Способ получения гетерологических иммуноглобулинов против вирусных инфекций марбург и эбола

 

Изобретение относится к медицине и касается технологии получения препаратов для профилактики и лечения геморрагических лихорадок Марбург и Эбола. Сущность изобретения состоит в том, что иммунизацию животных-продуцентов вирусными антигенами, приготовленными из органов инфицированных животных (овец, коз), периодический забор крови у животных-продуцентов при достижении активности индекса нейтрализации 2,0 lg и более в реакции биологической нейтрализации на лабораторных животных при инфицировании животных-продуцентов вирусом Марбург и активности индекса нейтрализации 2,75 lg и более при инфицировании животных-продуцентов вирусом Эбола. Из сыворотки крови фракции глобулина получают спиртовым осаждением при отрицательных температурах с последующей очисткой глобулинов. Полученный препарат обладает низкой реактогенностью, апирогенен, не вызывает иммуностимуляции и иммунодепрессии. 6 табл.

Изобретение относится к медицине и касается технологии получения препаратов для профилактики и лечения геморрагических лихорадок Марбург и Эбола.

В настоящее время нет средств специфической профилактики и лечения данных заболеваний, относящихся к особо опасным инфекциям. В научно-технической и патентной литературе также не описаны способы получения препаратов на основе иммуноглобулинов против вирусов Марбург и Эбола.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ получения иммуноглобулина включающий иммунизацию животных-продуцентов вирусными антигенами, периодический забор крови у этих животных с последующим выделением сыворотки крови, а также спиртовое осаждение фракции глобулинов и последующую ее очистку на холоде.

Однако, полученный иммуноглобулин не имеет специфических антител к вирусам Марбург и Эбола.

Задачей предлагаемого технического решения является получение гетерологичного лечебно-профилактического иммуноглобулина с высоким индексом нейтрализации за счет использования исходной сыворотки крови коз и овец, инфицированных вирусом Марбург или Эбола.

Поставленная задача решается тем, что способ включает иммунизацию животных продуцентов антигенами вируса Марбург или Эбола, приготовленными из органов инфицированных морских свинок. В качестве животных-продуцентов используют овец или коз. Забор крови у животных-продуцентов осуществляют при достижении активности индекса нейтрализации 2,0 lg и более в реакции биологической нейтрализации на подопытных животных при инфицировании вирусом Марбург и активности индекса нейтрализации 2,75 lg и более при инфицировании вирусом Эбола. Далее из полученной сыворотки крови спиртовым осаждением выделяют фракции глобулинов с последующей их очисткой.

Новыми по сравнению с прототипом являются следующие признаки способа. В качестве животных-продуцентов используют овец или коз, а забор крови у этих животных осуществляют при достижении активности индекса нейтрализации 2,0 lg и более в реакции биологической нейтрализации на подопытных животных при инфицировании вирусом Марбург и активности индекса нейтрализации 2,75 lg и более при инфицировании вирусом Эбола.

Свойства новых признаков способа заключаются в обеспечении возможности специфической профилактики и лечения геморрагических лихорадок Марбург и Эбола за счет получения гетероличного иммуноглобулина с высоким индексом нейтрализации.

Способ получения иммуноглобулинов осуществляют следующим образом.

Пример 1. Для получения иммунной сыворотки крови животных-продуцентов (овец, коз) иммунизируют антигенами вируса Марбург или Эбола, приготовленными из органов инфицированных морских свинок. Забор крови у животных-продуцентов осуществляют при достижении активности индекса нейтрализации 2,0 lg и более в реакции биологической нейтрализации на подопытных животных при инфицировании вирусом Марбург и активности индекса нейтрализации 2,75 lg и более при инфицировании вирусом Эбола. Далее полученную иммунную козью или овечью сыворотку объемом 1,7-1,9 дм³ осветляют центрифугированием 5000 об/мин в течение 15 минут. Содержание белка 150 г. фибрин и фибриноген осаждают 96% -ным этиловым спиртом из расчета 0,09 дм³ на 1 дм³ иммунной сыворотки. Смесь отстаивают 1 ч и центрифугируют при 5000 об/мин 15 мин. Осадок выбрасывают, а центрифугат (2,0 0,08)дм³ используют для осаждения глобулинов. В центрифугат добавляют 96%-ный этиловый спирт, охлажденный до температуры -10^oC из расчета 0,320 дм³ на 1 дм³ центрифугата. Смесь выдерживают (2,0 $E+->0,1) ч для формирования осадка и затем центрифугируют 10 мин при 5000 об/мин. Масса осадка составляет (25) г. Данный осадок растворяют в фосфатном буфере из расчета 2 дм² на 1 кг влажного осадка глобулинов. Водородный показатель смеси доводят до (5,2 5,3) pH введением 24М ацетатного буфера. Смесь осаждают вращением при 5000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант объемом (1,950,5)дм³ содержит гаммаглобулиновую фракцию с примесью бетаглобулинов. В качестве отходов получают (0,20 0,03)кг бетаглобулинов и агрегатов гаммаглобулина (осадок N1). Примесь бетаглобулинов из супернатанта удалят осаждением 265%-ным этанолом, а осадок N1 используются для дополнительного извлечения гаммаглобулинов уже описанным способом. К раствору гаммаглобулинов, доведенного до (7,2 7,3) pH 1М раствором бикарбоната натрия, добавляют 96% -ный этиловый спирт из расчета 0,19 дм³ на 1 дм³ раствора. Осадок гаммаглобулинов отделяют центрифугированием, подсушивают ватно-марлевой салфеткой. Масса белого студенистого осадка (204) г. Полученный осадок идет на приготовление (121)% готового раствора гаммоглобулина объемом 335 340 дм³, который используют для лечения и профилактики против заболеваний вирусами Марбург и Эбола.

