возможно является Tyr; либо каждая из _аминокислот, находящихся в положениях 8 и 18 представляет собой Nle, _аминокислота, находящаяся в положении 34, является Tyr, а также либо _аминокислота, находящаяся в положении 12, представляет собой L- или D-Pro, L- или D-Ala, Aib или NMeGly, либо _аминокислота, находящаяся в положении 23, является Phe, Leu, Nle, Val, Tyr, _Nal или -Nal; либо каждая из _аминокислот, находящихся в положениях 8 и 18, представляет собой Nle, _аминокислота, находящаяся в положении 2, является D- Val, а _аминокислота, находящаяся в положении 34, соответствует D-Tyr; либо
II. _аминокислота, находящаяся в положении 8 и/или 18, представляет собой Leu, Ile, Val, Phe или Trp, и по меньшей мере еще один остаток аминокислоты возможно заменен таким образом, что _аминокислота, находящаяся в положении 1, является Aib, и/или _ аминокислота, находящаяся в положении 11, является Ser, Lys, Phe, -Nal, Trp или Tyr, и/или _аминокислота, находящаяся в положении 12, представляет собой D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser, D-Ser(Butyl), D-Abu, D-Thr, D-Nva, D-Met, D--Nal, D-Trp, D-Lys, D-Tyr, D-Lys (Fmoc), D-Phe или D-Asn, и/или _аминокислота, находящаяся в положении 13, является Leu и/или _аминокислота, находящаяся в положении 19 и/или в положении 21, является Arg, Lys, Asn или His, и/или _аминокислота, находящаяся в положении 23, представляет собой 2-(1,3-дитиолан-2-ил)Trp, и/или _аминокислота, находящаяся в положении 25 и/или в положении 26, является His, и/или _аминокислота, находящаяся в положении 27, представляет собой Gln или Leu; либо
III. _аминокислота, находящаяся в положении 8 и/или 18, является Ala или Ser; либо _аминокислота, находящаяся в положении 8 и/или 18, представляет собой Leu, а _аминокислота, находящаяся в положении 34, является Tyr; либо ПТГ-соединение отличается от ПТГ (1-84) тем, что _аминокислота, находящаяся в положении 8, представляет собой Met, Met(O), Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Trp, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, Tyr или Gly, а _аминокислота, находящаяся в положении 18, представляет собой Leu; либо каждая из _ аминокислот, находящихся в положении 8 и в положении 18, представляет собой Met(O); либо _аминокислота, находящаяся в положении 8, представляет собой Leu, а _аминокислота, находящаяся в положении 18, представляет собой Met (О); либо ПТГ-соединение отличается от [Leu¹⁸, Tyr³⁴]гПТГ(1-84), [Leu⁸, Tyr³⁴ ] гПТГ(1-84), [Ile⁸, Leu¹⁸, Tyr³⁴]гПТГ(1-84) или [Leu⁸, Leu¹⁸, Tyr³⁴] гПТГ(1-84).

В том случае если _аминокислота, находящаяся в положении 8, заменена на искусственную аминокислоту, она может представлять собой одну из вышеперечисленных аминокислот, в том числе Nva, Nle или Cha. В предпочтительном случае она является искусственной липофильной аминокислотой, предпочтительно включающей в себя линейный цепочечный алкильный остаток.

Наиболее предпочтительными являются Nva (норвалин) и его гомологи. Искусственная аминокислота, находящаяся в положении 8 последовательности ПТГ, может представлять, собой также с_метилированную или и с_этилированную природную _аминокислоту.

К числу предусмотренных настоящим изобретением ПТГ-соединений, в которых заменен остаток _аминокислоты, находящийся в положении 18, относятся, например, ПТГ-соединения, в которых остаток _аминокислоты, находящийся в положении 18, заменен на остаток нейтральной аминокислоты, такой как Gln, Tyr, или Lys, например [Gln¹⁸] -ПТГ, [Lys¹⁸]-ПТГ и [Tyr¹⁸]-ПТГ, в особенности [Gln¹⁸ или Lys¹⁸ или Tyr¹⁸]-гПТГ-(1-x), где x = 84 или целому числу, находящемуся в интервале от 27 до 38, преимущественно в интервале от 34 до 38. Предпочтительным в положении 18 также является и Ala, особенно в том случае, если последовательность ПТГ представляет собой фрагмент ПТГ (1-36). В таких соединениях аминокислота, находящаяся в положении 8, может являться Met или быть заменена на аминокислоту, выбранную из числа Leu, Ile, Val, Phe, Gln, Trp, Ser и Ala, или может представлять собой остаток искусственной липофильной аминокислоты, например Nva или Nle.

Еще одна группа указанных ПТГ-соединений включает в себя, например ПТГ-соединения, в которых аминокислотный остаток в положении 8 заменен на искусственный липофильный аминокислотный остаток, например Nle или предпочтительно Nva. В этих соединениях аминокислота в положении 18 может быть Met или может быть заменена на аминокислоту, выбранную из группы Leu, Ile, Val, Phe, Trp, Ser, Ala, Gln, Lys или Tyr, предпочтительно Leu, Gln, Ala или Tyr.

Еще одной группой указанных ПТГ-соединений, предусмотренных настоящим изобретением, являются соединения, в которых один или более остатков аминокислот, находящихся в неизмененных положениях, например, 1-7, 9-17 и/или 19-38, либо удалены, либо заменены в дополнение к заменению остатка _аминокислоты, находящегося в положении 8 или 18. В этом случае _аминокислота, находящаяся в положении 8, предпочтительно заменена на Leu, а _аминокислота, находящаяся в положении 18, - на Gln, Leu, Ala или Tyr.

В случае еще одного или альтернативного варианта своего воплощения настоящее изобретение предусматривает вышеперечисленное ПТГ-соединение, в котором по меньшей мере один остаток _аминокислоты, входящий в состав последовательности ПТГ, замещен на остаток _аминокислоты, находящийся в соответствующем положении ПТГрП, таким образом, что в том случае, если ПТГ-соединение лишено L- или D-_аминокислоты, присоединенной к N-концу, либо С_2-6-алкоксикарбонильной или возможно замещенной С_1-8-алкильной, С_2-8-алкенильной, C_2-8-алкинильной, аралкильной, аралкенильной или С_3-6-циклоалкил-С_1-4-алкильной группы, оно отличается от ПТГ-соединения, имеющего встречающуюся в природе последовательность _аминокислот; либо ПТГ-соединение отличается от ПТГ(1-34), в котором
I. _аминокислота, находящаяся в положении 8 и/или 18, представляет собой Leu; и/или _аминокислота, находящаяся в положении 11, представляет собой Lys; и/или _аминокислота, находящаяся в положении 19 и/или 21, представляет собой Arg; и/или _аминокислота, находящаяся в положении 25 и/или 26, представляет собой His; и/или _аминокислота, находящаяся в положении 27, представляет собой Leu; либо
II. _аминокислота, находящаяся в положении 25, представляет собой Gln, и/или _аминокислота, находящаяся в положении 26, соответствует Asn, в то время как _аминокислота, находящаяся в положении 27, возможно представляет собой Leu; либо ПТГ-соединение отличается от [Leu⁸, Leu¹⁸]ПТГ(1-84).

Понятие "ПТГрП" обозначает любую генетически кодируемую форму ПТГрП, в том числе ПТГрП человека, цыпленка, крысы или мыши. В целях преемственности, а также для соблюдения традиционных подходов, в нижеследующем описании та же система нумерации аминокислот применяется по отношению к последовательности ПТГрП, начинающейся с Ala, находящегося в положении 1, и включая, например, Ala, находящийся в положении 38.

Указанная группа соединений, предусмотренных настоящим изобретением, представляет собой гибриды между ПТГ и гомологичными последовательностями ПТГ-рП (обозначаемые в настоящем описании гибридными молекулами ПТГрП). Последовательность аминокислот, в которой происходит предусмотренная настоящим изобретением замена, находится в пределах от положения 1 до положения 38, преимущественно на участке 1-36, в особенности - 1-34.

В предпочтительном случае предусмотренные настоящим изобретением ПТГ-соединения представляют собой гибридные молекулы ПТГ-рП, в которых более одного остатка _аминокислот, входящих в состав последовательности ПТГ, например, по меньшей мере 2, предпочтительно 3-5 остатков _аминокислот, заменены в соответствии с настоящим изобретением.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительная группа гибридных молекул ПТГ-рП включает в себя ПТГ-соединения, в которых по меньшей мере один остаток _аминокислоты, находящийся в положениях 8-11 _аминокислотной последовательности ПТГ, т.е. Met⁸, His⁹, Asn¹⁰ или Leu¹¹, заменен на соответствующий остаток аминокислоты, входящий в состав соответствующей последовательности ПТГ-рП, т. е. на Leu⁸, His⁹, Asp¹⁰ или Lys¹¹. Предпочтительным является заменение в положениях 8 и/или 10, особенно в положениях 8 и 10. В более предпочтительном случае _аминокислоты, находящиеся в положениях 8, 10 и 11 указанной последовательности ПТГ, заменяют на Leu⁸, Asp¹⁰ и Lys¹¹, соответственно.

Еще одна предпочтительная группа гибридных молекул ПТГ-рП, предусмотренных настоящим изобретением, включает в себя ПТГ-соединения, в которых по меньшей мере один остаток _аминокислоты, находящийся в положениях 16-19 (_ аминокислотной последовательности ПТГ, заменен на соответствующий остаток _аминокислоты, входящий в состав соответствующей последовательности ПТГ-рП, т.е. на Gln¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹. В предпочтительном случае заменяют 3 или все 4 _аминокислоты из указанной последовательности. Наиболее предпочтительными являются предусмотренные настоящим изобретением ПТГ-соединения, в которых _аминокислота, находящаяся в положении 16, представляет собой Gln, _аминокислота, находящаяся в положении 18, представляет собой Leu, а _аминокислота, находящаяся в положении 19, соответствует Arg.

Еще одна предпочтительная группа гибридных молекул ПТГ-рП, предусмотренных настоящим изобретением, включает в себя ПТГ-соединения, в которых по меньшей мере один остаток -аминокислоты, находящийся в положениях 33-34 -аминокислотной последовательности ПТГ, заменен на соответствующий остаток -аминокислоты, входящий в состав соответствующей последовательности ПТГ-рП, т.е. на Thr³³, Ala³⁴. В предпочтительном случае заменяют обе -аминокислоты.

Еще одной предпочтительной группой гибридных молекул ПТГ-рП, предусмотренных настоящим изобретением, являются ПТГ-соединения, включающие в себя любую комбинацию вышеупомянутых замен аминокислот (8-11, 16-19, 33-34), в наиболее предпочтительном случае - комбинацию замен, выбранных из числа вышеперечисленных замен последовательностей 8-11 и 33-34.

При желании повысить ценность производимых замен по меньшей мере еще одну -аминокислоту, находящуюся в предусмотренных настоящим изобретением гибридных молекулах ПТГ-рП в положениях 1- 38, можно в соответствии с приведенным выше описанием заменить на остаток природной или искусственной аминокислоты или удалить. В положении 10 может находиться -аминокислота, выбранная из числа Gly, Gln, Glu, His, Ser, Thr или Tyr. В положении 13 может находиться D- или L--аминокислота, отличающаяся от Arg, например Ala, Cys, Gln, Ile, Asn, Trp, Asp, Val, Ser, Thr, Tyr, Met, Leu или Gly: в положении 16 может находиться D- или L--аминокислота, например, Lys, Ser, Leu, Ala, Gln или Gly; в положении 17 - Ala или Ser, либо предпочтительно аминокислота, боковая цепь которой больше, чем у Ala или Ser, например, Glu, Gln, Phe, His, Ile или Lys: в положении 18 - Gln или Tyr; в положении 19 - Ala, Arg, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn или Ile: в положении 26 - Gln или Arg; и/или в положении 33 - D- или L--аминокислота, например, Ser, Thr, Leu, Gly, Gln, Arg, Pro, Asp, Ile, Lys или Thr. Кроме того, гибридные молекулы ПТГ-рП могут быть замещены по их N-концу или по боковой аминогруппе в соответствии с приведенным выше описанием. При желании боковые цепи предусмотренных настоящим изобретением гибридных молекул ПТГ-рП, содержащие атомы S или О, могут быть также защищены в соответствии с приведенным выше описанием.

К числу примеров предпочтительных гибридных молекул ПТГ-рП, предусмотренных настоящим изобретением, относятся [Leu⁸, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]-ПТГ, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]-ПТГ, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴] -ПТГ, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸]-ПТГ, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹] -ПТГ, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]-ПТГ, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹] -ПТГ, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]-ПТГ и [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]-ПТГ.

