Штамм бактерий klebsiella pneumoniae, используемый в качестве референс-штамма при определении интенсивности дыхания микроорганизмов

 

Использование: медицинская микробиология, референс-штамм, определение интенсивности дыхания, энтеробактерии. Сущность изобретения: штамм Klebsiella pneumoniae ГИСК N 216 обладает стабильной способностью к интенсивности дыхания, приобретая ярко-красное окрашивание колоний. Интенсивность дыхания штамма определяют путем посева бляшками на плотную питательную среду, содержащую конго-рот, последующих инкубаций при 37^oC в течение 18 - 24 ч и учета. Ярко-красное окрашивание бляшек и прилегающей зоны свидетельствует о наличии искомого признака. 4 пр. 3 табл.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано в качестве референс-штамма при определении интенсивности дыхания признака патогенности энтеробактерий, когда необходимо обоснование этиологоической значимости культур, выделенных от больных ОКИ, здоровых лиц и объектов окружающей среды.

Отечественных аналогов не зарегистрировано. Штамм К. выделен из клинического материала больного диареей, депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им.Л.А.Тарасевича за N 216.

Свойства штамма К. pneumoniae 216 Морфологические признаки. Грамотрицательные короткие палочки, неподвижные, жгутиков и спор не образуют. При окраске в тушевом препарате по Бурри установлена продукция капсулы, размер которой составляет 1,0 1,5 диаметра бактериальной клетки.

Электронно-микроскопические данные: палочки с закругленными концами. Размер клетки мкм: длина 1,6 0,17 мкм при ш 95% ширина 1,02 0,04 мкм при ш 95% Культуральные признаки: на мясопептонном бульоне через 3 часа при 37^oС наступает легкое помутнение среды, через 16 18 ч помутнение с легкой пленкой. На плотных питательных средах через 16 18 ч при 37^oC образует колонии, которые выглядят следующим образом: на среде Эндо: колонии бледно-розового цвета с более яркой окраской в центре, с легким серо-металлическим блеском, маслянистые, куполообразные с ровными краями; диаметр 2,0 2,5 мм. Признаков диссоциации нет.

на среде К₂: колонии светло-желтого цвета с яркой точкой в центре, куполообразные с ровными краями, маслянистые; диаметр колоний 1,5 2,0 мм. Признаков диссоциации нет.

на мясо-пептонном агаре: колонии светло-молочного цвета, полупрозрачные, с ровными краями, маслянистые, диаметр 1,0 1,5 мм. Признаков диссоциации нет.

Физиолого-биохимические признаки: оптимум роста 37,0 0,5^oC, оптимум рН среды 7,0 7,2. Оптимальные условия аэробные. Активно расщепляет глюкозу и глицерин с образованием кислоты и газа, а также маннит, сахарозу, мальтозу, арабинозу, адонит, инозит, дульцит, ксилозу, сорбит, рамнозу. Декарбоксилирует лизин, утилизирует малонат натрия и цитрат Козара, а также Симонса, обладает уразной активностью, дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, т.е. ферментирует глюкозу с образованием ацетилметилкарбинола (ацетоина). Не ферментирует лактозу, не образует сероводород и индол, в реакции метил-рот отрицательна. Орнитиндекарбоксилаза, аргининдегидролаза и фенилаланиндезаминаза отсутствуют. Штамм неподвижен.

Антигенная структура штамма: при серотипировании набором сывороток ЦНИИВиС им.Мечникова не установлена.

Чувствительность к антибактериальным препаратам. Исследованиями методом серийных разведений установлена чувствительность к следующим препаратам: гентамицину (2,5 мкг/мл), сизамицину (1,0 мкг/мл), кефзолу (5,0 мкг/мл), клафорану (25 мкг/мл), доксициклину (30 мкг/мл) полимиксину В (2,5 мкг/мл), налидиксовой кислоте (10,0 мкг/мл), триметоприму (25 мкг/мл), фуразолидону (10 мкг/мл), броксиквинолину (2,5 мкг/мл). Устойчив к бензилпенициллину (10 мкг/мл), ампициллину (1,5 мкг/мл), ампиоксу (1,5 мкг/мл), канамицину (5 мкг/мл), хлорамфениколу (5 мкг/мл), тетрациклину (5 мкг/мл) и рифампицину (10 мкг/мл).

Биологические свойства. Штамм обладает способностью приобретать ярко-красную окраску на среде, содержащей конго-рот. Интенсивность дыхания определяют по степени окрашивания бляшек и отдельных колоний на плотной питательной среде. Оценка по четырехкрестной системе учета результатов (четыре креста).

Вирулентные свойства: Д₅₀ для белых мышей 1,0 10⁹ м.т.