Результаты исследований по излучению свойств полученных препаратов иммуноглобулина представлены в табл.1.

Из табл. 1 видно, что препараты нетоксичны, обладают высокой удельной активностью и низкой реактогенностью.

Пример 2. Для обоснования количественных признаков формулы изобретения приведены зависимости уровня нейтрализующей активности препаратов иммуноглобулинов от титров вируснейтрализующих антител в сыворотке крови животных-продуцентов (овец, коз) в реакции биологической нейтрализации на морских свинках.

Анализ табл. 1, 2 показывает, что при повышении удельной активности исходной иммунной сыворотки, оцениваемой по логарифму индекса нейтрализации, возрастает общее количество готового препарата гаммаглобулина. Иммунная сыворотка должна иметь индекс нейтрализации не менее 100 (2,0 lg ЛД₅₀ /см³ для морских свинок) против вируса Марбург и не менее 500 (2,75 lg ЛД⁵⁰/си³) против вируса Эбола. При снижении индекса нейтрализации менее 2 lg ЛД₅₀/см³ иммунной сыворотки против вируса Марбург и снижении индекса нейтрализации менее 2,75 lg ЛД₅₀/см³ иммунной сыворотки против вируса Эбола значительно возрастают затраты на получение препарата специфического иммуноглобулина, что экономически не целесообразно при промышленном использовании способа.

Пример 3. Для выбора оптимальной схемы применения иммуноглобулина при лечении болезней Марбург и Эбола проведены эксперименты по излучению влияния сроков и кратности введения препарата. Результаты представлены в табл. 4 и 5.

На основании полученных данных (табл. 4,5) можно сделать вывод, что предлагаемые препараты наиболее эффективны при введении в течение 24 ч с момента заражения указанными вирусами. Причем достаточно однократного введения гаммаглобулина.

Пример 4. В целях изучения эффективности препарата, как средства профилактики против вирусов Эбола и Марбург его вводят морским свинкам до заражения за 24, 48, 72 ч. Полученные данные представлены в табл. 6.

Из табл. 6 видно, что наибольший профилактический эффект иммуноглобулина при введении его животным до их заражения наблюдается в первые 24 ч.

Испытание на добровольцах (26 человек опытная группа и 6 человек в качестве отрицательного контроля) показало, что предлагаемый препарат обладает низкой реактогенностью, апирогенен, не вызывает иммуностимуляции и иммунодепресии. Анализ проб сывороток крови добровольцев в твердофазном иммуноферментном анализе показал, что наиболее высокие титры козьего гаммаглобулина наблюдаются в течение первых трех суток с момента введения. На 7-е сутки титры снижаются в среднем в 2 раза. На 14-е сутки с момента введения иммуноглобулина титры снижаются в 3-4 раза, а на 21-е сутки гетерологичный гаммаглобулин обнаруживается в крови добровольцев на уровне следов.

Формула изобретения

Способ получения гетерологических иммуноглобулинов против вирусных инфекций Марбург и Эбола, включающий иммунизацию животных-продуцентов вирусными антигенами, приготовленными из органов инфицированных животных, периодический забор крови у животных- продуцентов с последующим выделением сыворотки, спиртовое осаждение фракции глобулинов из сыворотки крови при отрицательных температурах и последующую очистку глобулинов, отличающийся тем, что в качестве животных-продуцентов используют овец или коз, а забор крови у этих животных осуществляют при достижении активности индекса нейтрализации 2,0 lg и более в реакции биологической нейтрализации на лабораторных животных при инфицировании животных-продуцентов вирусом Марбург и активности индекса нейтрализации 2,75 lg и более при инфицировании животных-продуцентов вирусом Эбола.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3