Предпочтительными гибридными молекулами ПТГ-рП, предусмотренными настоящим изобретением, являются соединения ПТГ(1-x'), где x' равен целому числу от 34 до 38, преимущественно 34, 36, 37 или 38, в особенности гПТГ(1-x'), в которых одна или более - аминокислот заменены на -аминокислоты, находящиеся в соответствующих положениях в молекулах ПТГ-рП, предпочтительно в в соответствии с приведенным выше описанием. В том случае, если в положениях 33 и 34 проведены замены на соответствующую последовательность -аминокислот из ПТГ-рП, указанное ПТГ-соединение предпочтительно представляет собой фрагмент ПТГ, включающий в себя 34 остатка -аминокислот. Предпочтительными являются гибридные молекулы ПТГ-рП, содержащие C-конец.

Предпочтительным ПТГ-рП является гПТГ-рП.

Предусмотренные настоящим изобретением соединения могут находиться, например, в свободной форме, в форме солей или в форме их комплексных соединений. Соли, образующиеся в результате добавления кислот, могут быть получены с использованием, например органических кислот, полимерных кислот, а также неорганических кислот. Указанные формы солей, образующихся в результате добавления кислот, включают в себя, например, гидрохлориды и ацетаты. Комплексные соединения образуются из соединений, предусмотренных настоящим изобретением, при добавлении неорганических веществ, например неорганических солей или гидроксидов, таких как соли Ca и Zn, и/или при добавлении полимерных органических веществ.

Настоящее изобретение предусматривает также способ получения соединений, предусмотренных настоящим изобретением. Указанные соединения могут быть получены поэтапно или в растворе, или с использованием способа твердофазного синтеза, или с помощью генной инженерии.

Предусмотренные настоящим изобретением соединения могут быть получены, например, следующим образом:
а) удаляют по меньшей мере одну защитную группу, присутствующую в предусмотренном настоящим изобретением соединении, находящемся в защищенной форме; либо
б) соединяют амидной связью два пептидных фрагмента, причем указанные пептидные фрагменты таковы, что при этом получают желаемую аминокислотную последовательность желаемого соединения, после чего возможно осуществляют этап а) настоящего способа; либо
в) для получения ПТГ-соединения, в котором остатки -аминокислот, соответствующие аминоконцевым положениям 1 и 2, заменены на псевдодипептид, находящийся в защищенной или незащищенной форме псевдодипептид приводят во взаимодействие с ПТГ-пептидом, находящимся в защищенной или незащищенной форме, у которого удалены остатки аминокислот, соответствующие положениям 1 и 2, и при необходимости осуществляют этап а); либо
г) для получения ПТГ-соединения, содержащего по меньшей мере один радикал, выбранный из числа следующих: L- или D--аминокислота, присоединенная к N-концу, C_2-6-алкоксикарбонильная, а также возможно замещенная C_1-8-алкильная, C_2-8-алкенильная, C_2-8-алкинильная, аралкильная, аралкенильная или C_3-6-циклоалкил-C_1-4-алкильная группа, присоединенная к концевой аминогруппе и/или к боковой аминогруппе, вводят указанный радикал в молекулу ПТГ-соединения, находящегося в защищенной или незащищенной форме и не содержащего указанный радикал, и при необходимости осуществляют этап а);
и выделяют полученное таким образом соединение в свободной форме, в форме соли или в форме комплексного соединения.

Этапы а), б) и в) настоящего способа могут быть осуществлены по аналогии с хорошо известными способами, например, известными в области химии пептидов или перечисленными в последующих примерах. Для защиты в указанных реакциях функциональных групп, не принимающих участия в этих реакциях, при желании могут быть применены защитные группы, удобные для использования в пептидах. Понятие "защитная группа" может также включать в себя полимерную смолу, имеющую в своем составе функциональные группы.

На этапе б) для получения ПТГ-соединения, в котором остатки -аминокислот, соответствующие аминоконцевым положениям 1 и 2, заменены на псевдодипептид, один пептидный фрагмент, используемый в качестве исходного вещества, может содержать псевдодипептид на своем N-конце. Указанное исходное вещество может быть получено в соответствии с этапом в).

На этапе в) псевдодипептидом, используемым в качестве исходного вещества, может служить соединение, соответствующее формуле (IIаа) или (IIбб)
ZZ'N - CHY - CW = CH - CHY' - COOH (IIаа)
ZZ'N - CY_aY_b - CH₂ - NZ" - CHY' - COOH (IIбб)
или их функциональное производное, например эфир, галогенангидрид либо симметричный или асимметричный ангидрид.

Соединения, соответствующие формуле IIаа, в которой W и Y' вместе с группировкой -C=CH-CH-, к которой они присоединены, образуют возможно замещенный ароматический циклический или гетероциклический остаток, a также соединения, соответствующие формуле (IIбб), в которой Z'' представляет собой алкил или защитную группу, например ацетильную группу, или радикал -CY_aY_b обозначает C_3-6-циклоалкильную группу, а Z'' соответствует атому водорода, являются новыми и представляют собой часть настоящего изобретения.

Этап г) настоящего способа может быть осуществлен по аналогии с известными способами, например, с помощью методов алкилирования. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения алкилирование проводят в условиях восстановления, в том числе с использованием соответствующего альдегида или кетона. Реакцию можно проводить, например, в присутствии NaBH₃CN, предпочтительно в кислом pH, в частности при pH в пределах от 5 до 7. Температура реакции может быть например от -20^oC до 100^oC. Может оказаться предпочтительным осуществлять указанную реакцию в инертном растворителе, например, в воде, спирте, диоксане или ДМФ, либо в их смеси. С помощью известного способа можно также присоединить D- или L--аминокислоту к N-концу молекулы.

Фрагмент пептида, используемый в качестве исходного вещества на этапе б) настоящего способа, может включать в себя один или более остатков искусственных аминокислот; кроме того, он может быть замещен по своей N-концевой и/или по боковой аминогруппе радикалом, выбранным из числа следующих: C_2-6-алкоксикарбонильная, возможно замещенная C_1-8-алкильная, C_2-8-алкенильная, C_2-8-алкинильная, аралкильная, аралкенильная или C_3-6-циклоалкил-C_1-4-алкильная группа, либо может нести на своем N-конце L- или D--аминокислоту.

Предусмотренные настоящим изобретением соединения или их фрагменты, содержащие остатки природных -аминокислот, могут быть также получены с помощью техники рекомбинантной ДНК.

В соответствии с предпочтительным вариантом своей реализации настоящее изобретение предусматривает также способ получения среднеразмерных полипептидов, при котором составной белок, состоящий из слитых N-концевого полипептида, кодируемого геном 55 бактериофага T4, и присоединенного к его C-концу желаемого полипептида, экспрессируется в клетках бактерий.

Полипептид, кодируемый геном 55, может включать в себя полный белок gp55 бактериофага T4 (188 остатков аминокислот) [7]. В альтернативном случае может быть использован фрагмент, предпочтительно N-концевой фрагмент, белка gp55. В частности, может быть использован фрагмент белка gp55, состоящий из первых 112 N-концевых остатков аминокислот указанного белка. Однако, обычно полипептид, кодируемый геном 55, включает в себя по меньшей мере первые 25 N-концевых остатков аминокислот белка gp55.

Среднеразмерный белок может иметь в длину от приблизительно 20 до 100, например 150, предпочтительно от приблизительно 20 до приблизительно 50 аминокислот. Примерами среднеразмерных белков служат кальцитонины, эндорфины, пептиды, ингибирующие ферменты желудочного сока, глюкагон, нейропептид Y, фактор выделения гормона роста (GHRF), фрагменты амилоидного -протеина, гирудин, инсулин, соматостатин, фактор роста эпидермальных клеток, фактор роста нервных клеток и ПТГ, либо их фрагменты. Особенно предпочтительными среднеразмерными полипептидами, которые могут быть получены в соответствии со способом, предусмотренным настоящим изобретением, являются предусмотренные настоящим изобретением соединения или их фрагменты, содержащие замены с участием природных аминокислот.

Кроме того, составной белок, кодируемый слитыми генами 55-ПТГ, обычно содержит между полипептидом, кодируемым геном 55, и желаемым полипептидом расщепляемый линкерный участок. В предпочтительном случае расщепляемый линкерный участок способен подвергаться химическому расщеплению, а в более предпочтительном случае состоит из последовательности аминокислот Asp-Pro-Pro или Asn-Gly-Pro.

В качестве еще одного своего аспекта настоящее изобретение предусматривает нуклеотидную последовательность, кодирующую составной белок, состоящий из N-концевого полипептида гена 55 бактериофага T4 и присоединенного к его C-концу желаемого среднеразмерного полипептида.

В предпочтительном случае нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность ДНК, пригодную для экспрессии в бактериях. Указанная последовательность обычно содержит нуклеотиды, кодирующие расщепляемый линкерный участок, расположенный между последовательностями, кодирующими ген 55 и желаемый полипептид.

Настоящее изобретение предусматривает также вектор бактериальной экспрессии, включающий в себя последовательность ДНК, кодирующую указанный составной белок.

Наряду с последовательностью, кодирующей указанный составной белок, вектор экспрессии обычно содержит необходимые контролирующие экспрессию последовательности, включая приемлемый промотор, оператор и сайт связывания рибосом, а также иные необходимые регуляторные последовательности. Кроме того, вектор экспрессии обычно содержит один или более селективных маркеров.

Может быть использован любой приемлемый промотор, такой как TrpE, P1, Pr, lac или Tac промотор. В предпочтительном случае промотор представляет собой промотор бактериофага T7, а вектор экспрессии является плазмидой. Для экспрессии в E. coli может быть использован вектор, сконструированный на основе плазмид R1 или Col-E1. В частности, может быть использован вектор экспрессии pET 17B, который можно получить в Novagen, или сходные с ним векторы экспрессии.

В качестве еще одного своего аспекта настоящее изобретение предусматривает бактериальные хозяйские клетки, трансформированные последовательностью, кодирующей составной белок, или вышеописанным вектором экспрессии. Могут быть использованы любые приемлемые бактериальные хозяйские клетки, при этом предпочтительным хозяином является E.coli. В частности, может быть использован штамм E.coli BL21 (DE3) Lys E, а также сходные с ним штаммы.

Указанный составной белок накапливается в хозяйских клетках преимущественно в форме частиц, представляющих собой нерастворимые включения, что облегчает выделение указанного составного белка из клеток. Для того чтобы выделить желаемый полипептидный продукт из составного белка, растворяют белок, входящий в состав указанных частиц включений, и отщепляют желаемый полипептидный продукт от составного белка. Может быть использована любая приемлемая процедура растворения, включая обработку кислотой, например, при pH приблизительно 2-4, предпочтительно кислотой при pH приблизительно 2,5; либо обработка денатурирующим агентом, например мягким денатурирующим агентом, таким как гуанидин гидрохлорид. Кроме того, может оказаться необходимым удалить один или более нежелательных N-концевых остатков аминокислот из остающегося после расщепления продукта.

Таким образом, в качестве еще одного своего аспекта настоящее изобретение предусматривает способ получения желаемого среднеразмерного полипептида в бактериальных хозяйских клетках, заключающийся в том, что бактериальные хозяйские клетки, трансформированные в соответствии с приведенным выше описанием, стимулируют к экспрессии составного белка в форме частиц включений; выделяют указанные частицы включений; растворяют указанные частицы включений и отщепляют желаемый полипептид от указанного составного белка.

В случае некоторых среднеразмерных полипептидов, таких как ПТГ-соединения, для того, чтобы получить ПТГ-соединения, находящиеся в активной форме, т.е. проявляющие сходную с ПТГ активность, обычно не требуется осуществлять строго контролируемые процессы денатурации и ренатурации. Продукты среднеразмерных полипептидов могут быть получены в активной форме просто путем нейтрализации кислой среды, использованной для растворения. Растворение и расщепление составного белка могут быть осуществлены в один этап.

Настоящее изобретение предусматривает также составной белок, включающий в себя N-концевой полипептид, кодируемый геном 55 бактериофага T4, а также присоединенный, к его C-концу желаемый среднеразмерный полипептид.

На основе использования предусмотренных настоящим изобретением способов и векторов было показано, что возможно получать большие количества среднеразмерных полипептидов, в частности продуктов ПТГ. Мы обнаружили, что вплоть до 50% всех белков, экспрессирующихся в Е.coli, представляют собой желаемый составной белок. Кроме того, указанный составной белок образует частицы включений, которые легко отделять от других веществ хозяйских клеток. Более того, указанные частицы включений часто состоят по меньшей мере приблизительно на 90% из желаемого составного белка, что существенно снижает объемы необходимой очистки. Далее экспрессия продукта ПТГ в форме составного белка может значительно уменьшать эндогенный процессинг указанного полипептида в бактериальных клетках, что способствует выделению гомогенных продуктов.