Штамм используют следующим образом: Пример 1. Суточную культуру штамма К. pneumoniae-216 засевают на плотную питательную среду, с углеродной основой бляшками, штрихом или методом истощения петли для получения изолированных колоний.

Состав среды, в г: агар 2,0 NaCl 0,4 MgSO₄ 0,02 K₂SO₄ 0,02 KH₂PO₂ 0,2
Na₂HPO₄ 0,2
Сахароза 5,0
Глюкоза 0,1
Конго-рот 0,01
Мочевина 0,1
Вода дистиллированная до 100 мл.

Способ приготовления среды: навески NaCl, MgSO₄, K₂SO₄, KH₂PO₄, Na₂HPO₄, сахарозы, глюкозы растворяют в 50 мл дистиллированной воды, подогревают, вносят 2 г агара и после полного растворения объем доводят дистиллированной водой до 100 мл. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Перед использованием среду расплавляют на водяной бане, охлаждают до 50^oC, асептично добавляют 1 мл 1% водного раствора конго-рот и 0,2 мл 50% водного раствора мочевины (растворы конго-рот и мочевины самостерилизующиеся). Среду разливают в чашки с толщиной слоя 2-3 мм.

После посева чашки инкубируют при 37 0,5^oC в течение 18 20 ч. Результаты исследований штамма К. pneumoniae-216 показывают следующее:
бляшки имеют ярко-красное окрашивание по всей поверхности и зоны 1-2 мм вокpуг бляшки. Интенсивность дыхания ;
штрихи имеют ярко-красное окрашивание всей поверхности и прилегающей зоне 1-2 мм, что соответствует интенсивности дыханий на ;
отдельные колонии имеют ярко-красное окрашивание с бордовым центром, что соответствует интенсивности дыхания на .

Пример 2. Культивирование штамма проводят на плотной питательной среде с белковой основой. К 100 мл 2% мясопептонного агара, содержащего 0,8 0,9% аминного азота (рН 7,2 7,4) асептично добавляют 1 мл 1% водного раствора конго-рот, разливают в чашки толщиной слоя 2 3 мм. Далее исследования выполняют как описано в примере 1.

Учет результатов показывает следующее:
бляшки засеянного штамма К. pneumoniae-216 имеют ярко-красное окрашивание по всей поверхности и зоны 1 2 мм вокруг бляшки, интенсивность дыхания - ;
штрихи имеют ярко-красное окрашивание всей поверхности и прилегающей зоне 1 2 мм, интенсивность дыхания ;
изолированные колонии ярко-красного цвета с бордовым центром, интенсивность дыхания .

Пример 3. Сравнительное изучение интенсивности дыхания штамма К.pneumoniae-216 проводят одновременно со штаммами других видов энтеробактерий параллельно на 2-х питательных средах, описанных в примерах 1 и 2.

Результаты сопоставления представлены в табл. 1 и 2.

Данные, представленные в табл. 1 и 2, свидетельствуют о следующем:
1. Питательная среда с углеводной основой наиболее благоприятна для выявления интенсивности дыхания у клебсиелл и не позволяет в полной мере выявлять этот признак у других видов энтеробактерий.

2. Питательная среда с белковой основой менее благоприятна для выявления интенсивности дыхания у клебсиелл и способствует максимальному выявлению этого признака у других видов энтеробактерий.

3. Штамм К pneumoniae-216 обладают способностью к стабильной интенсивности дыхания как на среде с белковой, так и углеводной основах, поэтому может быть использован в качестве референс-штамма при определении искомого признака у любых видов энтеробактерий.

Пример 4. Изучение способности штамма К.pneumoniae-216 стабильно приобретать ярко-красную окраску, свидетельствующую об интенсивном дыхании, проводят следующим образом:
штамм хранят на полужидком голодном агаре под слоем вазелинового масла при 4^oC и лиофильно высушенный. Через каждые 6 мес. подвергают исследованию как описано в примере 1.

Данные, представленные в табл. 3 свидетельствуют о том, что штамм К. pneumoniae-216 не утратил свойства к интенсивному дыханию при различных условиях хранения в течение 3-х лет.

Штамм К. pneumoniae-216 обладает стабильной способностью к интенсивному дыханию, приобретая ярко-красное окрашивание колоний и бляшек на питательной среде, и может быть использован в качестве референс-штамма при изучении вышеуказанного признака у штаммов, выделенных от больных, здоровых лиц, объектов окружающей среды и других источников, когда необходима дифференциация патогенных и непатогенных штаммов.

Формула изобретения

Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae ГИСК-216, используемый в качестве референс-штамма при определении интенсивности дыхания микроорганизмов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2