В предпочтительном случае расщепляемый линкерный участок состоит из химически расщепляемых аминокислот, присоединенных к N-концу желаемого полипептида, что обеспечивает возможность отщепления желаемого полипептида от указанного составного белка с помощью простых химических способов. В предпочтительном случае желаемый полипептид не содержит указанных химически расщепляемых групп.

Предпочтительные химически расщепляемые линкерные участки содержат аминокислоты Asp-Pro-Pro или Asn-Gly-Pro. Связи Asp-Pro или Asn-Gly могут быть химически расщеплены в условиях кислой среды, например, под действием муравьиной кислоты (обычно pH приблизительно 2,5) или гидроксиламина соответственно. Дипептиды Pro-Pro или Gly-Pro, остающиеся на N-конце желаемого полипептида, могут быть в дальнейшем удалены с помощью приемлемой дипептид-пептидазы. В частности, может быть использована X-Pro дипептид-пептидаза ЕС 3.4.14.5 L.lactis [8].

После отщепления от составного белка желаемый полипептид может быть очищен. Может быть использован метод очистки с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC). Очистка может быть осуществлена до удаления каких-либо нежелательных N-концевых остатков аминокислот.

Предусмотренный настоящим изобретением способ иллюстрируется в дальнейшем в примерах 306-312, ссылающихся на последовательности, приведенные в прилагаемом Перечне Последовательностей, в котором Последовательность N 1 представляет аминокислотную последовательность и соответствующую последовательность ДНК укороченного составного белка gp55-Asp-Pro-Pro-гПТГ(1-38)OH, клонированного в плазмиде рЕТ17В, а Последовательность N 3 показывает последовательность аминокислот и соответствующую последовательность ДНК полноразмерного белка gp55-Asp-Pro-ProгПТГ(1-38)ОН, клонированного в плазмиде рЕТ17В.

В приведенных ниже примерах все температуры даны в ^oC. Использованы следующие сокращения:
Boc = трет-бутилоксикарбонил
ДМФ = диметилформамид
ДХМ = дихлорметан
Fmoc = 9-фторенилметоксикарбонил
HOBt = 1-гидроксибензотриазол
ТФУ = трифторуксусная кислота
Trt = тритил = трифенилметил
RP-HPLC = обратнофазная высокоразрешающая жидкостная хроматография
к.т. = комнатная температура
DNP = динитрофенил
Tos = тозил
DIPC = диизопропилкарбодиимид
Pmc = 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил
IP = изопропил
For = формил
Cpe = 1-амино-циклопентан-1-карбоксильная кислота
Cpp = 1-амино-циклопропан-1-карбоксильная кислота
Cha = циклогексилаланин
tBu = трет-бутил
Последовательность N 11 представляет последовательность аминокислот гПТГ(1-34); Последовательность N 12 представляет последовательность аминокислот гПТГ(1-36); Последовательность N 13 - последовательность аминокислот гПТГ(1-38). Примеры 1, 2, 5, 6, 11, 20-24, 27-30, 36, 37, 40, 41, 47, 49, 51, 53, 54, 57, 58, 61, 76-80, 82, 179, 185, 187, 191-193, 226, 230, 237, 239, 256 и 289 основаны на последовательности N 11, замененные остатки аминокислот и их положения приведены в квадратных скобках. Примеры 12, 13, 18, 19, 31-35, 38, 39, 42-46, 48, 50, 52, 55, 59, 60, 62-71, 81, 83-85, 165-178, 180-184, 186, 188-190, 194-225, 227- 229, 231-236, 238, 240-255, 257-266, 268- 279, 282-288, 290- 300 и 302-304 основаны на последовательности N 12, замененные остатки аминокислот и их положения приведены в квадратных скобках. Примеры 3, 4, 7-10, 14-17, 25, 26, 56, 72-75, 81, 86-164, 267, 280 и 281 основаны на последовательности N 13, замененные остатки аминокислот и их положения представлены в квадратных скобках.

Пример 1. N-Изопропил гПТГ(1-34) NH₂.

Указанный пептид синтезируют поэтапным способом с помощью смолы на полистироловой основе. Для защиты альфа-аминогруппы используют Boc-группу, а боковые функциональные группы защищают следующим образом: Lys(2-хлорбензилоксикарбонил), Ser(бензил), Thr(бензил), Glu(бензил), Asp(бензил), Met(O), His(DNP), Arg(Tos) и Trp(HCO). Остальные остатки оставляют незащищенными.

Амино-4-метилфенил-метил-ко(полистирол-дивинилбензол= MBHA-смола) (0,7 мМ/г) подвергают следующему циклу обработок, этапы (1)-(7):
(1) ДХМ
(2) 50%-ная трифторуксусная кислота в ДХМ
(3) ДХМ
(4) 10%-ный диизопропилэтиламин в ДМФ
(5) ДМФ
(6) заранее полученный симметричный ангидрид (1,4 мМ на 1 г исходной смолы) Boc-аминокислоты в ДМФ
(7) ДМФ
Объемы промывающих агентов и взаимодействующих веществ составляют от 5 до 20 мл на 1 г исходной смолы. Каждый этап повторяют столько раз, сколько необходимо либо для полного вступления в реакцию указанной смолы (этапы 2, 4, 6), либо для полного удаления предыдущего реагента из указанной смолы (этапы 1, 3, 5, 7). По окончании каждого цикла отбирают образцы смолы и проверяют завершенность реакции присоединения с помощью колориметрического теста на оставшиеся аминогруппы с использованием нингидрина.

Симметричные ангидриды Boc-аминокислот приготавливают непосредственно перед использованием, приводя во взаимодействие Boc-аминокислоту (2,8 мМ на 1 г смолы) и DCCI (1,4 мМ на 1 г смолы) в ДХМ, содержащем ДМФ в количествах, достаточных для полного растворения Boc-аминокислоты. Полученную смесь фильтруют, добавляют дополнительное количество ДМФ к фильтрату, который концентрируют с помощью выпаривания летучих компонентов при температуре, не превышающей 15^oC, а полученный при этом раствор используют на этапе (6).

Указанный цикл реакций (1)-(7) повторяют для каждого остатка аминокислоты, обеспечивая тем самым синтез последовательности поименованного соединения за исключением Boc-Gln-OH и Boc-Arg(Tos)-OH, которые присоединяют на этапе (6) в виде их заранее приготовленных 1-гидроксибензо-триазольных эфиров в ДМФ.

Смолу с полностью синтезированным пептидом дважды обрабатывают 20 мл 5%-ного тиофенола в ДМФ при к.т. в течение 1 часа и промывают ДМФ, метанолом и дихлорметаном. Пептидную смолу вновь подвергают этапам (1)-(5), после чего добавляют 0,5 мл ацетона, 84 мг цианоборогидрида натрия и 0,2 мл уксусной кислоты в 20 мл ДМФ на 1 г смолы. После выдерживания в течение 16 часов при к.т. указанную смолу промывают ДМФ и дихлорметаном и высушивают.

Пептидную смолу обрабатывают жидким HF, диметил сульфидом, п-крезолом и этан-1,2-дитиолом в соответствии с описанной "low-high" процедурой [9]. После удаления летучих компонентов и промывания этилацетатом полученный остаток экстрагируют несколькими порциями 1%-ной уксусной кислоты, фильтруют, а полученный фильтрат подвергают лиофилизации. Полученный лиофилизированный продукт очищают с использованием повторной обратнофазной хроматографии на колонке октадецил-силикагеля с использованием градиента ацетонитрила в 2%-ной фосфорной кислоте или в 20 мМ тетраметиламмоний фосфате. Соединяют фракции, содержащие чистое соединение, фильтруют через слабо-основную ионообменную смолу в форме ацетата, а полученный фильтрат подвергают лиофилизации с получением вышепоименованного соединения.

MS (Ion Spray): 4160.

Пример 2. [Lys ( N-Изопропил)^26,27] гПТГ (1-34) NH₂.

Синтезируют пептид так, как это описано в примере 1, за исключением того, что используют Lys(Fmoc) для включения в положение 13, а также Fmoc-Ser(tBu) в концевом положении 1.

Смолу с полностью синтезированным пептидом дважды обрабатывают 20 мл 5%-ного тиофенола в ДМФ при к.т. в течение 1 часа и промывают ДМФ. метанолом и дихлорметаном. Сухую смолу обрабатывают жидким HF, как это описано в примере 1. Полученный при этом продукт расщепления (350 мг) суспендируют в смеси метанола (5 мл), фосфатного буфера pH 5,0 (5 мл), цианоборогидрида натрия (48 мг) и ацетона (0.28 мл). После выдерживания в течение 16 часов при к. т. полученную реакционную смесь фильтруют, а фильтрат выпаривают. Остаток суспендируют в 20%-ном пиперидине в ДМФ в течение 15 минут, разбавляют 20 объемами эфира и фильтруют. Полученный остаток растворяют в 100 мл воды и добавляют уксусную кислоту до pH 3, фильтруют и подвергают полученный фильтрат лиофилизации. Очищают лиофилизат с помощью обратнофазной хроматографии на колонке октадецил-силикагеля с использованием градиента ацетонитрила в 2%-ной фосфорной кислоте. Объединяют фракции, содержащие чистое соединение. Фильтруют их через слабо-основную ионообменную смолу в форме ацетата, а фильтрат подвергают лиофилизации с получением вышепоименованного соединения.

MS (IS): 4205.6.

Пример 3. N-Изопропил [Lys N-изопропил)^13,26,27] гПТГ(1-38)OH
а) Твердофазный пептидный синтез.

Синтезируют указанный пептид поэтапным способом с помощью основанной на полистироле смолы. Альфа-аминогруппу защищают радикалом Fmoc, а боковые функциональные группы защищают следующим образом: Asp(OtBu), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Asn(Trt), Gln(Trt), Arg(Pmc) и Ser(tBu). Остальные аминокислоты оставляют незащищенными.

Fmoc-Gly, присоединенный эфирной связью к 4-гидроксиметил-феноксиметил-ко(полистирол-1%-дивинилбензолу) (0,5 мМ/г), используют в качестве исходного вещества для поэтапного твердофазного синтеза, состоящего из повторяющихся циклов снятия защиты с альфа-аминогруппы, отмывки, наращивания (присоединения новой аминокислоты) и отмывки. Осуществляют присоединение трех-пятикратного избытка Fmoc-аминокислот в виде заранее приготовленных HOBt-эфиров с использованием DIPC. Fmoc-Arg(Pmc), Fmoc-Asn(Trt) и Fmoc-Gln(Trt) присоединяют в виде асимметричных ангидридов с использованием DIPC. По завершении синтеза указанной пептидной цепи Fmoc-защитную группу, находящуюся на Ser¹, удаляют с помощью 20%-ного пиперидина в ДМФ. Отщепление указанного пептида от полистирольной смолы, а также удаление всех боковых защитных групп осуществляют путем обработки указанной пептидной смолы смесью 10%-ного этандитиола, тиоанизола, тиокрезола и воды в 90%-ной ТФУ в течение трех часов при комнатной температуре. Из объединенных фильтратов осаждают продукт посредством добавления эфира, отфильтровывают и высушивают. Полученный продукт очищают с помощью хроматографии на C-18 силикагельной колонке с использованием градиента ацетонитрила в 2%-ной H₃PO₄ в воде. Объединяют фракции, содержащие чистое вещество, фильтруют через анион-обменную смолу (Biorad, AG 4-X4, ацетатная форма сита 100-200) и подвергают лиофилизации с получением гПТГ-(1-38)-ОН.

б) Алкилирование.

40 мг (9 мкМ) гПТГ-(1-38)-ОН (4458,2 г/М) растворяют в 1,2 мл метанола, 1,2 мл фосфатного буфера (Merck no. 9887, доведенный до pH 5,0), 45 мг (716 мМ) NaBH₃CN (62,84 г/М) и 0,8 мл (11 мМ) ацетона (72,52 мл/М). Реакцию контролируют с помощью RP-HPLC на C-18 силикагельной колонке и останавливают через 15 часов при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь разбавляют водой и подвергают хроматографированию на С-18 силикагельной колонке с использованием градиента ацетонитрила в 2%-ной H₃PO₄ в воде. Объединяют фракции, содержащие чистое соединение, фильтруют через анионообменную смолу (ацетатную форму) и подвергают лиофилизации с получением вышепоименованного соединения в виде полиацетата, полигидрата.

[]²_D⁰ = -5,7^o (с = 0,317 в 95%-ном AcOH)
MS (IS): 4626
Пример 4. N-Метил [Ala¹]ПТГ-(1-38)-ОН.

Пептидную цепь синтезируют таким же способом, как это описано в примере 3а. В положении 1 вместо Fmoc-Ser(tBu)-OH к пептидной смоле присоединяют искусственную аминокислоту Fmoc-N-метил-Ala-OH. Расщепление, снятие защиты и очистку осуществляют так же, как в примере 3а.

MS (IS) = 4455,91
Пример 5. [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Phe²³, His²⁵, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)ОН.

Указанный пептид получают по аналогии со способом, описанным в примере 3а. Вместо Fmoc-Gly, присоединенного эфирной связью к 4-гидроксиметил-феноксиметил-ко(полистирол-дивинилбензолу), используют подходящую Fmoc-аминокислоту, например, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe, Fmoc-D-Ala, Fmoc-D-Phe и т.д. В дополнение к этому боковые функциональные группы защищают следующим образом: Thr(tBu), Trp(Boc) и Tyr(tBu).

Воспроизводя способ, описанный в примерах 3 и 5, но используя при этом соответствующие исходные вещества, можно получить следующие соединения:
Пример
6: [Leu⁸, Asp¹⁰, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³]гПТГ(1-34)ОН
7: [Ile¹]гПТГ(1-38)OH (IS-MS: 4484)
8: [Ala¹, Abu²]гПТГ(1-38)OH (IS-MS: 4428)
9: [Ala¹, Nva²]гПТГ(1-38)OH (IS-MS: 4442)
10: [Ala¹, Ile²]гПТГ(1-38)OH (IS-MS: 4456)
11: [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH
12: [N-MeAla¹]гПТГ(1-36)OH (IS-MS: 4286)
13: [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gln¹⁸]гПТГ(1-36)OH (IS-MS: 4235)
14: [Thr¹]гПТГ(1-38)OH (IS-MS: 4472)
15: [Leu¹]гПТГ(1-38)OH (IS-MS: 4484)
16: [Abu¹]гПТГ(1-38)OH (IS-MS: 4456)
17: [Gaba¹]гПТГ(1-38)OH (IS-MS: 4456)
18: [Leu⁸, Lys¹¹, Gln¹⁸]гПТГ(1-36)OH
19: [Leu⁸, Gln¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹, Arg²²]гПТГ(1-36)OH (IS-MS: 4347)
20: [Leu⁸, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH (IS-MS: 4007)
21: [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)ОН (IS-MS: 3906)
22: [Leu⁸, Ala¹³, Gln¹⁸, Gln²⁶, Phe²⁷, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH
23: Ip-[Leu⁸, Lys(Ip)¹³, Gln¹⁸, Lys(Ip)^26,27, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH (IS-MS: 4175)
24: Ip-[Leu⁸, Ala¹³, Gln¹⁸, Gln²⁶, Phe²⁷, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH
25: [Gln¹⁶]гПТГ(1-38)OH
26: [Ser¹⁴]гПТГ(1-38)OH
27: [AIa¹, Ala³, Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, His²⁵, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH
28: [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Gln²⁶, Phe²⁷, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH
29: [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH (IS-MS: 3965)
30: [Leu⁸, Gln¹⁸, Ala²⁹, Glu³⁰, Ile³¹]гПТГ(1-34)OH
31: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]гПТГ(1-36)OH (IS-MS:4282)
32: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ser¹⁴, lle¹⁵, Gln¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹] гПТГ(1-36)OH
33: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Leu¹⁸]гПТГ(1-36)OH
34: [Leu⁸, Gln¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹]гПТГ(1-36)OH
35: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁷, Leu¹⁸]гПТГ(1-36)OH (IS-MS: 4252)
36: [Leu⁸, Gln¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH.

37: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH (IS-MS: 4022)
38: [Leu⁸, Ala¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Ala¹⁹]гПТГ(1-36)OH
39: [Leu⁸, Asp¹⁰, Ala¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Ala¹⁹]гПТГ(1-36)OH
40: (Leu⁸, Gln¹⁸, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH
41: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹, Thr³³, Ala³⁴] гПТГ(1-34)OH (IS-MS: 4077)
42: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]гПТГ(1-36)OH (IS-MS: 4181)
43: [Leu⁸, Ala¹⁶, Asp¹⁷, Gln¹⁸, Ala¹⁹]гПТГ(1-36) OH (IS-MS: 4193)
44: [Leu⁸, Ala¹⁶, Ala¹⁷, Gln¹⁸, Ala¹⁹]гПТГ(1-36)OH (IS-MS: 4149)
45: [Leu⁸, Ala¹⁷, Gln¹⁸, Ala¹⁹]гПТГ(1-36)OH
46: [Leu⁸, Ala¹⁷, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg²²]гПТГ(1-36)OH (IS-MS: 4219)
47: [Leu⁸, Ala¹⁷, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH (IS-MS: 3960)
48: [Leu⁸, Gln¹⁸]гПТГ(1-36)OH
49: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34) OH (IS-MS: 3980)
50: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸]гПТГ(1-36)OH (IS-MS: 4240)
51: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH (IS-MS: 3923)
52: [Leu¹⁸, Asp¹⁰, Ala¹⁶, Gln¹⁸]гПТГ(1-36)OH (IS-MS: 4225)
53: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³]гПТГ(1-34)OH (IS-MS: 3999)
54: [Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³]гПТГ(1-34)OH
55: [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg²²]гПТГ(1-36)OH
56: [Ile¹⁵]гПТГ(1-38)OH
57: [Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg²², His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH
58: [Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴] гПTГ(1-34)OH
59: [Leu⁸, Ser¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg²²]гПТГ(1-36)OH
60: [Leu⁸, Ala¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg²⁶, Arg²⁷]гПТГ(1-36)OH
61: [Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, His²⁶, Leu²⁷, Arg³³, Ala³⁴] гПТГ(1-34)OH
62: [Leu⁸, Ala^16,17,18,19]гПТГ(1-36)OH
63: [Leu⁸, Ala¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Gln²⁶, Phe²⁷]гПТГ(1-34)OH (IS-MS: 4127)
64: Ip-[Leu⁸, Ala¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Gln²⁶, Phe²⁷]гПТГ(1-34)OH
65: Ip-[Leu⁸, Lys(Ip)¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Lys(Ip)^26,27]гПТГ(1-36)OH
66: [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]гПТГ(1-36) OH (IS-MS: 4166)
67: Ip-[Leu⁸, Lys(Ip)¹³, Ala¹⁶, Ala¹⁷, Ala¹⁸, Ala¹⁹, Lys(Ip)^26,27] гПТГ(1-36)OH
68: [Aib³, Gln¹⁸]гПТГ(1-36)OH (IS-MS: 4283)
69: Ip-[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys(Ip)^11,13,26,27,, Gln¹⁸]гПТГ(1-36)OH
70: Ip-[Leu⁸, Ser¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg²², Lys(Ip)^26,27]гПТГ(1-36)OH
71: [Leu⁸, Tyr¹⁸]гПТГ(1-36)OH
72: [Ser³³]гПТГ(1-38)OH
73: [Thr³³]гПТГ(1-38)OH
74: [Leu³³]гПТГ(1-38)OH
75: [Gly³³]гПТГ(1-38)OH
76: [Leu⁸, His¹⁰, Gln¹⁸, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH
77: [Leu⁸, Gly¹⁰, Gln¹⁸, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH
78: [Leu⁸, Glu¹⁰, Gln¹⁸, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH
79: [Leu⁸, Thr¹⁰, Gln¹⁸, Arg²², Thr³³ Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH
80: [Leu⁸, Gln¹⁰, Gln¹⁸, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)OH
81: [Gln³³]гПТГ(1-38)OH
82: [Leu⁸, Tyr¹⁰, Gln¹⁸, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)ОН
83: [1-амино-циклопентан-1-карбоксильная кислота¹, Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]гПТГ(1-36)OH
84: [1-амино-циклопентан-1-карбоксильная кислота¹, Leu⁸, Ala^13,16, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg^26,27]гПТГ(1-36)OH
85: [1-амино-циклопентан-1-карбоксильная кислота³, Gln⁸]гПТГ(1-36)OH (IS-MS: 4309)
86: [Arg¹²]гПТГ(1-38)OH
87: [Ser¹²]гПТГ(1-38)OH
88: [Cys¹³]гПТГ(1-38)OH
89: [Ile¹³]гПТГ(1-38)OH
90: [Asn¹³]гПТГ(1-38)OH
91: [Trp¹³]гПТГ(1-38)OH
92: [Asp¹³]гПТГ(1-38)OH
93: [Val¹³]гПТГ(1-38)OH
94: [Thr¹³]гПТГ(1-38)OH
95: [Ser¹³]гПТГ(1-38)OH
96: [Tyr¹³]гПТГ(1-38)OH
97: [Met¹³]гПТГ(1-38)OH
98: [Gln¹³]гПТГ(1-38)OH
99: [Leu¹³]гПТГ(1-38)OH
100: [Ala¹³]гПТГ(1-38)OH
101: [Gly¹³]гПТГ(1-38)OH
102: [Val¹⁴]гПТГ(1-38)OH
103: [Ala¹⁴]гПТГ(1-38)OH
104: [Lys¹⁴]гПТГ(1-38)OH
105: [Arg¹⁴]гПТГ(1-38)OH
106: [Thr¹⁴]гПТГ(1-38)OH
107: [Ile¹⁴]гПТГ(1-38)OH
108: [Tyr¹⁴]гПТГ(1-38)OH
109: [Tyr¹⁵]гПТГ(1-38)OH
110: [Arg¹⁵]гПТГ(1-38)OH
111: [Val¹⁵]гПТГ(1-38)OH
112: [Lys¹⁶]гПТГ(1-38)OH
113: [Ser¹⁶]гПТГ(1-38)OH
114: [Leu¹⁶]гПТГ(1-38)OH
115: [Ala¹⁶]гПТГ(1-38)OH
116: [Gly¹⁶]гПТГ(1-38)OH
117: [Ala¹⁷]гПТГ(1-38)OH
118: [Met¹⁷]гПТГ(1-38)OH
119: [Ile¹⁷]гПТГ(1-38)OH
120: [Ser¹⁹]гПТГ(1-38)OH
121: [Lys¹⁹]гПТГ(1-38)OH
122: [Leu¹⁹]гПТГ(1-38)OH
123: [Ala¹⁹]гПТГ(1-38)OH
124: [Tyr¹⁹]гПТГ(1-38)OH
125: [Met¹⁹]гПТГ(1-38)OH
126: [His¹⁹]гПТГ(1-38)OH
127: [Val¹⁹]гПТГ(1-38)OH
128: [G1y¹⁹]гПТГ(1-38)OH
129: [Pro¹⁹]гПТГ(1-38)OH
130: [Asp¹⁹]гПТГ(1-38)OH
131: [Ile¹⁹]гПТГ(1-38]OH
132: [Val¹⁹, Gln²⁴]гПТГ(1-38)OH
133: [Arg¹⁹]гПТГ(1-38)OH)
134: [Phe²⁰]гПТГ(1-38)OH
135: [Ala²¹]гПТГ(1-38)OH
136: [Gly²¹]гПТГ(1-38)OH
137: [Phe²¹]гПТГ(1-38)OH
138: [Leu²¹]гПТГ(1-38)OH
139: [Asn²¹]гПТГ(1-38)OH
140: [Gln²¹]гПТГ(1-38)OH
141: [Ser²¹]гПТГ(1-38)OH
142: [Gly²²]гПТГ(1-38)OH
143: [Leu²²]гПТГ(1-38)OH
144: [His²²]гПТГ(1-38)OH
145: [Ala²²]гПТГ(1-38)OH
146: [Ile²²]гПТГ(1-38)OH
147: [Val²²]гПТГ(1-38)OH
148: [Ser²²]гПТГ(1-38)OH
149: [Arg²²]гПТГ(1-38)OH
150: [Arg²⁶]гПТГ(1-38)OH
151: [Val²⁷]гПТГ(1-38)OH
152: [Ile²⁷]гПТГ(1-38)OH
153: [Leu²⁷]гПТГ(1-38)OH
154: [Arg²⁷]гПТГ(1-38)OH
155: [Ala²⁷]гПТГ(1-38)OH
156: [Val²⁸]гПТГ(1-38)OH
157: [Ile²⁸]гПТГ(1-38)OH
158: [Pro³, Thr³³]гПТГ(1-38)OH
159: [Arg³³]гПТГ(1-38)OH
160: [Pro³³]гПТГ(1-38)OH
161: [Asp³³]гПТГ(1-38)OH
162: [Ile³³]гПТГ(1-38)OH
163: [Lys³³]гПТГ(1-38)OH
164: [Ile³¹, Arg³³]гПТГ(1-38)OH
Пример 165. [1-Аминоциклопентан-1-карбоксильная кислота¹]гПТГ(1-36)NH₂.

Указанный пептид синтезируют поэтапным способом на подложке из смолы, основанной на полистироле. Для защиты альфа-аминогрупп используют Fmoc-группу.

Боковые функциональные группы защищают следующим образом: Arg(Pmc), Asn (Trt), Asp(OtBu), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc) и Tyr(tBu). О стальные аминокислоты оставляют незащищенными.

0,4 мМ/г 4-(2',4'-диметоксифенил-Fmoc-амино-метил)-фенокси- ко(полистирол-дивинилбензола), которые можно получить, например, так, как это описано в [10], подвергают участию в следующем цикле, в котором стадии (1)-(5) представляют собой обработку:
(1) ДМФ
(2) 20%-ным пиперидином в ДМФ
(3) ДМФ
(4) смесью HOBt, диизопропилкарбодиимида Fmoc-аланина (по 0,8 мМ каждого на 1 г исходной смолы)
(5) ДМФ
Объемы промывающих агентов и взаимодействующих веществ составляют от 5 до 20 мл на 1 г исходной смолы.

Для того чтобы синтезировать на указанной смоле правильную аминокислотную последовательность вышепоименованного соединения, в следующем цикле обработок (1)-(5) Fmoc-аланин заменяют Fmoc-валином и т.д. для каждого последующего цикла.

Каждый этап повторяют столько раз, сколько необходимо либо для полного вступления в реакцию указанной смолы (этапы 2, 4), либо для полного удаления предыдущих реагентов из указанной смолы (этапы 3, 5). По окончании каждого цикла отбирают образцы смолы и проверяют завершенность реакции присоединения с помощью колориметрического теста на оставшиеся аминогруппы с использованием нингидрина.

В конце синтеза осуществляют последний цикл, состоящий только из этапов (1)-(3), и промывают полученную полипептидную смолу 2-пропанолом, затем смесью метанола и метилен хлорида в объемном соотношении 1:1 и высушивают в вакуумной сушилке.

1 г пептидной смолы в течение 2 часов суспендируют в 20 мл смеси трифторуксусной кислоты, воды и 1,2-этандитиола в объемном соотношении 90:5:5 при комнатной температуре и промывают небольшим объемом ТФУ. Осаждают продукт из объединенных фильтратов, добавляя к ним 20 объемов эфира, фильтруют, промывают дополнительным количеством эфира и высушивают. Полученный остаток растворяют в 2%-ной уксусной кислоте, выдерживают этот раствор при комнатной температуре в течение 8 часов, после чего подвергают лиофилизации. Полученный лиофилизат хроматографируют на C-18 силикагельной колонке с использованием градиента ацетонитрила в 2%-ной H₃PO₄. Фракции подвергают проверке с помощью аналитической HPLC и собирают те из них, которые содержат чистое соединение, фильтруют через анионообменную смолу (ацетатную форму) и подвергают лиофилизации с получением вышепоименованного соединения в виде полиацетата, полигидрата.

Fmoc-1-аминоциклопентан-1-карбоксильная кислота, используемая при получении промежуточного продукта пептидной смолы, может быть синтезирована так, как это описано в [11].

MS (IS): 4312
Пример 166. [1-(1-Аминоииклопропан-1-карбоксильная кислота)] гПТГ(1-36)NH₂.

Указанный пептид получают способом, аналогичным описанному в примере 165. Fmoc-1-аминоциклопропан-1-карбоксильную кислоту, используемую для получения промежуточного продукта пептидной смолы, можно синтезировать так, как это описано в [12].

MS (IS): 4283
Воспроизводя способ, описанный в примере 165, но используя при этом соответствующие исходные вещества, можно получить следующие соединения:
Пример
167: [D-Pro¹]гПТГ(1-36)NH₂
168: [Nva¹]гПТГ(1-36)NH₂
169: [N-Me-Ser¹]гПТГ(1-36)NH₂
170: [индол-2-карбоксильная кислота¹]гПТГ(1-36)NH₂
171: [индол-3-карбоксильная кислота¹]гПТГ(1-36)NH₂
172: [пиридин-3-карбоксильная кислота¹]гПТГ(1-36)NH₂
173: [пиридин-2-карбоксильная кислота¹]гПТГ(1-36)NH₂
174: [гексагидропиридазин-3-карбоксильная кислота¹]гПТГ(1-36)NH₂
175: [морфолин-2-карбоксильная кислота¹]гПТГ(1-36)NH₂
176: [Pro¹]гПТГ(1-36)NH₂
177: [Leu¹]гПТГ(1-36)NH₂
178: [Ile¹]гПТГ(1-36)NH₂
179: [Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)NH₂
180: [Nva⁸]гПТГ(1-36)NH₂
181: [Gln¹⁸]гПТГ(1-36)NH₂
182: [Tyr18]гПТГ(1-36)NH₂
183: [Lys¹⁸]гПТГ(1-36)NH₂
184: [Ala¹⁸]гПТГ(1-36)NH₂
185: [Phe²³, His²⁵, His²⁶, Leu²⁷]гПТГ(1-34)NH₂
186: [Phe²³] гПТГ (1-34)NH₂ (IS-MS: 4247)
187: [Phe²³, His²⁵, His²⁶, Leu²⁷, Ile²⁸, Ala²⁹, Glu³⁰, Ile³¹, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)NH₂ (IS-MS: 3934)
188: [Ala²⁹]гПТГ(1-36)NH₂ (IS-MS: 4248)
189: [Ala³⁴]гПТГ(1-36)NH₂ (IS-MS: 4210)
190: [Gln²⁵]гПТГ(1-36)NH₂
191: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)NH₂
192: [Ala¹, His⁵, Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)NH₂
193: [Ser¹⁴, Ile¹⁵, Gln¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)NH₂
194: [D-Phe³⁴, D-Ala³⁶]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4290]
195: [Ala³]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4271]
196: [D-Ser³]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4290]
197: [D-Glu⁴]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4290]
198: [D-His⁹]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4286]
199: [Ala¹⁰]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4243]
200: [D-Asn¹⁰]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
201: [Ala¹²]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4299]
202: [Gln¹³]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4287]
203: [His¹³]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4296]
204: [Leu¹³]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4371]
205: [Ala¹³]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4228]
206: [ALa¹³, Gln²⁶, Phe²⁷, D-Phe³⁴, D-Ala³⁶]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4249]
207: [Ala¹⁴]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4219]
208: [D-His¹⁴]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
209: [D-Asn¹⁶]гПТГ(1-36)NH² [MS (IS): 4284]
210: [Ala₁₇]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4270]
211: [D-Ser¹⁷]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
212: [Ala¹⁹]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4228]
213: [D-Glu¹⁹]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
214: [Ala²¹]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4257]
215: [Ala²²]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4227]
216: [Gln²⁶]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4287]
217: [Nle²⁶]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4271]
218: [D-Lys²⁶]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
219: [Nle^8,18,27]гПТГ(1-36)NH₂
220: [His²⁷]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4294]
221: [Phe²⁷]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4304]
222: [Nle²⁷]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4271]
223: [Asn²⁷]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4271]
224: [Ala²⁷]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4228]
225: [D-Gln²⁹]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4289]
226: [D-Asp³⁰]гПТГ(1-34)NH₂ [MS (IS): 4118]
227: [Ala³⁰]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4241]
228: [D- Val³¹]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4290]
229: [Ala³¹]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4258]
230: [Lys³²]гПТГ(1-34)NH₂ CMS (IS): 3832]
231: [D-His³²]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
232: [Ala³²]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4219]
233: [D-Asn³³]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
234: [Ala³³]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4210]
235: [NMePhe³⁴]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4301]
236: [D-Asp³⁰]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4290]
237: Ip-[Nle^8,18, Lys(Ip)^13,26,27, D-Asn³³, D-Phe³⁴]гПТГ(1-34)NH₂
238: Ip-[Nle^8,18,27, Lys(Ip)^13,26]гПТГ(1-36)NH₂
239: [Nle^8,18, D-Asn³³, D-Phe³⁴]гПТГ(1-34)NH₂ [MS (IS): 4080]
240: [Lys(Ip)¹³]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4331]
241: пропаргил-[A¹]гПТГ(1-36)NH₂
242: [Ala⁰]гПТГ(1-36)NH₂
243: [Pro⁰]гПТГ(1-36)NH₂
244: ацетил-гПТГ(1-36)NH₂
245: [HyPro¹]гПТГ(1-36)NH₂
246: N-диметил-[Ala¹]гПТГ(1-36)NH₂
247: [D-Ser¹]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
248: [Lys (For)¹]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4356]
249: [D-глицериновая кислота¹]гПТГ(1-36)NH₂
250: [Asn¹]гПТГ(1-36)NH₂
251: [4-аминобензойная кислота¹]гПТГ(1-36)NH₂
252: [4-аминосалициловая кислота¹]гПТГ(1-36)NH₂
253: [TMSA¹]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4343]
254: [Phe¹]гПТГ(1-36)NH₂
255: [пропаргилглицин¹]гПТГ(1-36)NH₂
256: [Ala¹, His⁵, Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸, Phe²², Phe²³, His²⁵, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴]гПТГ(1-34)NH₂
257: [Abu²]гПТГ(1-36)NH₂
258: [D-Val²]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
259: [t-Leu²]гПТГ(1-36)NH₂
260: [Ala¹]гПТГ(1-36)NH₂
261: [D-Ile⁵]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
262: [D-Gln⁶]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
263: [D-Leu⁷]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
264: [Nle⁸]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4268]
265: [Phe⁸]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4303]
266: [Cha⁸]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4309]
267: [Leu⁸]гПТГ(1-38)NH₂
268: [D-Leu¹¹]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4287]
269: [Ala¹¹]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4244]
270: [D-Lys¹³]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
271: [D-Leu¹⁵]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
272: [Ala¹⁵]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4243]
273: [Ala¹⁶]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4243]
274: [Met(O₂)¹⁸]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4320]
275: [Nle¹⁸]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4268]
276: [D-Met¹⁸]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
277: [Lys²⁰]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4259]
278: [D-Arg²⁰]гПТГ(1-36)NH² [MS (IS): 4288]
279: [D-Val²¹]гПТГ(1-36)NH₂ ГМ8 (18): 4288]
280: [Trp(SO₂Pmc)²³]гПТГ(1-38)NH₂ [MS (IS): 4723]
281: [Trp(Pmc)²³]гПТГ(1-38)NH₂ [MS (IS): 4660]
282: [D-Trp²³]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
283: [Ala²³]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4171]
284: [D-Leu²⁴]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
285: [Phe²⁵]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4277]
286: [Lys²⁵]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4258]
287: [Ala²⁵]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4201]
288: [Ala²⁶]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (13): 4229]
289: [Lys^26/27 (For)]гПТГ(1-36)NH₂
290: [D-Lys²⁷]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
291: [D-Leu²⁸]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
292: [D-Phe³⁴]гПТГ(1-36)NH₂ [MS (IS): 4288]
293: [D-Val³⁵]гПТГ(1-36)NH₂
294: [Ala³⁵]гПТГ(1-36)NH₂
295: [Pro³⁵]гПТГ(1-36)NH₂
296: [NMeVaI³⁵]гПТГ(1-36)NH₂
297: [Thr³⁵, Ala³⁶]гПТГ(1-36)NH₂
298: [D-Ala³⁶]гПТГ(1-36)NH₂
299: [NMeAla³⁶]гПТГ(1-36)NH₂
Пример 300. (5-Амино-4-фтор)-2-изопропил)-гекс-3-еноил-гПТГ(3-36)NH₂.

а) Получение гПТГ(3-36)-NH-смолы.

Указанное промежуточное соединение получают способом, аналогичным описанному в примере 165.

б) [(5-Амино-4-фтор-2-изопропил)-гекс-3-еноил]гПТГ(3-36]-aмид.

204,6 мг Fmoc-гПТГ(3-36)-NH-смолы, полученной на вышеописанном этапе а), обрабатывают ДМФ в течение 5 минут, после чего промывают несколько раз изопропанолом или ДМФ. Удаляют защитную группу Fmoc, проводя обработку смесью ДМФ и пиперидина в соотношении 8:2 в течение 10 минут. Смесь лишенного защиты фрагмента ПТГ вместе с 38,1 мг 4-фтор-2-изопропил-5-т-бутоксикарбониламино-гекс-3-енойной кислоты, 68,7 мг гексафторофосфата бензотриазол-1-илокситрис(пирролидино)фосфониума (PyBOP) и 26,6 мг 4-метилморфолина интенсивно встряхивают в 0,7 мл ДМФ в течение 80 минут. После нескольких отмывок изопропанолом и ДМФ твердый остаток обрабатывают смесью 4,5 мл ТФУ, 0,25 мл воды и 0, 25 мл этандитиола в течение 55 минут. Затем полученную смесь фильтруют и, добавляя к оставшемуся раствору диэтиловый эфир, осаждают вышепоименованное соединение. Указанное соединение очищают с помощью препаративной HPLC (колонка Vydac, градиент А = вода, Б = смесь ацетонитрила, воды и фосфорной кислоты в соотношении 1:3:0,2).

MS (IS): масса 4272
[]^н9_{365 нм} = -66,8^o (c = 0,25 в 95%-ном AcOH)
Пример 301. 4-Фтор-2-изопропил-5-трет-бутоксикарбониламино-гекс- 3-эноат
а) (S)-3-[1-оксо(4-Фтор-3-гидрокси-2-изопропил)гекс-4-енил]- 4-фенилметил-2-оксазолидинон.

Указанное соединение получают способом, аналогичным описанному в [13], с использованием (S)-3-(1-оксоизобутил)-4-фенилметил-2- оксазолидинона и 2-фтор-бут-2-енала в качестве исходных веществ.

MS (FAB): MH⁺ 350
б) (S)-3-{1-оксо[4-Фтор-3-O-(2,2,2-трихлорэтанимино)-2-изопропил]гекс-4-енил}-4-фенилметил-2-оксазолидинон.

1,5 г соединения из примера 301а) растворяют в 6 мл ДХМ. Добавляют 0,0958 мл 1,8-диазабицикло(5,4,0)ундек-7-ен (ДБУ) при 0^o. К полученному раствору по каплям добавляют 0,475 мл трихлорацетонитрила в 2 мл ДХМ при 0^o. Через 1 час реакционную смесь выпаривают, а полученный остаток очищают с помощью хроматографии на силикагельной колонке (элюция смесью гексана и диэтилового эфира в соотношении 2:1).

MS (FAB): MH⁺ 493
в) (S)-3-[1-оксо(4-Фтор-5-N-2,2,2-трихлорацетиламино-2-иопропил)гекс-3-енил]-4-фенилметил-2-оксазолидинон.

2 г соединения из примера 301б) растворяют в 150 мл о-ксилола и перемешивают в условиях дефлегмации при 160^oC в течение 3 часов. После этого удаляют о-ксилол и очищают полученный остаток с помощью хроматографии на силикагельной колонке (элюция смесью толуола и этилацетата в соотношении 98:2).

MS (FAB): MH⁺ 493
г) 4-Фтор-5-N-2,2,2-трихлорацетиламино-2-изопропил-гекс-3-енойная кислота.

Указанное соединение получают способом, аналогичным описанному в [13], но с использованием в качестве исходного вещества соединения из примера 301в).

MS (FAB): MH⁺ 335
д) 5-Амино-4-фтор-2-изопропил-гекс-3-енойная кислота.

889 мг соединения из примера 301г) растворяют в 20 мл этанола и добавляют 13,5 мл 6 н. раствора гидроксида натрия. Полученную смесь перемешивают в течение 20 часов при к.т. После этого удаляют этанол, а оставшуюся водную фракцию подкисляют 2 н. соляной кислотой до pH 2 и экстрагируют н-бутанолом. Полученный экстракт выпаривают, а остаток фильтруют через силикагель (элюент - смесь ДХМ и метанола в соотношении 1:1), выделяя таким образом чистое вышепоименованное соединение.

MS (FAB): MH⁺ 190
е) 4-Фтор-2-изопропил-5-трет-бутоксикарбониламино-гекс-3-енойная кислота.

0,56 г соединения из примера 301д) растворяют в 12 мл воды и добавляют 1,5 г карбоната натрия. К полученному раствору добавляют 0,4 мл ди-трет-бутилкарбоната, растворенного в 12 мл тетрагидрофурана. Указанную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. Затем добавляют 50 мл н-бутанола и 50 мл воды, после чего при интенсивном перемешивании добавляют 1 н. соляную кислоту до pH 2. Органическую фракцию выпаривают, а полученный остаток очищают с помощью хроматографии на силикагельной колонке (элюция смесью гексана и ацетона в соотношении 2:1).

MS (FAB): MH⁺ 290
[]_D = -61,3^o (1% в метаноле)
Воспроизводя вышеперечисленные процедуры при использовании соответствующих исходных веществ, можно получить следующие соединения:
4-фтор-2-метил-5-трет-бутоксикарбониламино-гекс-3-енойная кислота;
4-хлор-2-метил-5-трет-бутоксикарбониламино-гекс-3-енойная кислота;
4-фтор-2-бензил-5-трет-бутоксикарбониламино-гекс-3-енойная кислота;
4-хлор-2-изопропил-5-трет-бутоксикарбониламино-гекс-3-енойная кислота;
4-метил-2-изопропил-5-трет-бутоксикарбониламино-гекс-3-енойная кислота
Пример 302.

С помощью процедур, описанных в примере 300, но при использовании соответствующих исходных веществ, можно получить следующие соединения:
(5-амино-4-фтор-2-метил)-гекс-3-еноил-гПТГ(3-36)-амид
MS (IS): Масса 4245;
(5-амино-4-хлор-2-метил)-гекс-3-еноил-гПТГ(3-36)-амид
MS (IS): Масса 4260;
(5-амино-4-фтор-2-бензил)-гекс-3-еноил-гПТГ(3-36)-амид
MS (IS): Масса 4320;
(5-амино-4-хлор-2-изопропил)-гекс-3-еноил-гПТГ(3-36)-амид
MS (IS): Масса 4289;
(5-амино-4-метил-2-изопропил)-гекс-3-еноил-гПТГ(3-36)-амид
MS (IS): Масса 4269.

Пример 303.

С помощью процедур, описанных в приведенном выше примере 300, но при использовании соответствующих исходных веществ, можно получить следующие соединения:
а) (5-амино-3-аза-2-изопропил)-гексаноил-гПТГ(3-36)-амид [MS (IS): 4257] при использовании в качестве исходного вещества: (4-аза-2-т-бутоксикарбониламино-5-изопропил)-гексанойной кислоты;
б) (5-амино-3-азa-3-N-ацетил-2-изопропил)-гексаноил-гПТГ(3-36)-амид [MS (IS): 4299] при использовании в качестве исходного вещества: (4-аэа-4-N-ацетил-2-т-бутоксикарбониламино-5-изопропил)-гексанойной кислоты;
в) (5-амино-3-аза-3-N-ацетил)-гексаноил-гПТГ(3-36)-амид [MS (IS): 4257] при использовании в качестве исходного вещества: (4-аза-N-ацетил-2-т-бутоксикарбониламино)-гексанойной кислоты;
г) (5-метиламино-3-аза-2-изопропил)-гексаноил-гПТГ(3-36)-амид [MS (IS): 4271] при использовании в качестве исходного вещества: [4-аза-2-(N-т-бутоксикарбонил,N-метиламино)-5-изопропил]-гексанойной кислоты;
д) (5-метиламино-3-аза-3-N-метил-2-изопропил)-гексаноил- гПТГ(3-36)-амид [MS (IS): 4285] при использовании в качестве исходного вещества: [4-аза-4-N-метил-2-(N-т- бутоксикарбониламино,N-метиламино)- 5-изопропил]-гексанойной кислоты;
е) (5-амино-3-аза-3-N-метил-2-изопропил)-гексаноил-гПТГ(3-36)-амид [MS (IS): 4271] при использовании в качестве исходного вещества: (4-аэа-4-N-метил-2-т-бутоксикарбониламино-5-иэопропил)-гексанойной кислоты;
ж) (5-амино-3-аза-3-N-изопропил)-гексаноил-гПТГ(3-36)-амид [MS (IS): 4257] при использовании в качестве исходного вещества: (4-аза-4-N-изопропил-2-т-бутоксикарбониламино-5-изопропил)-гексанойной кислоты;
з) [1-циклопентан-1-амино-1-карбоксильная кислота(пси CH₂-NH)-Val²]-гПТГ(3-36)-амид при использовании 1-циклопентан-1-т-бутоксикарбониламино-1-карбоксильной кислоты(пси CH₂-NH)-Val²-OH.

Пример 304.

С помощью процедур, описанных в приведенном выше примере 3а), но при использовании соответствующих исходных веществ, можно получить соединение (5-амино-3-аза-2-изопропил)-гексаноил-[Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]гПТГ(3-36)-ОН [MS (IS): 4135] при использовании в качестве исходного вещества (4-аза-2т-бутоксикарбониламино)-гексанойной кислоты.

Пример 305. (4-аза-4-N-Ацетил-2-трет-бутоксикарбониламино- 5-изопропил)-гексанойная кислота.

а) Метил(4-аза-2-трет-бутоксикарбониламино-5-изопропил)- гексанойная кислота.

Boc-Ala-Val-OMe обрабатывают реагентом Лавессона [15]. Затем образующийся при этом эндотиопептид восстанавливают в соответствии с процедурой, описанной в [16].

MS (EI): MH⁺ 289.

(б) Метил(4-аза-4-N-Ацетил-2-трет-бутоксикарбониламино-5- изопропил)-гексаноат.

264 мг соединения из примера 305а) растворяют в 5 мл ДХМ, после чего добавляют 0.14 мл триэтиламина и 0,072 мл ацетил хлорида. Указанную смесь перемешивают в течение 24 часов при 40^o. После добавления 50 мл ДХМ полученный раствор дважды промывают водой. Органическую фракцию высушивают и выпаривают. Полученное таким образом вышепоименованное соединение очищают с помощью колоночной хроматографии (элюция смесью гексана и этилацетата в соотношении 4:1).

MS (EI): MH⁺ 330
в) (4-аза-4-N-Ацетил-2-трет-бутоксикарбониламино-5-изопропил)- гексанойная кислота.

356 мг соединения из примера 305б) растворяют в 4 мл смеси метанола и воды в соотношении 3:1 и добавляют 53 мг гидроксида лития. Указанную смесь перемешивают при 60^o в течение двух часов. Затем добавляют 25 мл ДХМ, после чего при интенсивном перемешивании добавляют 1 н. соляную кислоту до pH 2. Органическую фракцию отделяют, высушивают и выпаривают, получая таким образом вышепоименованное соединение в чистой форме.

MS (FAB): MH⁺ 317
Воспроизводя указанную процедуру, но при использовании соответствующих исходных веществ, можно получить следующие соединения:
(4-аза-4-N-ацетил-2-трет-бутоксикарбониламино)-гексанойную кислоту;
(4-аза-2-трет-бутоксикарбониламино-5-изопропил)-гексанойную кислоту;
(4-аза-2-(N-т-бутоксикарбонил, N-метиламино)-5-изопропил] - гексанойную кислоту;
(4-аза-4-N-метил-2-т-бутоксикарбониламино-5-изопропил)-гексанойную кислоту;
(4-аза-4-N-изопропил-2-т-бутоксикарбониламино-5-изопропил)- гексанойную кислоту;
(4-аза-2-т-бутоксикарбониламино)-гексанойную кислоту.

Соединения из примеров 1-300 и 302-304 показывают соответствующие соотношения аминокислот при количественном анализе на содержание аминокислот.

Если это не оговорено особо, в приведенных ниже примерах, иллюстрирующих предусмотренный настоящим изобретением рекомбинантный способ, используют стандартные процедуры, описанные в [17].

Пример 306. Клонирование гена 55 бактериофага T4.

Два фрагмента ДНК, один из которых содержит полную нуклеотидную последовательность гена 55 бактериофага T4, а другой - кодирует часть указанного гена, амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), использующей очищенную ДНК T4 в качестве матрицы. В качестве праймеров используют олигонуклеотиды, содержащие сайты узнавания эндонуклеазой NdeI или BamHI. ПЦР (25 циклов, каждый: 30'' 94^o, 30'' 50^o, 30'' 72^o) проводят с использованием 1 нг матрицы и 100 пМ расположенного выше по течению праймера (последовательность N 5, сайт узнавания NdeI образован нуклеотидами 7-12 указанной последовательности) и 100 пМ расположенного ниже по течению праймера (последовательность N 6, сайт узнавания BamHI образован нуклеотидами 5-10 указанной последовательности) в 100 мкл реакционного буфера, содержащего 10 мМ Tris-HCl, 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ каждого из дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ, а также 0,1%-ный Triton X 100, pH 9,0. Получают фрагмент в 0,6 тпн.

Укороченную форму гена 55 получают с помощью ПЦР так же, как это описано для полного гена, за исключением того, что в качестве праймера, расположенного ниже по течению, используют другой олигонуклеотид (последовательность N 7, сайт узнавания BamHI образован нуклеотидами 5-10 указанной последовательности). Получают фрагмент в 0,35 тпн.

Фрагменты в 0,6 тпн и 0,35 тпн расщепляют рестрикциоными эндонуклеазами Ndel/BamHI и клонируют в расщепленный по Ndel/BamHI вектор экспрессии pET17B (доступный в Novagen). Фрагмент ДНК в 0,6 тпн кодирует полный белок gp55 (188 аминокислотных остатков - см. последовательность N 1), в то время как фрагмент в 0,35 тпн кодирует аминоконцевой фрагмент белка gp55 размером 12 кД (112 аминокислотных остатков - см. последовательность N 3).

Пример 307. Получение и клонирование ДНК, кодирующей гПТГ(1-38)OH.

Фрагмент ДНК, кодирующий а) линкерный пептид, соответствующий аминокислотным остаткам 110-115 последовательности N 1 и гПТГ(1-38), или б) линкерный пептид, соответствующий аминокислотным остаткам 186-191 последовательности N 3 и гПТГ (1-38), получают с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы клонированной синтетической последовательности, кодирующей ПТГ(1-38). В качестве праймера, расположенного выше по течению, используют олигонуклеотиды, кодирующие линкер а) (последовательность N 8) или кодирующие линкер б) (последовательность N 9). Расположенный ниже по течению праймер представлен в виде последовательности N 10. Каждый из праймеров, расположенных выше по течению, включает в себя сайт клонирования BamHI, а праймер, расположенный ниже по течению, содержит сайт узнавания XhoI (нуклеотиды 5-10 каждой последовательности). ПЦР осуществляют в тех же условиях, как это описано в примере 306.

После расщепления с помощью BamHI и XhoI продукт ПЦР размером 0,23 тпн внедряют в BamHI-XhoI перевар плазмиды gp55-pER17B, полученной в примере 306.

Для экспрессии составных белков полученными плазмидными конструкциями трансформируют штамм E.coli BL21 (DE3) LysE, после чего размножают отдельные бактериальные колонии. Экспрессию составных белков получают посредством инкубирования первичной культуры в среде для циклического роста (Bio 101) на вращательной качалке в течение ночи при 37^oC. Основную культуру инокулируют указанной первичной культурой из расчета 1-5% объема основной культуры. После этого основную культуру ферментируют при температуре 37^oC и pH в пределах от 6,9 до 7,1 в условиях аэрации с интенсивностью 10 л/мин и перемешивания со скоростью 200-400 об/мин. Экспрессию индуцируют, добавляя 1 мМ IPTG в тот момент, когда указанная культура достигает значения OD₅₅₀, приблизительно равного 1,0-5,0. После индукции экспрессии ферментацию продолжают в течение пяти часов, а затем собирают ферментационную массу, не убивая пои этом клетки Е. coli. Собранные клетки осаждают в трубочной центрифуге, ресуспендируют в пробе буфера и исследуют на наличие экспрессии с помощью SDS PAGE. Затем клеточный осадок замораживают до стадии очистки. Используемые процедуры и хозяйские клетки полностью описаны [18].

Пример 308. Выделение частиц включений.

Замороженные осадки E.coli. полученные в Примере 307, ресуспендируют с получением 25%-ной (вес/объем) суспензии в Буфере А (50 мМ Tris pH 8,0; содержащем 2 мМ ДТТ, 5 мМ бензамидин-HCl, 1,5 мМ MgCl₂, 1,0 мМ MnCl₂, 10 мкг/мл ДНКазы 1 и 2 мг/мл лизоцима), которую перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре. Ресуспендированные клетки лизируют, пропуская их через гомогенизитор Мантон-Голина (2 раза при 1200 бар), а полученный в результате этого лизат хранят на льду. Указанный лизат разбавляют в 2 раза ледяным буфером Б (50 мМ Tris pH 8,0; содержащим 2 мМ ДТТ, 5 мМ бензамидин-HCl и 4 мМ ЭДТА) и центрифугируют в течение 30 мин при 27500 g.

Полученный супернатант аккуратно отбирают из цетрифуги и выбрасывают. Осадок ресуспендируют в буфере Б с получением 25%-ной (вес/объем) суспензии, еще раз пропускают через гомогенизатор Мантон-Голина и центрифугируют, как в предыдущем случае. Указанный процесс повторяют, используя один раз буфер Б, а один раз - воду. Взвешивают полученные таким образом осадки частиц включений и замораживают при -20^oC до использования.

Пример 309. Растворение и расщепление частиц включений, содержащих gp55-Asp-Pro-Pro-(1-38)гПТГ-OH.

Полученные в примере 308 замороженные частицы включений, содержащие gp55-Asp-Pro-Pro-(1-38)гПТГ, растворяют в 10 мМ кислого раствора HCl (аналитической чистоты) до конечной концентрации 6% (вес/объем). Полученный раствор инкубируют в течение 24 часов при 50^oC, после чего останавливают реакцию с помощью добавления 1 объема водного раствора 100 мМ NaOAc. Разбавленный супернатант очищают с помощью центрифугирования при 27500 g в течение 30 минут и фильтруют через стекловолокнистый фильтр.

Пример 310. Растворение и расщепление частиц включений, содержащих gp55-Asnp-Gly-Pro-(1-38)гПТГ-OH.

Выделенные в примере 308 замороженные частицы включений, содержащие gp55-Asp-Gly-Pro-(1-38)гПТГ, растворяют в 6 М гуанидин-гидрохлориде (содержащем 2 М гидроксиламин-гидрохлорид и доведенном до pH 9,0 с помощью добавления 4,5 М LiOH) с получением раствора с приблизительной концентрацией белка 5 мг/мл. Добавляя дополнительное количество LiOH, вновь доводят pH раствора до 9 и инкубируют в течение 4 часов при 45^oC. Останавливают реакцию с помощью добавления муравьиной кислоты до pH 4. центрифугируют раствор и фильтруют так же, как это описано в примере 309.

Пример 311. Препаративная HPLC Cly-Pro и Pro-Pro(1-38)гПТГ.

Профильтрованные супернатанты, полученные в результате реакции расщепления, исследуют с помощью аналитической обратнофазной HPLC (Orpogen HD-Gel-RP-7s-300: колонка 4 х 150) и сравнивают с известным стандартом (1-38)ПТГ (Bachem) для определения концентрации ПТГ. Указанную колонку титруют 85%-ным HPLC-буфером А (90% воды, 10% ацетонитрила; содержит 0,1 объемного процента ТФУ) и 15%-ным HPLC-буфером Б (10% воды, 90% ацетонитрила; содержит 0,1 объемного процента ТФУ) и элюируют градиентом от 15%-ного HPLC-буфера Б до 100%-ного HPLC-буфера Б в течение 15 минут при скорости потока 0,75 мл/мин.

В зависимости от масштаба выделения, супернатанты наносят либо на 1,0 х 25 см колонку C4 Vydac, либо на 2,2 х 25 см колонку C4 Vydac. Указанные колонки титруют 85%-ным HPLC-буфером А и 15%-ным HPLC-буфером Б при скорости потока 4 мл/мин и 10 мл/мин соответственно. Колонки элюируют более чем 80 мл градиента от 15%- ного до 85%-ного буфера Б и более чем 300 мл градиента от 15%-ного до 55%-ного буфера Б соответственно.

Пики Cly-Pro-гПТГ(1-38) или Pro-Pro-гПТГ(1-38) собирают вручную, после чего в вакууме отбирают ацетонитрил. Для того, чтобы определить концентрацию пептида как после расщепления, так и в собранных фракциях, используют аналитическую HPLC. Растворы свободного пептида в растворителе разбавляют равным объемом 100 мМ ацетата натрия, а при необходимости доводят pH до 5,4. После фильтрования (размер ячейки 0,2 мкм) указанный раствор наносят на катионообменную колонку (либо Mono S, либо SP-Сефароза высокого разрешения, набитые в колонки HR10/10 или XK16/10. соответственно), титрованную 50 мМ ацетатом натрия pH 5,4 (буфер В). Указанную колонку элюируют градиентом от 0 до 500 мМ NaCl в буфере В (более 7,5 объемов колонки). Собирают фракции по 10 мл объединяют пик X-X-(1-38)гПТГ. Концентрацию пептида определяют с помощью HPLC в соответствии с приведенным выше описанием.

Указанная колонка служит как для обмена пептидов в более физиологическом буфере, так и для удаления побочных пептидов, образующихся в результате химического расщепления самого составного белка.

Пример 312. Энзиматическое удаление X-X из X-X-(1-38)гПТГ-OH.

Объединенные пептидные фракции, полученные в примере 311 (концентрация в пределах 1,5-2,0 мг/мл), доводят до pH 8,0 с помощью добавления твердого Tris. Добавляют очищенную X-пролилдипептидазу (0,5 мг/мл в PBS pH 7,2) [19] в соотношении 1:1000 и инкубируют раствор в течение 24 часов при 37^oC. Останавливают реакцию, добавляя ТФУ до концентрации 0,2% (pH 5,0), и выделяют образующийся при этом (1-38)ПТГ с помощью препаративной HPLC (используют те же условия, которые описаны в примере 6). Удаляют растворитель и лиофилизируют полученный продукт после удаления аликвот, соответствующих N-концевой последовательности, и масс-спектроскопических анализов.

Примерами выходов, получаемых с помощью двух вышеописанных подходов, основанных на использовании составных белков, являются следующие:
Ген 55-Asp-Pro-Pro-гПТГ(1-38)ОН (с использованием "укороченной" формы ген 55)
В условиях частично оптимизированной ферментации из 10 литров ферментационной массы получают сырой клеточный осадок весом 215 г. Процентное значение экспрессии указанного составного белка приблизительно равно 37%. Из полученного осадка выделяют 31 г частиц включений. Чистота белка (в отношении составного белка) в указанных частицах равна 61%. После растворения, расщепления и центрифугирования/фильтрации обнаруживают приблизительно 620 мг Pro-Pro-ПТГ. Это вещество дает 580 мг Pro-Pro-ПТГ в результате последующей HPLC на колонке C4-Vydac. После разбавления, обмена катионов на Mono S, расщепления с помощью Хпролилдипептидазы (при концентрации Pro-Pro-ПТГ, равной 2 мг/мл), HPLC и лиофилизации получают 440 мг лиофилизированного чистого продукта, обладающего полной биологической активностью. Это соответствует 71%-ному выходу на этапе от остановки расщепления до выделения конечного продукта.

Ген 55-Asn-Gly-Pro-гПТГ(1-38)ОН (с использованием "длинной" формы Ген 55)
Из неоптимизированной ферментационной массы объемом 20 л выделяют 78 г сырого осадка клеток, характеризующихся 50%-ной экспрессией указанного слитого белка. После лизирования и центрифугирования получают 18 г частиц включений "90%-ной чистоты". По завершении стадии кислотной остановки реакции, а также центрифугирования/фильтрации обнаруживают приблизительно 470 мг Gly-Pro-ПТГ. После этапа HPLC на колонке C4-Vydac выявляют 355 мг указанного пептида, из которых после обмена катионов на SP-Сефарозе остается 321 мг. Ферментативное удаление остатков Gly и Pro осуществляют при концентрации 2 мг/мл. После стадии заключительной HPLC и лиофилизации получают полностью биологически активный гПТГ(1-38)ОН, что соответствует 52%-ному выходу с момента остановки реакции расщепления.

Соединения из примеров 25, 26, 56 и 86-164 получают также с использованием способа, описанного в Примерах 306-312.

Предусмотренные настоящим изобретением соединения, находящиеся в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемых солей или комплексных соединений, обладают существенными фармакологическими свойствами, что продемонстрировано в тестах на животных, а потому указанные соединения рекомендуются для использования в терапевтических целях.

Биологическая активность соединений, предусмотренных настоящим изобретением, показана in vitro с помощью измерения их способности стимулировать синтез циклической АМФ в клетках остеосаркомы UMR 106-06 крыс и SaOS-2 человека в соответствии с методом Маркуса и Аурбаха [20]. Клетки UMR 106 остеосаркомы крыс выращивают до получения сплошного слоя в минимальной необходимой среде Игла: 10%-ная FCS в 12-луночных планшетах, клетки SaOS-2 остеосаркомы человека выращивают в среде 5А МакКоя: 10%-ная FCS. Затем указанную среду заменяют на 2%-ную FCS и добавляют 1-5 мкКи/лунку [3H]-аденина. Через два часа клетки дважды промывают несодержащей сыворотку средой и инкубируют в DMEM: 1%-ной BSA, содержащей 1 мМ 3-изобутил-1-метил-ксантина, для предотвращения действия фосфодиэстераз. 20 минутами позже добавляют тестируемое соединение. Через 15 минут с помощью добавления ледяной 5%-ной уксусной кислоты останавливают реакцию и экстрагируют цАМФ. Добавляют раствор носителя (0, . 5 мл/лунку), содержащий 5 мМ немеченого аденина, аденозина, АМФ, АДФ, АТФ и цАМФ, а также 0, 4 мкКи [14C]-аденозина для выявления его утилизации. [3H] -цАМФ выделяют с помощью серийного сита Dowex 50W-X4 (200-400) и хроматографии на окиси алюминия, а также ведут подсчет ее количества. Подсчитывают результаты в виде % от контроля при использовании растворителя и значений EC₅₀, определенных на основании кривых DRC. Предусмотренные настоящим изобретением соединения стимулируют образование цАМФ в клетках остеосарком крыс UMR 106-06 и человека SaOS-2, находясь в концентрации от 10^-11 до 10^-6 М.

Предусмотренные настоящим изобретением соединения имеют также способность к специфическому связыванию с рецепторами ПТГ, в том числе следующего рода:
С помощью лактопероксидазного метода (Anawa Lab. AG, Wangen) [Tyr³⁶] ПТГрП(1-36)амид цыпленка иодируют до получения специфической активности в 2200 Ки/мМ. Монослои клеток почки опоссума промывают 200 мкл смесью DMEM и HAM F12 (в соотношении 1:1), содержащей 1%-ную BSA, и инкубируют при 16^oC с [¹²⁵I-Tyr³⁶]хПТГрП(1-36)амидом (активность 50000 cpm на лунку) в присутствии или в отсутствие 1 мкМ [Tyr³⁶]хПТГрП(1-36)амида. После инкубирования клетки промывают 0,5 мл среды (4^oC), лизируют с помощью 0,5 мл 1 н. NaOH и определяют радиоактивность. Специфическое связывание находят как разность между общим связыванием и неспецифическим связыванием. Кривые конкурентного взаимодействия анализируют с использованием SCTFIT - нелинейной регрессионной компьютерной программы [21] и представляют данные в виде значений среднего pK_D (n= 2 или 3). В указанном тесте предусмотренные настоящим изобретением соединения проявляют способность к специфическому связыванию, выражаемую в виде значения среднего pK_D, находящегося в пределах от 7 до 10.

Кроме того, предусмотренные настоящим изобретением соединения повышают в плазме уровень кальция после продолжительного вливания s.c., например, как это показано на самцах крыс линии Whistar, весящих 140-170 г и подвергнутых тиропаратироидэктомии. Через 5 дней после тиропаратироидэктомии в шею крыс имплантируют мининасосы Альцета и вливают тестируемые соединения со скоростью от 0,3 до 30 мкг/день/крысу. После этого на утро 1-го, 2-го, 3-го и 6-го дня с помощью ретро-орбитальной пунктуры забирают кровь и посредством фотометрии определяют концентрацию кальция в плазме. Предусмотренные настоящим изобретением соединения повышают в указанном тесте уровень кальция в плазме.

В соответствии с этим предусмотренные настоящим изобретением соединения рекомендуются для лечения всех заболеваний костей, сопровождающихся прогрессирующей потерей или резорбцией кальция, или заболеваний, при которых желательно закрепление кальция в кости, например, остеопороза различного происхождения (в том числе ювенильного, менопаузного, пост-менопаузального, пост-травматического, вызванного старостью, либо кортикостероидной терапией или инактивацией), фрактур, остеопатии, включая острые и хронические стадии, связанные с деминерализацией скелета, размягчением костей, разрежением периодонтальной кости или разрежением кости в связи с артритом или остеоартритом, либо для лечения гипопаратироидизма.

Предусмотренные настоящим изобретением соединения особо рекомендуются для предупреждения или лечения остеопороза различного происхождения.

В случае всех вышеперечисленных вариантов использования рекомендуемая дневная доза находится в пределах от приблизительно 0,003 до приблизительно 10 мг, в предпочтительном случае - в пределах 0,003-3, в более предпочтительном случае - в пределах 0,01-1 мг соединения, предусмотренного настоящим изобретением. Предусмотренные настоящим изобретением соединения можно применять раз в день или до двух раз в неделю.

Предусмотренные настоящим изобретением соединения можно применять в свободной форме, либо в форме фармацевтически приемлемой соли или комплексных соединений. Указанные соли и комплексные соединения могут быть получены традиционным способом и проявляют ту же степень активности, как и соответствующие свободные соединения. Настоящее изобретение предусматривает также фармацевтический состав, включающий в себя предусмотренное настоящим изобретением соединение в форме свободного основания или в форме фармацевтически приемлемой соли или в форме комплексного соединения в сопровождении фармацевтически приемлемого разбавителя или носителя. Указанные составы могут применяться традиционным способом. Предусмотренные настоящим изобретением соединения могут быть применены любым традиционным способом, на пример, парэнтерально, в том числе в форме предназначенных для инъекций растворов и суспензий, энтерально, в том числе перорально, например, в форме таблеток или капсул, либо в форме, применяемой подкожно, через нос или в виде суппозитория.

В соответствии с вышеизложенным, настоящее изобретение охватывает также:
а) предусмотренное настоящим изобретением соединение, либо его фармацевтически приемлемую соль или комплексное соединение, предназначенные для использования в качестве фармацевтического агента;
б) способ улучшения образования костей, например, предупреждения или лечения всех костных заболеваний, сопровождающихся прогрессирующей потерей или резорбцией кальция, или заболеваний, при которых желательно закрепление кальция в кости, например, остеопороза различного происхождения (в том числе ювенильного, менопаузного, пост-менопаузного, посттравматического, вызванного старостью, либо кортикостероидной терапией или инактивацией), фрактур, остеопатии, включая острые и хронические стадии, связанные с деминерализацией скелета, размягчением костей, разрежением периодонтальной кости или рарефикацией кости в связи с артритом или остеоартритом, либо для лечения гипопаратироидизма у пациента, нуждающегося в такого рода лечении, причем указанный способ предусматривает применение вышеупомянутому больному эффективного количества предусмотренного настоящим изобретением соединения либо его фармацевтически приемлемой соли или комплексного соединения.

в) предусмотренное настоящим изобретением соединение либо его фармацевтически приемлемая соль или комплексное соединение, предназначенные для использования в целях получения фармацевтического состава, предназначенного для использования в соответствии с вышеописанным способом, представленном в пункте б).

В соответствии с еще одним вариантом воплощения настоящего изобретения, предусмотренные настоящим изобретением соединения могут быть использованы в качестве дополнительных или вспомогательных средств в иного рода терапии, в том числе в терапии, использующей ингибиторы резорбции костей, например, в терапии остеопороза, особенно - в терапии, основанной на использовании кальция, кальцитонина, либо его аналога или производного, включая кальцитонин лосося, угря или человека, стероидные гормоны, в том числе эстроген, частичный агонист эстрогена или комбинацию эстроген-гестаген, бифосфонат, витамин D или его аналог, либо любую их комбинацию.

В том случае, если предусмотренные настоящим изобретением соединения применяют в сопровождении, например, в виде вспомогательного агента при терапии с использованием ингибитора резорбции костей, дозировки совместно применяемого указанного соединения безусловно должны варьировать в зависимости от типа используемого ингибирующего медикамента, в том числе от того, является ли он стероидом или кальцитонином, от условий, в которых он должен применяться, от того, имеет ли место лечебная или профилактическая терапия, от режима приема и т.д.

В соответствии с вышеупомянутым, настоящее изобретение предусматривает еще один аспект:
г) способ улучшения образования костей, в том числе предупреждения или лечения потери кальция, например, для предупреждения или лечения любых специфических вышеперечисленных состояний или заболеваний у пациента, нуждающегося в такого рода лечении, причем указанный способ предусматривает применение вышеупомянутому больному эффективного количества
а) предусмотренного настоящим изобретением соединения и
б) вторичного медикаментозного агента, причем указанный вторичный медикаментозный агент представляет собой ингибитор резорбции костей, например, как описано выше. Предпочтительными являются соединения из примеров 20, 29, 37, 49 и 50.

Перечень последовательностей приведен в конце текста.

Список литературы
1. U.S.P.Т.О. publication, Trademark Official Gazette, May 15, 1990, p. 33, at 46.

2. Protective Groups in Organic Synthesis. T.W. Greene, J.Wiley & Sons, NY (1981), 219-287.

3. The Peptides, 3 (1981), E. Gross and J. Meienhofer (Ed.).

4. Stewart J. M. , Protection of Hydroxy Groups. In "The Peptides", 3 (1981). E. Gross and J. Meienhofer (Ed.)., 169-201.

5. Roeske R.W., Carboxy Protecting Groups, In "The Peptides", 3 (1981), E. Gross and J. Meienhofer (Ed.)., 101-135.

6. Hiskey R. G. , Sulfhydryl Group Protection, In "The Peptides", 3 (1981), E. Gross and J. Meienhofer (Ed.)., 137-167.

7. Gram H. and Ruger R., The EMBO Journal, 1985, 4, (1): 257-264.

8. Nardi et al., Applied and Environmental Microbiology, 1991, 57: 45-50.

9. International Journal of Peptide and Protein Research. 1985, 26: 262-273.

10. Tetrah. Letters, 1987, 28: 3787-3790.

11. Valle et al., Can. J. Chem., 1988, 66: 2575-2582.

12. Crisma et al., Int. J. Biol. Macromol., 1989, 11: 345-352.

13. Evans et al., Org. Synth., 1990, 68.

15. S.-O. Lawesson et al., Tetrahedron, 1981, 37: 3635.

16. F.S. Guziec et al., THL, 1990, 23-26.

17. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1991.

18. Studier et al. , Use of T7 RNA Polymerase to direct Expression of Cloned Genes, Methods of Enzymology, Academic Press, 1990: 60-89.

19. Nardi et al., App. Env. Microbiol., 1991, 57, N 1: 45-50.

20. Endocrinology, 1969, 85: 801-810.

21. Feyen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, 187: 8-13.

Формула изобретения

1. Соединение, выбранное из группы, включающей
[Leu⁸,Gln¹⁸,Thr³³,Ala³⁴]hPTH(1-34)OH,
[Leu⁸,Ala¹⁶,Gln¹⁸,Ala¹⁹,Thr³³,Ala³⁴]hPTH(1-34)OH,
[Leu⁸,Ala¹⁶,Gln¹⁸,Thr³³,Ala³⁴]hPTH(1-34)OH,
[Leu⁸,Asp¹⁰,Lys¹¹,Gln¹⁸]hPTH(1-36)OH,
[Leu⁸,Asp¹⁰,Lys¹¹,Gln¹⁸,Thr³³,Ala³⁴]hPTH(1-34)OH,
[Leu⁸,Asp¹⁰,Lys¹¹,Ala¹⁶,Gln¹⁸,Ala¹⁹]hPTH(1-36)OH,
[Leu⁸,Asp¹⁰,Lys¹¹,Ala¹⁶,Gln¹⁸,Thr³³,Ala³⁴]hPTH(1-34)OH,
[Leu⁸,Asp¹⁰,Lys¹¹,Ala¹⁶,Gln¹⁸]hPTH(1-36)OH and
[Leu⁸,Ala¹⁶,Gln¹⁸,Ala¹⁹]hPTH(1-36)OH.

2. Фрагмент ДНК, кодирующий слитый белок, имеющий нуклеотидную последовательность, соответствующую N-концевому полипептиду, кодируемому геном 55 бактериофага Т4, и присоединенному к его С-концу соединению по п.1.

3. Слитый белок, представляющий собой N-концевой полипептид, кодируемый геном 55 бактериофага Т4, и присоединенное к его С-концу соединение по п.1, и при необходимости расположенный между ними химически расщепляемый линкер.

4. Белок по п.3, в котором линкер имеет следующую аминокислотную последовательность: Asp-Pro-Pro или Asn-Gly-Pro.

5. Способ получения соединения по п.1, заключающийся в том, что культивируют рекомбинантный штамм E.coli, трансформированный вектором экспрессии, содержащим фрагмент ДНК по п.2, выделяют частицы включений, растворяют их в кислотных условиях, расщепляют, отделяют и очищают целевое соединение.

6. Фармацевтическая композиция, регулирующая метаболизм кальция, содержащая активный ингредиент и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента она содержит эффективное количество соединения по п.1.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8